Isolement du cerveau infiltrant Leucocytes

Summary

Une méthode rapide pour obtenir leucocytes infiltrants du cerveau murin est décrite. Cette méthode utilise un gradient de Percoll continue et gradient de Ficoll discontinu pour sélectionner et purifier la couche leuco-enrichi. Leucocytes isolés peuvent alors être caractérisées par des mesures de cytométrie en flux.

Abstract

Nous décrivons une méthode pour la préparation de leucocytes infiltrant le cerveau (Bils) de souris. Nous démontrons comment infecter des souris avec le virus murin de Theiler encéphalomyélite (TMEV) via une technique d'injection intracrânienne rapide et comment purifier une population leucocytaire enrichi des cellules infiltrant du cerveau entier. Brièvement, les souris sont anesthésiés à l'isoflurane dans une chambre fermée et sont main-libre injecté avec une seringue Hamilton dans le cortex frontal. Les souris sont ensuite tués à différents moments après l'infection par surdose isoflurane et cerveaux entiers sont extraits et homogénéisé dans du RPMI avec un broyeur de tissus Tenbroeck. Homogénats de cerveaux sont centrifugés à travers un gradient de Percoll à 30% continue d'éliminer les débris cellulaires et d'autres myéline. La suspension cellulaire est alors tendu à 40 um, lavés et centrifugés sur un discontinu de Ficoll-Paque plus dégradé à sélectionner et à purifier les leucocytes. Les leucocytes sont ensuite lavées et resuspendues dans des tampons appropriés pour l'immunophénotypage par cytométrie en flux. La cytométrie en flux révèle une population de cellules immunitaires innées aux stades précoces de l'infection chez les souris C57BL / 6. A 24 heures après l'infection, multiples sous-ensembles de cellules immunitaires sont présentes dans le Bils, avec une population enrichie de Gr1 ^+, CD11b ⁺ et ⁺ F4/80 cellules. Par conséquent, cette méthode est utile pour caractériser la réponse immunitaire à une infection aiguë dans le cerveau.

Protocol

1. Injection du virus intracrânienne:

La technique suivante a été modifié et largement utilisée par notre laboratoire et ses collègues. Brièvement, l'injection intracrânienne de souche du Daniel de virus murin de Theiler encéphalomyélite (TMEV) ou fictive-infection (1, 10) est réalisée sur des souris jeunes (de préférence 5-6 semaines d'âge) pour obtenir des leucocytes infiltrant le cerveau (Bils). S'il vous plaît noter que les résultats diffèrent entre les souches du Daniel, la souche de soja et la souche GDVII. Aux fins de la récolte de Bils, souris reçoivent 2x10 ⁵ UFP de TMEV et sont infectées pendant 24 heures.

1. Fixez l'aiguille d'injection (27 gauge, ¼, Kendall), à une seringue automatique 1 ml Hamilton et réglée pour délivrer 10 ul de virus.
2. Dresser TMEV de 10 uL de DMEM dans la seringue avec une attention particulière aux bulles d'air. Le cas échéant, des souris infectées reçoivent simulacre 10 ul de virus sans DMEM.
3. Juste avant l'injection, verser environ 1 mL d'isoflurane dans une cloche de verre qui contient une grille de fils de coton avec le substrat en dessous.
4. Placez la souris sur la grille de fil direclty dans la cloche jusqu'à ce qu'ils deviennent légèrement anesthésiés, insensibles aux pieds-pincement et immobilisé par l'anesthésique par inhalation, environ 10-15 secondes. Souris ne devrait pas venir en contact direct avec l'isoflurane, comme substance peut être irritante et caustique.
5. Alors que sous anesthésie, de préparer des souris pour injection par localiser rapidement des coordonnées appropriées dans la région du cortex frontal sur le crâne à l'aide de rasage et de l'encrage. L'emplacement général pour l'injection est de 1 mm en avant de bregma et 1 mm latéralement à la suture sagittale sur le côté droit (figure 1). Alors que l'injection stéréotaxique peut être approprié pour certaines situations expérimentales, nous avons constaté que l'injection à main levée, sans le rasage ou l'encrage est approprié pour la majorité des expériences. Écarté les poils avec la pointe de l'aiguille le long des deux axes est approprié pour l'injection.
6. Pour faire une injection, d'orienter l'aiguille perpendiculaire au crâne et appuyez à travers l'os d'une profondeur d'environ 3 mm.
7. Le virus Express dans le cerveau en appuyant sur le bouton seringue Hamilton vers le bas et attendre 2 secondes pour que le virus d'entrer dans le cerveau avant de se retirer.
8. Retirer délicatement l'aiguille et placer la souris dans un endroit propre, sécher la cage. Souris réveiller après une anesthésie plus rapidement et de reprendre un fonctionnement normal en quelques minutes. Accorder une attention adéquate à des souris qui présentent des symptômes anormaux, tels que des saignements excessifs du site d'injection, comme l'euthanasie de l'animal peut être appropriée. Une bonne manipulation des animaux ⁶ et l'adhésion aux National Institutes of Health et la protection des animaux et des directives institutionnelles Comité utilisation doit être suivie.

