脳浸潤白血球の分離

Summary

マウス脳から浸潤白血球を得るために迅速な方法が記載されている。この方法は連続Percoll勾配と白血球に富む層を選択し、精製する不連続フィコール勾配を利用しています。分離された白血球は、フローサイトメトリー測定によって特徴付けることができる。

Abstract

我々は、マウスからの脳浸潤白血球（BILs）を調製するための方法を説明します。我々はどのように脳全体から浸潤細胞の白血球に富む集団を精製するために迅速な頭蓋内注入法とを経由してタイラーのマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）をマウスに感染させる方法を示します。簡単に言えば、マウスは、密閉チャンバーのイソフルランで麻酔し、前頭皮質にハミルトンシリンジで注入フリーハンドです。マウスはその後Tenbroeck組織グラインダーを含むRPMIで抽出し、均質化されイソフルラン過剰摂取と全脳による感染後の様々な時点で殺されている。脳ホモジネートを、ミエリン及び他の細胞破片を除去するために、連続30％Percoll勾配を通じて遠心分離されています。細胞懸濁液を、40μmの時に緊張洗浄し、白血球を選択し、精製する不連続をFicoll - Paqueプラス勾配で遠心分離される。白血球を洗浄し、フローサイトメトリーで免疫表現するための適切な緩衝液に再懸濁する。フローサイトメトリーはC57BL / 6マウスにおける感染の初期段階での自然免疫細胞の集団を明らかにする。 24時間後に感染症で、免疫細胞の複数のサブセットにはGR1 ^{+、CD11b +}とF4/80 ⁺細胞の濃縮の人口で、BILsに存在しています。したがって、この方法は、脳内の急性感染症に対する免疫応答を特徴づけるのに便利です。

Protocol

1。頭蓋内ウイルスの注入：

次のテクニックは変更と私たちの研究室と同僚によって広く利用されています。簡単に言うと、タイラーのマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）または偽感染のダニエルの菌株の頭蓋内注射は、（1、10）脳浸潤白血球（BILs）を引き出すために若いマウス（年齢、好ましくは5-6週間）に実行されます。結果は、ダニエルの歪み、Beanのひずみ、およびGDVII株間で異なることに注意してください。 BILsを収穫する目的で、マウスはTMEVの2 × 10 ⁵ PFUを受け取ると24時間感染している。

1. 自動1ミリリットルハミルトンシリンジに、注射針（27ゲージ、¼ケンドール、で）添付して、ウイルスの10μlを提供するように設定。
2. 気泡に細心の注意とシリンジに10μLDMEMでTMEVを描く。適切な場合は、偽感染マウスは、ウイルスを含まないDMEM 10μlを受け取る。
3. 注射の直前に、下に綿の基板とワイヤグリッドを含むベルジャーにイソフルランの約1 mLを注ぐ。
4. ベルジャーのワイヤグリッドの上に置いてマウスはdireclty彼らが軽く、麻酔つま先-ピンチに区別しないと吸入麻酔薬、約10〜15秒で固定化になるまで。物質が刺激性及び腐食することができるようにしたマウスは、イソフルランと直接接触しないでください。
5. 麻酔下にある間、素早くシェービングとインクを使用して頭蓋骨上前頭皮質領域で適切な座標を配置することにより、注射のためのマウスを準備する。注射のための一般的な場所は、ブレグマの前方に1 mmの右側の矢状縫合（図1）の横1mmである。定位注射は、いくつかの実験的な状況に適したかもしれないが、我々は、シェービングやインクなしでフリーハンドの注入が実験の大部分に適していることを発見した。両方の軸に沿って針先で毛皮を別れと注入に適しています。
6. 注入を行うには、オリエント約3 mmの深さに骨を介して頭蓋骨と記者に針の垂直。
7. ハミルトンシリンジのボタンを押して撤退する前に脳を入力するようにウイルスのために2秒を待っていることにより脳内へのエクスプレスウイルス。
8. 慎重に針を除去し、清潔で乾燥したケージでマウスを置きます。マウスはすぐに麻酔から覚醒し、数分以内に正常な機能を再開する。動物の安楽死として、そのような注射部位から多量の出血のように、異常な症状を示すマウスに適切な注意を与えることが適切な場合があります。 ^6、健康と動物実験の国立研究所の遵守及び委員会のガイドラインを使用しての処理に適切な動物に従う必要があります。

