Summary
Um método rápido para a obtenção de leucócitos infiltrando a partir do cérebro de camundongos é descrito. Este método utiliza um gradiente de Percoll contínua e descontínua gradiente de Ficoll para selecionar e purificar a camada de leucócitos enriquecido. Leucócitos isolados podem então ser caracterizada por medidas de citometria de fluxo.
Abstract
Nós descrevemos um método para preparar leucócitos cérebro infiltrando (Bils) de camundongos. Demonstramos como para infectar ratos com encefalomielite murina de Theiler vírus (TMEV) através de uma técnica de injeção intracraniana e rápida como purificar uma população de leucócitos enriquecido de células infiltrando a partir do cérebro inteiro. Resumidamente, os ratos são anestesiados com isoflurano em uma câmara fechada e são free-hand injetado com uma seringa de Hamilton para o córtex frontal. Ratos são, então, matou em vários momentos após a infecção por overdose isoflurano e cérebros inteiros são extraídos e homogeneizados em RPMI com um moedor de tecido Tenbroeck. Homogeneizados de cérebro são centrifugação em um gradiente de Percoll contínua de 30% para remover os restos celulares de mielina e outros. A suspensão de células é então forçada a 40 mM, lavado e centrifugado em um descontínua gradiente de Ficoll-Paque Plus para selecionar e purificar os leucócitos. Os leucócitos são então lavadas e ressuspendidas em tampão apropriado para imunofenotipagem por citometria de fluxo. Citometria de fluxo revela uma população de células do sistema imunológico inato nas fases iniciais da infecção de camundongos C57BL / 6. Menos 24 horas após a infecção, subconjuntos múltiplas de células do sistema imunológico estão presentes no Bils, com uma população enriquecida de Gr1 +, CD11b + e + F4/80 células. Portanto, esse método é útil na caracterização da resposta imune à infecção aguda no cérebro.
Protocol
1. Injeção intracraniana de vírus:
A técnica a seguir foi modificada e utilizada extensivamente por nosso laboratório e colegas. Resumidamente, a injeção intracraniana da estirpe de Daniel de murino Theiler de encefalomielite vírus (TMEV) ou sham-infecção (1, 10) é realizada em ratos jovens (de preferência 5-6 semanas de idade) para obter leucócitos cérebro infiltrando (Bils). Por favor, note que os resultados diferem entre estirpe de Daniel, a cepa feijão e da estirpe GDVII. Para efeitos de colheita Bils, ratos receber 2x10 5 UFP de TMEV e são infectadas por 24 horas.
- Coloque a agulha de injeção (calibre 27, em ¼, Kendall), a uma seringa de 1 ml automática Hamilton e dê origem a 10 ml de vírus.
- Elaborar TMEV em 10 DMEM mL na seringa com muita atenção a bolhas de ar. Quando for o caso, os ratos sham infectado receber 10 ml de DMEM livre de vírus.
- Pouco antes da injeção, despeje cerca de 1 mL de isoflurano em uma redoma de vidro que contém uma grade de arame com substrato de algodão por baixo.
- Camundongos lugar direclty na grade de arame na redoma até que se tornem ligeiramente anestesiado, insensível aos pés pinch-e imobilizado pelos inalantes anestésico, cerca de 10-15 segundos. Camundongos não deve entrar em contato direto com isoflurano, como substância pode ser irritante e cáustico.
- Enquanto sob anestesia, prepare ratos para injeção através de uma rápida localização de coordenadas apropriado na região do córtex frontal no crânio usando barbear e tinta. A localização geral para injeção é de 1 mm anterior ao bregma e 1 mm lateral à sutura sagital do lado direito (Figura 1). Enquanto a injeção estereotáxica pode ser apropriado para algumas situações experimentais, descobrimos que a mão livre, sem injeção de barbear ou de tinta é adequado para a maioria dos experimentos. Parting a pele com a ponta da agulha ao longo de ambos os eixos é apropriado para injeção.
- Para tomar uma injecção, orientar a agulha perpendicular ao crânio e pressione através do osso para cerca de profundidade de 3 mm.
- Expressar vírus no cérebro, pressionando o botão seringa Hamilton para baixo e esperar 2 segundos para que o vírus entra no cérebro antes de retirar.
- Cuidadosamente retire a agulha e coloque o rato em uma gaiola, limpo e seco. Camundongos despertar da anestesia rapidamente e retomar o funcionamento normal em poucos minutos. Dar a devida atenção para os ratos que apresentam sintomas anormais, como sangramento excessivo no local da injecção, como a eutanásia do animal pode ser apropriado. Animal adequado manuseio 6 e adesão aos Institutos Nacionais de Saúde e Cuidados Animais Institucional e diretrizes Comitê Use devem ser seguidas.
2. Brain-infiltrando preparação celular de leucócitos:
- Prepare de fundo redondo de Oak Ridge do tubos de centrífuga que pode conter uma capacidade de 30 ml com 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll e 1 ml de PBS 10X e tubos deve sentar-se na RT no banco durante o processo de remoção do cérebro.
- Traga Ficoll-Paque Plus à temperatura ambiente (RT).