2. Brain-infiltrer la préparation des leucocytes:

1. Préparer des tubes à fond rond Oak Ridge centrifugeuse qui peut accueillir une capacité de 30 ml avec 10 ml de RPMI 1640, 9 ml de Percoll et 1 ml de PBS 10X et les tubes doivent s'asseoir à la RT sur le banc pendant le processus d'élimination du cerveau.
2. Apportez Ficoll-Paque Plus à température ambiante (TA).
3. Euthanasier des animaux par l'isoflurane modifiés surdosage ⁵ et supprimer rapidement le cerveau à l'aide d'une spatule en acier inoxydable de tissu et le placer dans un tube de 15 ml conique contenant 5 ml de RPMI sur la glace. Dans certaines circonstances, PBS-perfusion peut être approprié de retirer des cellules circulantes du sang périphérique de la préparation de Bils. Les souris doivent être pleinement et correctement anesthésié avant PBS-perfusion.
4. Transfert du cerveau et de la solution RPMI à un verre de 7 ml meuleuse Pyrex marque tissus Tenbroeck et doucement homogénéiser avec 10-15 coups.
5. Pipet un supplément de 5 ml de RPMI dans l'homogénéisateur et une pipette de haut en bas deux fois. Transfert du cerveau homogénat (env. 10 ml) d'préalablement préparé à fond rond tube et retourner doucement 2-3 fois pour mélanger.
6. Spin homogénat de cerveau à 7800g _Ave pendant 30 min à température ambiante dans une F0360 rotor angulaire dans un Beckman Allegra X-22R centrifugeuse clinique.
7. Après centrifugation, enlever les débris de myéline qui a flotté au sommet de la pente. Recueillir la couche de leucocytes qui flotte au-dessus des globules rouges culot (figure 2).
8. Strain couche de leucocytes à travers un tamis 40 um cellule dans une forme conique de 50 ml. Apporter une solution à un volume de 50 ml avec IPMB.
9. Tubes contenant Spin suspension cellulaire diluée dans une centrifugeuse clinique à 1500 rpm (600g _AVE) pendant 5 min à température ambiante.
10. Aspirer le surnageant et recueillir le culot cellulaire. Reprendre le culot dans 1 ml de tampon FACS (1% de sérum albumine bovine, azoture de sodium à 0,02% en calcium et en magnésium sans PBS) et le transfert de la suspension cellulaire à 5 ml tubes ronds FACS bas.
11. Suspension de sous-couche soigneusement avec 1 ml de Ficoll-Paque Plus.
12. Spin tube à 2500 rpm (1400 a donné) en centrifugeuse clinique pendant 25 min à température ambiante sans frein.
13. Retirer couche blanche duveteuse à l'interface (figure 2) avec une pipette ml et transférer à nouveau tube de 5 ml FACS. Lavez caunes avec 4 ml de tampon FACS.
14. Spin tubes à 1500 rpm (600g _AVE) pendant 5 min à température ambiante dans centrifugeuse clinique pour sédimenter les cellules.
15. Aspirer le surnageant et recueillir culot cellulaire. Reprendre le culot dans leucocytes tampon approprié et garder sur la glace dans FACS nouveau tube.
16. Compter les cellules, d'évaluer la viabilité cellulaire par exclusion du bleu Trypan et analyser par cytométrie en flux. En général, les enquêteurs peuvent s'attendre à acquérir environ 5 x 10 ⁵ cellules / animal.

