Summary
שיטה מהירה להשיג leukocytes חדירה מהמוח Murine מתואר. שיטה זו מנצלת שיפוע Percoll רציפה שיפוע Ficoll רציפה כדי לבחור ולטהר את שכבת ליקוציט מועשר. Leukocytes מבודד ואז עלול להיות מאופיין על ידי מדידות זרימת cytometric.
Abstract
אנו מתארים שיטה להכנת leukocytes המוח הסתננות (BILs) מעכברים. אנו מדגימים כיצד להדביק עכברים עם Encephalomyelitis Murine Theiler של הנגיף (TMEV) באמצעות טכניקת ההזרקה מהירה תוך גולגולתי ואיך לטהר אוכלוסייה ליקוציט מועשר של תאים שחדרו מן המוח כולו. בקצרה, בעכברים מורדמים עם isoflurane בתא סגור חופשיים יד מוזרק בעזרת מזרק המילטון לתוך קליפת המוח הקדמית. עכברים נהרגים אז לאחר ההדבקה באמצעות מנת יתר isoflurane והמוח כולו בזמנים שונים המחולצים, ומעורים ב RPMI עם מטחנת רקמה Tenbroeck. Homogenates המוח הם centrifuged דרך שיפוע Percoll רציפה של 30% כדי להסיר את פסולת התא המיאלין אחרים. ההשעיה התא הוא מתוח אז 40 מיקרומטר, שטף centrifuged על שיפוע רציפה פלוס Ficoll-Paque לבחור ולטהר את לויקוציטים. Leukocytes נשטפים אז resuspended ב buffers מתאים immunophenotyping ידי cytometry הזרימה. Cytometry זרימה מגלה אוכלוסייה של תאים חיסוניים מולדים בשלבים המוקדמים של דלקת בעכברים C57BL / 6. ב 24 שעות שלאחר זיהום, תת מרובות של תאים חיסוניים נמצאים BILs, עם האוכלוסייה העשירה של Gr1 + + ו CD11b F4/80 + תאים. לכן, שיטה זו שימושית המאפיינת את התגובה החיסונית דלקת חדה במוח.
Protocol
1. וירוס הזרקה תוך גולגולתי:
הטכניקה הבאה שונתה והוא מנוצל באופן נרחב על ידי המעבדה שלנו ועמיתיו. בקצרה, הזרקה תוך גולגולתי של המתח של דניאל של Encephalomyelitis Murine Theiler של הנגיף (TMEV) או העמדת פנים, זיהום (1, 10) מתבצע על עכברים צעירים (רצוי 5-6 שבועות של גיל) כדי לעורר leukocytes המוח הסתננות (BILs). שים לב כי התוצאות יהיו שונות בין המתח של דניאל, זן שעועית, והמתח GDVII. לצורך קצירת BILs, עכברים לקבל 2x10 5 PFU של TMEV ו נגועים למשך 24 שעות.
- צרף את מחט הזריקה (27 מד, ¼ ב, Kendall), כדי מזרק אוטומטי המילטון 1 מ"ל ולהגדיר לספק 10 μl של הנגיף.
- צייר את TMEV ב 10 DMEM μL לתוך המזרק עם תשומת לב קפדנית בועות אוויר. כאשר מתאים, עכברים דמה נגוע לקבל 10 μl של מווירוסים DMEM.
- רק לפני הזריקה, לשפוך כ 1 מ"ל של isoflurane לצנצנת פעמון המכיל רשת חוטי כותנה עם המצע שמתחת.
- עכברים מקום direclty על רשת תיל בצנצנת בפעמון עד שהם הופכים הרדים בקלילות, רגישות לצבוט-הבוהן משותקת על ידי נשימתית הרדמה, כ 10-15 שניות. עכברים לא צריך לבוא במגע ישיר עם isoflurane, כחומר יכול להיות מעצבן מאכל.
- בעוד תחת הרדמה, להכין עכברים להזרקה על ידי במהירות באיתור הקואורדינטות המתאימות באזור קליפת המוח הקדמית על הגולגולת באמצעות גילוח דיות. המיקום הכללי להזרקה הוא 1 מ"מ הקדמי כדי גבחת ו 1 מ"מ לרוחב תפר sagittal בצד ימין (איור 1). בעוד זריקה stereotactic עשוי להתאים כמה מצבים ניסיוני, מצאנו כי יד חופשית הזרקה ללא גילוח או דיות מתאים רוב הניסויים. קריעת פרווה עם נקודת מחט לאורך צירים גם מתאים ההזרקה.