- Eutanásia de animais modificados por overdose isoflurano 5 e remover rapidamente o cérebro com uma espátula de tecidos de aço inoxidável e coloque em um tubo cônico de 15 ml contendo 5 ml RPMI no gelo. Em algumas circunstâncias, PBS-perfusão pode ser apropriado para remover células circulantes do sangue periférico de preparação Bils. Ratos deve ser plena e devidamente anestesiado antes da PBS-perfusão.
- Transferência cérebro e RPMI solução para um copo ml 7 Pyrex marca moedor tecido Tenbroeck e gentilmente homogeneizar com 10-15 derrames.
- Pipeta um adicional de 5 ml RPMI para o homogeneizador e pipeta cima e para baixo duas vezes. Homogenato cerebral transferência (aprox. 10 ml) previamente preparado para tubo de fundo redondo e inverter cuidadosamente 2-3 vezes para misturar.
- Spin-homogenato de cérebro de 7800g av por 30 min a RT em uma F0360 rotor de ângulo fixo em uma centrífuga Beckman Allegra X-22R clínico.
- Após a centrifugação, remover mielina detritos que flutuou para o topo do gradiente. Coletar a camada de leucócitos que flutua acima do pellet de glóbulos vermelhos (Figura 2).
- Strain camada de leucócitos através de um filtro de células 40 mM para a 50 ml. Levar a solução até 50 ml com RMPI.
- Tubos contendo girar suspensão diluída de células em uma centrífuga clínica a 1500 rpm (600g ave) por 5 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e recolha o pellet celular. Ressuspender o sedimento em 1 ml tampão FACS (1% albumina sérica bovina, azida sódica 0,02% em cálcio e magnésio livres PBS) e transferir a suspensão celular a 5 ml FACS rodada tubos de fundo.
- Cuidadosamente suspensão underlay com 1 ml Além disso Ficoll-Paque.
- Tubo giratório a 2500 rpm (1400 deu) em centrífuga clínica por 25 min à temperatura ambiente sem freio.
- Remover camada, branco macio na interface (Figura 2) com uma pipeta ml e transferir para o novo 5 ml tubo FACS. Lavar cells com 4 tampão FACS ml.
- Tubo giratório a 1500 rpm (600g ave) por 5 min à temperatura ambiente em centrífuga clínica para as células da pelota.
- Aspirar o sobrenadante e recolher pellet celular. Ressuspender o pellet de leucócitos em tampão apropriado e manter no gelo em tubo FACS novo.
- Contagem de células, avaliar a viabilidade celular por exclusão do azul Trypan e analisar por citometria de fluxo. Em geral, os investigadores podem esperar para adquirir cerca de 5 x 10 5 células / animal.
3. Imunofenotipagem por citometria de fluxo
- Após o isolamento e contagem de leucócitos, as células rodada por 3 minutos a 1500 rpm (600 deu) em centrífuga clínica.
- Ressuspender o sedimento em tampão de bloqueio contendo o seguinte: tampão FACS, sobrenadante de 2.4G2 hibridoma (Fc block; anti-CD16/32) e soro fetal bovino na proporção de 10:05:01 e incubar por 30 minutos a 4 ° C .
- Prepare e adicione os anticorpos contra antígenos conjugados extracelular para as células bloqueadas em uma concentração de 1:200 e incubar por 30 minutos a 4 ° C no escuro. Stain e incubar as células em 200 mL de uma placa de 96 poços V-bottom. Controles apropriados incluem células imaculada e amostras de compensação fluorocromo, conforme necessário.
- Girar a células coradas em RT por 3 minutos a 1500 rpm (600 deu) em centrífuga clínica usando um apropriado rotor para placas de 96 poços.
- Aspirar o sobrenadante e lavar as células com 200 mL de buffer FACS cuidado pipetando para cima e para baixo 3 vezes.
- Repita a técnica de lavagem acima duas vezes.
- Após a lavagem, ressuspender as células em paraformaldeído 2% e transferir para tubos FACS. Fixação é necessário para análise de citometria de fluxo de células infectadas do Nível de Biossegurança 2 reagentes.
- Executar as células fixas em um BD FACS Calibur seguir um método modificado de citometria de fluxo 8 e analisar arquivos off-line usando programa FlowJo, WinMDI ou outros disponíveis fluxo de software de análise de citometria.
- A análise dos 50-100,000 eventos por amostra geralmente é necessária para imunofenotipagem adequada.
Anticorpos diretamente conjugados utilizados neste experimento:
CD45 foi detectado com o clone de 30 F11. Ly6C / G foi detectado com o clone Gr1, RB6-8C5. CD11b foi detectado com o clone M1/70. F4/80 foi detectado com o clone BM8.
4. Resultados representativos:
Apresentados os resultados de células para fenotipagem Bils do mouse em 24 horas após a infecção (Figura 3). Leucócitos foram coradas com conjugado anti-PerCP mouse-CD45 para detectar células do sistema imunológico, PE-conjugado anti-mouse Ly6C / G para detectar monócitos inflamatórias, APC-conjugado anti-mouse CD11b e APC-conjugado anti-rato F4/80 para detectar células da linhagem de monócitos. A análise foi realizada com um instrumento BD FACS Calibur.