3. Immunophénotypage par cytométrie en flux

1. Après avoir isolé et le comptage des leucocytes, le spin des cellules pendant 3 minutes à 1500 rpm (600 _a) dans une centrifugeuse clinique.
2. Reprendre le culot dans un tampon bloquant contenant les éléments suivants: tampon FACS, surnageant de 2.4G2 hybridomes (Fc bloc; anti-CD16/32) et sérum de veau fœtal à un ratio de 10:05:01 et incuber pendant 30 minutes à 4 ° C .
3. Préparer et ajouter des anticorps conjugués dirigés contre les antigènes extracellulaires aux cellules bloquées à une concentration de 1:200 et incuber pendant 30 minutes à 4 ° C dans l'obscurité. Stain et incuber les cellules dans 200 ul dans un 96 puits à fond en V assiette. Des contrôles appropriés incluent cellules non colorées et des échantillons de compensation fluorochrome, le cas échéant.
4. Faites tourner les cellules colorées à la température ambiante pendant 3 minutes à 1500 rpm (600 _a) dans une centrifugeuse clinique appropriée en utilisant un rotor pour plaques de 96 puits.
5. Aspirer le surnageant et laver les cellules avec 200 ul de tampon FACS par un léger pipetage haut et en bas trois fois.
6. Répétez la technique de lavage ci-dessus à deux reprises.
7. Après le lavage, remettre en suspension les cellules dans du paraformaldéhyde à 2% et le transfert à des tubes FACS. La fixation est nécessaire pour l'analyse par cytométrie en flux de cellules infectées de niveau de biosécurité 2 réactifs.
8. Exécuter les cellules fixées sur une BD FACS Calibur suivant une méthode de cytométrie en flux ⁸ modifiés et d'analyser les fichiers hors connexion en utilisant FlowJo, WinMDI ou d'autres logiciels disponibles analyse de cytométrie en flux.
9. L'analyse des événements par 50-100,000 échantillon est généralement requis pour l'immunophénotypage adéquate.

Anticorps directement conjugués utilisés dans cette expérience:

CD45 a été détecté avec clone 30-F11. Ly6C / G a été détecté avec clone Gr1, RB6-8C5. CD11b a été détecté avec clone M1/70. F4/80 a été détecté avec clone BM8.

4. Les résultats représentatifs:

Nous montrons les résultats de phénotypage de cellules pour Bils souris à 24 heures après l'infection (figure 3). Les leucocytes ont été colorés avec PerCP conjugué anti-souris CD45 pour détecter les cellules immunitaires, PE-anti-souris conjugué Ly6C / G pour détecter les monocytes inflammatoires, APC-anti-souris conjugué CD11b et APC-conjugué anti-souris pour détecter les cellules F4/80 de la lignée monocytaire. L'analyse a été réalisée avec un instrument BD FACS Calibur.

Figure 1. Localisation anatomique du site d'injection. Le site d'injection se situe à 1 mm en avant de bregma et 1 mm latéralement à la suture sagittale sur le côté droit.

Figure 2. Leucocytes Illustration de séparation par gradient de leucocytes et de Bils. Sont initialement collectées directement en dessous de la couche de débris de myéline et surtout le culot de RBC dans le gradient de Percoll. La couche blanche duveteuse (Bils) à l'interface est recueillie à partir du gradient de Ficoll.

Figure 3. Immunophénotype des cerveaux infilatrating leucocytes à 24 heures post-infection leucocytes souris. Ont été isolés à partir du cerveau par centrifugation densité différentielle du tissu homogénats préparés à partir d'animaux 24 h après l'infection intracrânienne. Les cellules ont été colorées avec des anticorps par fluorescence-conjugués contre les souris CD45, Ly6C / G, CD11b, et F4/80. Gating initiale a été réalisée en traçant CD45, un marqueur de cellules immunitaires, contre prodiffusion (FSC), un indicateur de la taille des cellules (C). Le ^Salut CD45 (A, D), CD45 ^lo (B, E), et CD45 ^neg (F, G), les populations ont ensuite été analysés pour les niveaux d'expression relative des marqueurs monocytes et les macrophages Ly6C / G, F4/80 (A, B , F), et CD11b (D, E, G). Ly6C / G ^{+ +} CD11b ⁺ F4/80 monocytes inflammatoires ont été trouvés presque exclusivement dans la population CD45 ^Salut (A, D), compatible avec l'infiltration de ces cellules de la périphérie. En revanche, Ly6C/G-F4/80 ^lo CD11b ⁺ macrophages ont été trouvés presque exclusivement dans le ^lo CD45 (B, E) et CD45 ^neg (G) des populations, compatible avec un phénotype résident. Dans de nombreuses expériences, nous n'avons jamais observé de cellules CD45 ^salut ou Ly6C / G ^{+ +} CD11b ⁺ F4/80 monocytes inflammatoires dans le cerveau des infectés ou fictive-infectionTed souris (données non présentées).