- כדי לעשות זריקה, המזרח בניצב מחט לגולגולת ולחץ דרך העצם עד לעומק של כ 3 מ"מ.
- אקספרס וירוס לתוך המוח ידי לחיצה על כפתור מזרק המילטון למטה מחכים 2 שניות הנגיף להזין את המוח לפני נסיגה.
- מוציאים בזהירות את המחט במקום עכבר בכלוב, נקי ויבש. עכברים להתעורר מן ההרדמה במהירות ולהמשיך לתפקד נורמלי בתוך דקות. תנו תשומת לב ראויה עכברים סימפטומים חריגים, כגון דימום יתר מאתר ההזרקה, כמו המתת חסד של בעלי החיים עשויים להיות מתאימים. טיפול בבעלי חיים פרופר 6 ודבקות המכונים הלאומיים לבריאות טיפוח בעלי חיים מוסדיים ועדת הנחיות שימוש חייב להיות אחריו.
2. Brain-הסתננות הכנה תא ליקוציט:
- הכן מסביב לתחתית באוקרידג' צנטריפוגות צינורות אשר יכול להכיל קיבולת של 30 מ"ל עם 10 מ"ל RPMI 1640, 9 Percoll מ"ל ו 1 מ"ל PBS 10X וצינורות צריך לשבת על הספסל RT במהלך תהליך הסרת המוח.
- תביאו Ficoll-Paque פלוס לטמפרטורת החדר (RT).
- להרדים בעלי חיים על ידי יתר isoflurane שונה 5 במהירות להסיר את המוח באמצעות נירוסטה רקמות מרית ומכניסים צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל RPMI על הקרח. בנסיבות מסוימות, PBS-זלוף עשוי להיות מתאים כדי להסיר את התאים במחזור הדם ההיקפית של הכנת BILs. עכברים צריך להיות מלא כראוי הרדים לפני זלוף-PBS.
- העברת המוח פתרון RPMI ל 7 מ"ל מטחנת זכוכית פיירקס Tenbroeck רקמות המותג homogenize בעדינות עם 10-15 ושבץ.
- Pipet נוסף 5 מ"ל RPMI לתוך homogenizer ו pipet למעלה ולמטה פעמיים. העברת המוח homogenate (בערך 10 מ"ל) ל צינור עגול התחתונה הכין בעבר בעדינות להפוך 2-3 פעמים כדי לערבב.
- ספין homogenate המוח בבית 7800g שד 'למשך 30 דקות ב RT ב הרוטור קבוע זווית F0360 ב צנטריפוגה אלגרה X-22R Beckman קליניים.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר שאריות המיאלין אשר צפו לחלק העליון של השיפוע. איסוף שכבת ליקוציט שצף מעל תא דם אדום גלולה (איור 2).
- מסננים שכבת ליקוציט דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך 50 מ"ל חרוטי. תביאו פתרון עד נפח 50 מ"ל עם RMPI.
- צינורות ספין המכיל ההשעיה תא בדילול בצנטריפוגה קליני ב 1500 סל"ד (600g Ave) במשך 5 דקות ב RT.
- לשאוב supernatant לאסוף את התא גלולה. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל FACS חוצץ (1% שור אזיד סרום אלבומין, נתרן 0.02% סידן ומגנזיום ללא PBS) ולהעביר את ההשעיה תא עגול 5 מ"ל צינורות התחתונה FACS.
- בזהירות בבסיס ההשעיה עם פלוס 1 Ficoll-Paque מ"ל.
- ספין צינור ב 2500 סל"ד (1,400 נתן) בצנטריפוגה קליניים עבור 25 דק 'ב RT עם הבלם לא.
- הסרת שכבת לבנים, מוכי על הממשק (איור 2) עם פיפטה 1 מ"ל ולהעביר צינור חדש FACS 5 מ"ל. לשטוף גאמות עם חיץ 4 FACS מ"ל.
- ספין צינור ב 1500 סל"ד (600g Ave) במשך 5 דקות ב RT בצנטריפוגה קליניים בתאי גלולה.
- לשאוב supernatant ולאסוף תא גלולה. Resuspend גלולה ליקוציט במאגר המתאימים ולשמור על קרח בצינור FACS חדש.
