脑浸润白细胞的分离

Summary

一个快速的方法来获得从小鼠脑组织浸润的白细胞描述。这种方法利用了连续Percoll梯度和不连续的聚蔗糖梯度选择和净化白细胞富集层。然后可能会被隔离白细胞流式细胞仪测量的特点。

Abstract

我们描述了一个准备从老鼠的大脑浸润白细胞（BILs）的方法。我们演示了如何Theiler鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）通过一个快速的颅内注射技术和如何净化的全脑细胞浸润的白细胞富集人口感染小鼠。简单地说，小鼠是在一个封闭的腔异氟醚麻醉徒手与汉密尔顿注射器注入额叶皮层。然后被杀害后，小鼠感染的异氟醚过量和整个大脑中提取的RPMI匀浆与Tenbroeck组织磨床，在不同的时间。通过连续的30％Percoll梯度离心脑组织匀浆，以去除髓鞘和其他细胞碎片。细胞悬液，然后是紧张在40微米，洗净后，一个不连续的聚蔗糖 - 帕确加梯度离心选择和净化的白细胞。的白细胞，然后洗净，并在适当的缓冲区，通过流式细胞仪检测免疫重悬于。流式细胞仪检测显示人口先天免疫细胞的C57BL / 6小鼠在感染的早期阶段。多个亚群的免疫细胞在感染后24小时，目前，在BILs GR1 ^+，CD11b的⁺和F4/80 ⁺细胞的丰富人口。因此，这种方法是有用的表征在大脑中的急性感染的免疫反应。

Protocol

1。颅内病毒注射液：

下面的技术已被修改，并广泛利用我们的实验室和他的同事。简单地说，丹尼尔的应变Theiler鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）或假感染颅内注射（1，10）是年轻小鼠（最好5-6周龄）引起脑浸润白细胞（BILs）。请注意，结果会有所不同，丹尼尔的应变，豆株，GDVII应变之间。对于采伐BILs的目的，小鼠收到2X10 ^TMEV 5 PFU和感染24小时。

1. 将注射针头（27压力表，¼，肯德尔），1毫升汉密尔顿注射器自动设置提供10μL的病毒。
2. 绘制在10μL的DMEM培养液进入注射器小心注意气泡TMEV。在适当的时候，深水感染小鼠获得无病毒的DMEM 10μL。
3. 就在注射之前，倒入一个钟罩，包含棉花基板下方的线网格约1毫升的异氟醚。
4. direclty放置在钟罩上线电网的老鼠，直到他们变得轻轻麻醉，脚趾捏不敏感和吸入麻醉固定，约10-15秒。老鼠不应与异氟醚的直接接触，作为物质可刺激性和腐蚀性。
5. 虽然在麻醉状态下，准备通过快速定位在适当的坐标上使用剃须和墨的头骨额叶皮层区域的小鼠注射。注射的位置一般是1毫米，前囟和1毫米，横向到上矢状缝右侧（图1）。虽然立体定向注射可适当对一些实验的情况下，我们发现，徒手注射液是没有剃须或墨水适用于大多数实验。临别沿两个轴的进针点皮毛适当的注射。
6. 为了使注射，东方针垂直于骨的头骨，并通过按约3毫米的深度。
7. 快递按汉密尔顿注射器按钮并等待2秒钟，病毒进入大脑前撤回病毒进入大脑。
8. 小心取出针和鼠标放置在干净，干燥的笼。老鼠唤醒麻醉迅速，并在几分钟之内恢复正常功能。适当注意小鼠表现出异常的症状，如注射部位出血过多的动物实施安乐死，可能是适当的。必须遵循正确的动物处理和遵守的美国国立卫生机构动物护理和使用委员会的准则研究院。