Discussion

Nous utilisons régulièrement la cytométrie en flux pour déterminer la qualité de la préparation des cellules du cerveau infiltrer, et de distinguer les différentes populations de cellules immunitaires ^{2, 9.} A aiguë du temps des points, notre méthode Bils rendements des pourcentages élevés de monocytes inflammatoires au sein de la population CD45hi ainsi que de forts pourcentages de macrophages dans la population CD45lo. Cela indique que la réponse immunitaire dans reproductibles le cerveau peut être caractérisée robuste par notre méthode.

Cette technique est d'une importance particulière pour des expériences qui nécessitent une population bien caractérisée des cellules immunitaires du cerveau de souris. Nous avons déjà réalisé des expériences de transfert adoptif en injectant notre cerveau infiltration des leucocytes dans des souris hôte via l'injection veine de la queue ^7, et nous avons caractérisé le Bils via divers expériences in vitro ^9. Notre préparation Bils est particulièrement bénéfique dans des expériences qui doivent distinguer les différentes populations de cellules immunitaires de cellules résidentes du cerveau, y compris les macrophages résidents et les microglies. Une autre application d'intérêts comprend en temps réel analyse RT-PCR sur l'ARN total isolé de Bils à 7 jours après l'infection afin d'identifier les fonctions effectrices ^3. Par exemple, nous avons mesuré la GAPDH, granzyme B et perforine ARN dans Bils recueillies à 7 jours après l'infection par la perforine-compétent et un déficit d'animaux infectés par TMEV. Nous avons également utilisé notre méthode pour déterminer comment Bils NKG2D contribue à la compensation TMEV du cerveau de souris infectés de façon aiguë ^4.

Il ya plusieurs aspects essentiels de la méthode. Il est essentiel d'apporter toutes les solutions à température ambiante avant la préparation afin d'éviter un stress excessif aux leucocytes et d'assurer une séparation adéquate densitométrique. Le stress sur les leucocytes contribue à la mort cellulaire, ce qui les rend particulièrement peu fiable pour les expériences in vivo où une population de cellules est direct adoptive transféré dans un animal hôte. Nous avons également déterminé que l'utilisation de Percoll à froid ne change pas seulement de la densité du gradient discontinu, mais affecte également la qualité des leucocytes. Un autre élément essentiel est l'homogénéisation suffisante et en douceur des tissus du cerveau. Nous avons trouvé que l'homogénéisation insuffisante et approximative des résultats de tissu cérébral dans de grandes quantités de débris de cellules observées en microscopie et cytométrie de flux. Les débris cellulaires peuvent aussi résulter de ne pas forcer l'homogénat de cerveau avec le tamis de cellules de taille appropriée. Une attention appropriée aux détails est la clé dans la préparation de Bils ample et suffisante pour l'expérimentation et d'analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TMEV	Howe Lab	N/A
Daniel’s strain	Invitrogen	21063-029
isoflurane	Novaplus	NDC 0409-3292-49
round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes	Nalge Nunc international	3118-0030
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Percoll	GE Healthcare	17-0891-02
10X PBS	Roche Group	11666789001
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Trypan Blue 0.4% (w/v)	Mediatech, Inc.	25-900-CI
15 ml conical tubes	BD Biosciences	352097
7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder	Fisher Scientific	08-414-10B
40 μm cell strainer	BD Biosciences	352340
50 mL conical	BD Biosciences	352070
bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647
sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
CMF-PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
FACS tubes	BD Biosciences	352054
fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F4135
2.4G2 hybridoma	ATCC	HB-197
Costar V-bottom plate	Corning	3894
Allegra X-22R centrifuge or equivalent	Beckman Coulter Inc.	N/A
96-well plate bucket and rotor	Beckman Coulter Inc.	S2096
Fixed-angle rotor	Beckman Coulter Inc.	F0360
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
BD FACS Calibur	BD Biosciences	N/A
FlowJo 7.5	Tree Star, Inc.	N/A
CD45	BD Biosciences	557235	clone: 30-F11
Gr1 (Ly6C/G)	BD Biosciences	553128	clone: RB6-8C5
CD11b	eBioscience	17-0112-83	clone: M1/70
F4/80	eBioscience	17-4801-82	clone: BM8