- ספירת תאים, להעריך את כדאיות התא על ידי הרחקה Trypan כחול לנתח ידי cytometry הזרימה. באופן כללי, החוקרים יכולים לצפות לרכוש כ 5 x 10 5 תאים / החי.
3. תזרים cytometric immunophenotyping
- לאחר בידוד ספירת לויקוציטים, לסובב את התאים במשך 3 דקות על 1500 סל"ד (600 נתן) בצנטריפוגה קליני.
- Resuspend גלולה בחסימת למאגר המכיל את הפעולות הבאות: חיץ FACS, supernatant מ 2.4G2 hybridoma (FC לחסום; anti-CD16/32) ו בסרום שור העובר ביחס של 10:05:01 ו דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C .
- הכן ולהוסיף נוגדנים כנגד אנטיגנים מצומדות תאיים על התאים חסומים בריכוז של 1:200 ו דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך. כתם דגירה תאים μl 200 בצלחת V-96-התחתונה היטב. בקרות מתאימות כוללות תאים בלא כתם דגימות פיצוי fluorochrome, לפי הצורך.
- ספין התאים מוכתם ב RT במשך 3 דקות על 1500 סל"ד (600 נתן) בצנטריפוגה קליני באמצעות המתאים הרוטור עבור 96-גם הצלחות.
- לשאוב supernatant לשטוף את התאים עם FACS חיץ 200 μl ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 3 פעמים.
- חזור על טכניקה כביסה מעל פעמיים.
- לאחר כביסה, resuspend התאים paraformaldehyde 2% ולהעביר צינורות FACS. קיבוע נדרש ניתוח תזרים cytometric של תאים נגועים של biosafety 2 ריאגנטים רמה.
- הפעל את התאים קבוע על FACS BD Calibur הבא שיטה שונה תזרים cytometry 8 ולנתח את הקבצים הלא מקוונים באמצעות FlowJo, WinMDI או cytometry אחרים הזמינים תזרים תוכנת ניתוח.
- ניתוח של אירועים 50-100,000 לדגימה נדרש בדרך כלל עבור immunophenotyping הולם.
נוגדנים מצומדות ישירות השתמשו בניסוי זה:
CD45 זוהה עם שיבוט 30-F11. Ly6C / G זוהה עם Gr1 שיבוט, RB6-8C5. CD11b זוהה עם שיבוט M1/70. F4/80 זוהה עם שיבוט BM8.
4. נציג תוצאות:
אנחנו מראים phenotyping תא תוצאות BILs העכבר על זיהום 24 שעות שלאחר (איור 3). Leukocytes הוכתמו עכבר אנטי PerCP מצומדות-CD45 לזהות תאים חיסוניים, PE-מצומדות אנטי עכבר Ly6C / G לזהות מונוציטים דלקתיות, APC-מצומדות אנטי עכבר CD11b ו-APC מצומדות אנטי עכבר F4/80 כדי לזהות תאים השושלת מונוציטים. הניתוח בוצע באמצעות מכשיר FACS Calibur BD.
באיור 1. לוקליזציה האנטומי של הזריקה. ההזרקה ממוקם 1 מ"מ הקדמי כדי גבחת ו 1 מ"מ לרוחב תפר sagittal בצד ימין.
איור 2. Leukocytes איור של הפרדת צבע של לויקוציטים ו BILs. נאספים בתחילה ישירות מתחת לשכבת פסולת המיאלין ומעל גלולה RBC ב השיפוע Percoll. השכבה הלבנה, רכות (BILs) בממשק נאסף השיפוע Ficoll.