2。脑浸润白细胞细胞制备：

1. 准备橡树岭圆底离心管中，其中可容纳10毫升的RPMI 1640毫升Percoll，9和1 ml 10X PBS和管应该坐在板凳上，在室温下在大脑切除过程中30毫升的容量。
2. 室温（RT），聚蔗糖帕确加。
3. 通过修改异氟醚过量⁵安乐死的动物，迅速 ​​取出大脑使用不锈钢组织锅铲和地方在15毫升锥形管含冰5毫升的RPMI 。在某些情况下，PBS灌注可适当删除循环BILs准备从外周血细胞。应充分和适当的麻醉前以PBS灌注小鼠。
4. 转移大脑和RPMI解决7毫升玻璃耐热品牌Tenbroeck组织磨床和10-15杆轻轻同质化。
5. 吸取到匀浆和吸管和向下两次额外的5毫升的RPMI。转让脑匀浆（约10毫升）先前准备的圆底管，轻轻颠倒2-3次混合。
6. 在F0360固定角度转子在贝克曼Allegra的X - 22R的临床离心机在室温为30分钟， _旋转 7800克大道的脑组织匀浆。
7. 离心后，去除浮动梯度顶部的髓鞘碎片。收集白细胞层以上的红血细胞沉淀（图2）浮。
8. 通过一个40微米的细胞过滤器的应变白细胞层到50毫升锥形。解决方案，以50毫升与RMPI量。
9. 旋转管含有稀释的细胞悬液，在室温下5分钟在1500转_（600克 AVE）的临床离心机。
10. 吸弃上清液，收集细胞沉淀。悬浮颗粒在1毫升流式细胞仪缓冲区（1％牛血清白蛋白，0.02％，钙的叠氮化钠和镁无PBS）和转移的细胞悬液5 ml圆底流式细胞仪管。
11. 小心地用1 ml聚蔗糖帕确加底图停牌。
12. 转速2500 RPM（1400了）在临床离心25分钟，在室温下没有刹车管。
13. 白色，蓬松层，用1毫升吸管和转移到新的5毫升流式细胞仪管的界面（图2）删除。洗净彗星英语学习者与4毫升流式细胞仪缓冲。
14. 临床离心沉淀细胞在室温5分钟旋转1500转（600克_AVE）管。
15. 吸上清，收集细胞沉淀。重悬在适当的缓冲液中白细胞颗粒，并保持在新的流式细胞仪管冰。
16. 计数细胞，通过台盼蓝拒评估细胞活力，流式细胞仪分析。在一般情况下，调查人员可以期望获得大约^{5 ×} 10 5细胞/动物。

3。送流式细胞免疫分型

1. 经过分离和计数白细胞，自旋为3分钟在1500转（600 _了 ），在临床离心机的细胞。
2. 重悬沉淀阻止缓冲区，其中包含以下：流式细胞仪的缓冲区，2.4G2杂交瘤细胞（FC块; anti-CD16/32）上清和胎儿比例的10时05分01秒的牛血清，孵育30分钟，在4 ° C 。
3. 准备和30分钟，在浓度为1:200，并培育，阻止细胞在4 ° C黑暗环境中添加共轭对细胞外抗原的抗体。 200μL的细胞染色法和细胞培养在96孔V型底板。适当的控制，包括未染色细胞和荧光补偿样本，作为必要的。
4. 转速1500 RPM在临床离心机转子适当使用96孔板（600 _了 ），在室温下3分钟的染色细胞。
5. 吸上清，洗与200μL的流式细胞仪缓冲细胞轻轻吹打向上和向下的3倍。
6. 重复两次以上的洗涤技术。
7. 洗涤后，重悬在2％多聚甲醛和流式细胞仪管转移到细胞。固定是需要流生物安全等级2试剂感染细胞的流式细胞仪分析。
8. 以下修改后的流式细胞仪检测方法⁸运行在BD流式细胞仪刀魂固定细胞和分析脱机使用FlowJo，WinMDI或其他可用的流式细胞仪分析软件的文件。
9. 50-100,000每个样品的事件分析，通常需要足够的免疫表型。

在这个实验中直接使用共轭抗体：

CD45的发现与克隆30 - F11。 Ly6C / G的检测与克隆GR1，RB6 - 8C5。 CD11b的发现与克隆M1/70。 F4/80的发现与克隆BM8。

4。代表性的成果：

我们细胞分型结果表明，在感染后24小时（图3）鼠标BILs。 PerCP标记的抗CD45的小鼠白细胞染色检测免疫细胞，PE标记的抗鼠Ly6C / G来检测检测细胞的炎症单核细胞，APC标记的抗鼠CD11b和APC标记的抗鼠F4/80单核细胞谱系。一个BD流式细胞刀魂仪进行分析。