Figura 1. Localização anatômica do local da injeção. O local de injecção está localizado a 1 mm anterior ao bregma e 1 mm lateral à sutura sagital do lado direito.
Figura 2. Leucócitos ilustração de separação por gradiente de leucócitos e Bils. São inicialmente coletados diretamente abaixo da camada de mielina e detritos acima do pellet RBC no gradiente de Percoll. A camada, branco macio (Bils) na interface é coletado do gradiente de Ficoll.
Figura 3. Imunofenótipo de cérebro-infilatrating leucócitos em 24 horas pós-infecção leucócitos. Rato foram isoladas a partir do cérebro por centrifugação diferencial densidade do tecido homogeneizados preparados a partir de animais em 24 horas após a infecção intracraniana. Células foram marcadas com anticorpos fluorescente-conjugada contra o rato CD45, Ly6C / G, CD11b e F4/80. Gating inicial foi realizada plotando CD45, um marcador de células do sistema imunológico, contra a dispersão para a frente (FSC), um indicador do tamanho da célula (C). O oi CD45 (A, D), CD45 lo (B, E) e CD45 neg (F, G) populações foram então analisados para os níveis de expressão relativa dos marcadores de monócitos e macrófagos Ly6C / G, F4/80 (A, B , F), e CD11b (D, E, G). Ly6C / G + + F4/80 CD11b + monócitos inflamatórias foram encontradas quase que exclusivamente na população oi CD45 (A, D), de acordo com a infiltração destas células a partir da periferia. Em contraste, macrófagos CD11b Ly6C/G-F4/80 lo + foram encontradas quase que exclusivamente na lo CD45 (B, E) e neg CD45 (G) populações, de acordo com um fenótipo residente. Em numerosos experimentos, nós nunca observamos células CD45 oi ou Ly6C / G + + F4/80 CD11b + monócitos inflamatória no cérebro de não infectados ou sham-infecçãoted camundongos (dados não mostrados).
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Discussion
Rotineiramente uso de citometria de fluxo para determinar a qualidade da preparação das células cerebrais se infiltrando, e para distinguir diferentes populações de células do sistema imunológico 2, 9. Aguda em tempo de pontos, o nosso método Bils rendimentos elevados percentuais de monócitos inflamatória dentro da população CD45hi, bem como altas porcentagens de macrófagos na população CD45lo. Isto indica que uma resposta imune reprodutíveis dentro do cérebro pode ser robustamente caracterizado por nosso método.
Esta técnica é de particular importância para experimentos que requerem uma população bem caracterizados de células imunes do cérebro do rato. Nós já realizou experimentos transferência adotiva pela injeção de nosso cérebro infiltração de leucócitos em camundongos host via injeção de cauda veia 7, e nós temos caracterizado o Bils através de vários experimentos in vitro 9. Nossa preparação Bils é particularmente benéfico em experiências que devem distinguir diferentes populações de células do sistema imunológico de células residentes do cérebro, incluindo macrófagos e microglia residente. Outra aplicação de interesse inclui análise em tempo real de RT-PCR realizada em RNA total isolado de Bils em 7 dias após a infecção para identificar as funções efetoras 3. Por exemplo, medimos GAPDH, granzima B e perforina RNA em Bils coletados em 7 dias após a infecção de perforina-competente e com deficiência de animais infectados com TMEV. Temos também o nosso método utilizado para determinar como Bils NKG2D contribui para a limpeza TMEV do cérebro de ratos com infecção aguda 4.
Existem vários aspectos críticos do método. É essencial para trazer todas as soluções à temperatura ambiente antes da preparação para evitar o estresse para os leucócitos e para garantir a separação densitométrica adequada. Estresse sobre os leucócitos contribui para a morte celular, o que os torna especialmente confiável para os experimentos in vivo, onde uma população de células é viver adotivamente transferido para um animal hospedeiro. Temos também determinou que o uso de Percoll frio não apenas altera a densidade do gradiente descontínuo, mas também afeta a qualidade dos leucócitos. Outro elemento crítico é suficiente e homogeneização suave do tecido cerebral. Descobrimos que a homogeneização inadequada e grosseira de resultados de tecido cerebral em grandes quantidades de restos celulares vistos por microscopia e citometria de fluxo. Restos celulares também podem resultar de não sobrecarregar os homogenato de cérebro com o coador de células de tamanho adequado. A devida atenção aos detalhes é fundamental na preparação Bils amplo e suficiente para a experimentação e análise.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por bolsa NS64571 do NINDS (CLH), por um prêmio no início de desenvolvimento de carreira da Clínica Mayo (CLH), e por um generoso dom de Donald e Herdrich Frances (CLH). Gostaríamos de agradecer a Clínica Mayo Núcleo Citometria de Fluxo para obter assistência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalge Nunc international | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche Group | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder | Fisher Scientific | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Biosciences | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman Coulter Inc. | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter Inc. | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | eBioscience | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | eBioscience | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
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