איור 3. Immunophenotype של המוח infilatrating leukocytes ב 24 שעות לאחר ההדבקה. Leukocytes עכבר בודדו מן המוח על ידי צנטריפוגה ההפרש צפיפות רקמת homogenates מוכן מחיות ב 24 שעות לאחר ההדבקה תוך גולגולתי. תאים הוכתמו נוגדנים fluorescently-מצומדות נגד עכבר CD45, Ly6C / G, CD11b ו F4/80. Gating ראשוני בוצע על ידי התוויית CD45, סמן תאים חיסוניים, נגד פיזור קדימה (FSC), אינדיקטור של גודל התא (C). היי CD45 (A, D), CD45 lo (B, E), ו CD45 נג (F, G) אוכלוסיות נותחו לאחר מכן על רמות הביטוי היחסי של סמנים מונוציטים ו macrophage Ly6C / G, F4/80 (A, B , ו), ו CD11b (D, E, G). Ly6C / G + + F4/80 CD11b + מונוציטים דלקתיות נמצאו כמעט אך ורק באוכלוסיה היי CD45 (A, D), עולה בקנה אחד עם חדירה של תאים אלה מהפריפריה. לעומת זאת, Ly6C/G-F4/80 lo CD11b מקרופאגים + נמצאו כמעט אך ורק CD45 lo (B, E) CD45 נג (G) אוכלוסיות, עולה בקנה אחד עם פנוטיפ תושב. בניסויים רבים, מעולם לא נצפתה CD45 בתאי היי או Ly6C / G + + F4/80 CD11b + מונוציטים דלקתית במוח של נגוע או זיוף-infecטד עכברים (מידע לא מוצג).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו משתמשים באופן שגרתי cytometry זרימה כדי לקבוע את איכות ההכנה שחדר המוח תא, להבדיל אוכלוסיות שונות של תאים חיסוניים 2, 9. בשלב נקודות חריפה, שיטה BILs שלנו תשואות באחוזים גבוהים של מונוציטים דלקתי בתוך האוכלוסייה CD45hi כמו גם באחוזים גבוהים של מקרופאגים באוכלוסייה CD45lo. זה מצביע על כך תגובה חיסונית לשחזור בתוך המוח יכול וחסונה להיות מאופיינת השיטה שלנו.
טכניקה זו היא בעלת חשיבות מיוחדת עבור ניסויים הדורשים האוכלוסייה מאופיינת היטב של תאים חיסוניים מהמוח העכבר. יש לנו ניסויים שבוצעו בעבר להעביר המאמצת ידי הזרקת המוח שלנו שחדר leukocytes לעכברים לארח באמצעות הזרקה לווריד הזנב 7, ויש לנו שאפיינה את BILs דרך שונים בניסויים במבחנה 9. הכנה BILs שלנו היא מועילה במיוחד בניסויים כי יש להבחין בין אוכלוסיות שונות של תאים חיסוניים מתאי תושב של המוח, כולל מקרופאגים תושב ו microglia. יישום נוסף של עניין כוללת בזמן אמת RT-PCR הניתוח מבוצע על סך RNA שבודד BILs על זיהום 7 ימים שלאחר לזהות פונקציות מפעיל 3. לדוגמה, מדדנו GAPDH, granzyme B ו perforin רנ"א BILs שנאספו זיהום 7 ימים הודעה מ-perforin המוסמכת מחסר בעלי חיים נגועים TMEV. יש לנו גם שיטה מנוצל BILs שלנו כדי לקבוע כיצד NKG2D תורם ניקוי TMEV מן המוח של עכברים נגועים בחריפות 4.
ישנם כמה היבטים קריטיים של השיטה. זה חיוני כדי להביא את כל הפתרונות לטמפרטורת החדר לפני ההכנה, כדי למנוע לחץ מיותר על leukocytes כדי להבטיח הפרדה נאותה densitometric. מתח על leukocytes תורמת מוות של תאים, מה שהופך אותם אמינים במיוחד בניסויים vivo שבו אוכלוסייה של תאים חיים מועבר לתוך adoptively פונדקאי מהחי. קבענו גם כי השימוש Percoll קר לא רק משנה את צפיפות שיפוע רציפה, אלא גם משפיע על איכות לויקוציטים. אלמנט נוסף הוא קריטי homogenization מספיק עדין של רקמת המוח. מצאנו כי homogenization מספקת גס של רקמת המוח תוצאות כמויות עצומות של פסולת התא נתפס על ידי מיקרוסקופיה cytometry הזרימה. פסולת נייד יכול גם לנבוע לא מאמץ את המוח עם מסננת homogenate תא בגודל מתאים. תשומת לב ראויה פרט הוא המפתח בהכנת BILs בשפע די לניסויים ניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NS64571 מן NINDS (CLH), על ידי בפרס פיתוח קריירה מוקדמת ממרפאת מאיו (CLH), ועל ידי מתנה נדיבה של דונלד פרנסיס Herdrich (CLH). ברצוננו להודות תזרים מרפאת מאיו Core cytometry לסיוע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalge Nunc international | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche Group | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder | Fisher Scientific | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Biosciences | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman Coulter Inc. | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter Inc. | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | eBioscience | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | eBioscience | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. B. rown, , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
- Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