图1。注射部位的解剖定位，注射部位位于前囟和1毫米，1毫米，横向上矢状缝右侧。

图2。最初是直接收集髓鞘碎片层以下和以上的红细胞在Percoll梯度颗粒梯度分离的白细胞和BILs插图。白细胞。白色，蓬松层接口（BILs）收集从聚蔗糖梯度。

图3。从大脑颅内感染后24小时，准备从动物组织匀浆差密度离心分离出脑infilatrating白细胞在24小时后感染小鼠白细胞的免疫表。与荧光标记的抗体对小鼠CD45的细胞染色，Ly6C / G，CD11b的，和F4/80。初始浇注策划CD45，免疫细胞的标志物，对前向散射（FSC），细胞大小的指标（三）执行。 CD45 ^您好 （A，D），CD45 ^{LO（B，E），}和CD45的^{NEG（F，G）}人口的单核细胞和巨噬细胞标记Ly6C F4/80 / G（A，B的相对表达水平分析，F）和CD11b（D，E，G）。 Ly6C / G ⁺ F4/80 ⁺细胞CD11b ^+，CD45您好人口（A，D），从外围这些细胞浸润炎症单核细胞中发现的几乎完全。相比之下，Ly6C/G-F4/80 ^LO细胞CD11b ⁺巨噬细胞几乎全部被发现在CD45的^{LO（B，E）}和CD45 ^阴性 （G）的人群，与居民的表型一致。在无数次的实验，我们从来没有观察到大脑未受感染或假^感染您好CD45的细胞或Ly6C / ^G + ^F4/80 +细胞^CD11b +炎症单核细胞特德小鼠（数据未显示）。

Discussion

我们经常使用流式细胞仪检测，以确定两者的大脑浸润细胞制备的质量，并区分不同人群的免疫^细胞2，9 。急性发作的时间点，我们BILs方法产生炎症单核细胞内CD45hi人口以及CD45lo人口中的巨噬细胞的高百分比的高比例。这表明，在大脑中重现的免疫反应，我们的方法可以有力特点。

这种技术是特别重要的实验，需要一个良好的特点，从小鼠大脑中的免疫细胞的人口。渗透到宿主小鼠经尾静脉注射⁷的白细胞注入了我们的大脑的，我们曾进行过继转移实验，我们已 ^在体外实验中9通过各种特点的BILs。我们的BILs准备，必须区分不同人群的居民的脑细胞，包括居民的巨噬细胞和小胶质细胞的免疫细胞的实验，特别是在有利的。利益的另一种应用，包括实时RT - PCR技术从BILs在感染后7天隔离^识别效应功能3的总RNA进行分析。例如，我们测量GAPDH的，颗粒酶B和穿孔RNA在感染后7天收集穿孔，主管和缺陷动物感染与TMEV BILs。我们还利用我们BILs的方法来确定如何NKG2D的结算TMEV从急性感染^小鼠 4的大脑。

的方法有几个重要方面。重要的是把所有的解决方案室温事先准备，以避免不必要的压力的白细胞，并确保适当的光密度分离。对白细胞的压力会导致细胞死亡，这使得它们尤其是不可靠的居住人口的细胞是过继转移到宿主动物体内实验。我们还决定，不仅改变使用冷Percoll不连续梯度密度，而且也影响白细胞的质量。另一个关键因素是足够的和温和的同质化脑组织。我们已经发现，在显微镜和流式细胞仪所看到的细胞碎片丰富的脑组织结果的不足和粗糙的同质化。细胞碎片也可能会导致不使劲用适当大小的细胞过滤器的脑组织匀浆。适当注重细节是，在进一步的实验和分析准备充分和足够的的BILs的关键。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TMEV	Howe Lab	N/A
Daniel’s strain	Invitrogen	21063-029
isoflurane	Novaplus	NDC 0409-3292-49
round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes	Nalge Nunc international	3118-0030
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Percoll	GE Healthcare	17-0891-02
10X PBS	Roche Group	11666789001
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Trypan Blue 0.4% (w/v)	Mediatech, Inc.	25-900-CI
15 ml conical tubes	BD Biosciences	352097
7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder	Fisher Scientific	08-414-10B
40 μm cell strainer	BD Biosciences	352340
50 mL conical	BD Biosciences	352070
bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647
sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
CMF-PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
FACS tubes	BD Biosciences	352054
fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F4135
2.4G2 hybridoma	ATCC	HB-197
Costar V-bottom plate	Corning	3894
Allegra X-22R centrifuge or equivalent	Beckman Coulter Inc.	N/A
96-well plate bucket and rotor	Beckman Coulter Inc.	S2096
Fixed-angle rotor	Beckman Coulter Inc.	F0360
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
BD FACS Calibur	BD Biosciences	N/A
FlowJo 7.5	Tree Star, Inc.	N/A
CD45	BD Biosciences	557235	clone: 30-F11
Gr1 (Ly6C/G)	BD Biosciences	553128	clone: RB6-8C5
CD11b	eBioscience	17-0112-83	clone: M1/70
F4/80	eBioscience	17-4801-82	clone: BM8