2。脳浸潤白血球細胞の準備を：

1. 10ミリリットルRPMI 1640と30ミリリットルの容量を保持できるの丸底オークリッジ遠心管を準備し、9ミリリットルパーコールし、1mlの10 × PBSとチューブは、脳の削除処理中にベンチにRTに座っているはず。
2. 室温（RT）にをFicoll - Paqueプラスをもたらす。
3. 修正されたイソフルラン過剰摂取⁵で動物を安楽死させるとすぐに氷上で5ミリリットルRPMIを含む15 mlのコニカルチューブにステンレス鋼の組織のヘラと場所を使って脳を取り除く。ある状況下では、PBS -灌流はBILsの準備から、循環末梢血細胞を除去することが適切な場合があります。マウスは、完全かつ適切に麻酔前にPBS -灌流にしてください。
4. 7ミリリットルガラスパイレックスブランドTenbroeck組織グラインダーに脳とRPMI液を移し、ゆっくりと10〜15ストロークでホモジナイズする。
5. 2回アップダウンホモジナイザーとピペットにピペットで追加の5ミリリットルRPMIを。転送脳ホモジェネート（約10ml）を事前に準備された丸底チューブへと静かに転倒させて2〜3回がミックスする。
6. ベックマンアレグラX - 22R臨床遠心分離機でF0360固定アングルローターで室温で30分7800グラム_Aveで脳ホモジネートを回転させる。
7. 遠心分離後、勾配の上に浮いているミエリンの残骸を削除します。赤血球細胞ペレット（図2）の上に浮いて白血球層を収集する。
8. 50 mlコニカルに40μmのセルストレーナーを通して白血球層を負担。 RMPIで50mlの容積にソリューションを立ち上げます。
9. 室温で5分間1500rpmで（600グラム_AVE）の臨床遠心機で希釈細胞懸濁液を含むチューブを回転させる。
10. 上清を吸引除去し、細胞ペレットを収集する。 1ミリリットルのFACS緩衝液（1％ウシ血清アルブミン、0.02％ナトリウムカルシウムのアジ化物とマグネシウムを含まないPBS）でペレットを再懸濁し、5 mlの丸底のFACSチューブに細胞懸濁液を移す。
11. 1ミリリットルをFicoll - Paqueのプラスと慎重にアンダーサスペンション。
12. ブレーキなしで室温で25分間臨床遠心機で2500rpmで（1400与えた）でチューブを回転させる。
13. 1 mlのピ​​ペットと新しい5ミリリットルFACSチューブへの転送とのインタフェース（図2）に白、ふわふわのレイヤーを削除します。ウォッシュC4 mlのFACS緩衝液でエルズ。
14. 細胞をペレット化への臨床遠心分離機で室温で5分間1500rpmで（600グラム_AVE）でチューブを回転させる。
15. 上清を吸引除去し、細胞ペレットを収集する。適切な緩衝液で白血球ペレットを再懸濁し、新しいFACSチューブには氷上に置きます。
16. トリパンブルー排除により、細胞の生存率を評価し、フローサイトメトリーで分析し、細胞を数える。一般的には、研究者は約5 × 10 ⁵細胞/動物を取得することを期待することができます。

3。フローサイトメトリーによる免疫表現型検査

1. 白血球を分離し、計数した後、臨床遠心分離機で1500rpmで（600が_与えた ）で3分間、細胞をスピン。
2. ° Cで4℃30分間と10時05分01秒の割合でウシ胎児血清とインキュベートする。2.4G2ハイブリドーマ（anti-CD16/32のFcブロック）からの上清を、FACS緩衝液：以下を含むブロッキングバッファーでペレットを再懸濁し。
3. 準備し、4℃で30分間、1:200とインキュベートの濃度でブロックされた細胞·ダークのCに細胞外抗原に対する標識抗体を加える。 96穴V底プレートに200μlで細胞を染色し、インキュベートする。適切なコントロールが必要に応じて未染色細胞と蛍光色素補正のサンプルを、含まれています。
4. 96ウェルプレート用ローターに適切なを使用して臨床遠心分離機で1500rpmで3分間室温で染色された細胞を（600 _与えた ）スピン。
5. 上清を吸引除去し、穏やかに3回上下にピペッティングして200μlのFACS緩衝液で細胞を洗浄。
6. 二度、上記の洗浄技術を繰り返します。
7. 洗浄後、2％パラホルムアルデヒドおよびFACSチューブへの転送中に細胞を懸濁します。固定は、バイオセーフティーレベル2の試薬が感染した細胞のフローサイトメトリー解析のために必要です。
8. 修正されたフローサイトメトリー法⁸次のBD FACSキャリバーで固定された細胞を実行し、オフラインFlowJo、WinMDIまたは他の利用可能なフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してファイルを分析する。
9. サンプルあたり50-100,000イベントの分析は、一般的に十分な免疫表現型検査のために必要です。

この実験で使用されている直接標識抗体：

CD45は、クローン30 F11で検出した。 Ly6C / GはクローンGR1、RB6 - 8C5で検出した。 CD11bは、クローンM1/70で検出された。 F4/80はクローンBM8で検出された。

4。代表的な結果：

私たちは24時間の感染後（図3）でマウスのBILsのための細胞の表現型解析の結果を示す。白血球は、炎症性単球を検出するために、PE標識抗マウスLy6C / G、APC標識抗マウスCD11bおよび細胞を検出するためにF4/80抗マウスAPC標識、免疫細胞を検出するためにPerCP結合抗マウスCD45で染色した単球系の。解析は、BD FACSキャリバーの楽器を行った。

図1。注射部位の解剖学的局在。注射部位は、ブレグマの前方に1 mmの右側の矢状縫合の外側を1mmに位置しています。

図2。白血球とBILsの勾配分離のイラスト。白血球は、最初は直接ミエリンの破片の層の下にとPercoll勾配でRBCペレット上に収集されます。界面で白い、ふわふわの層（BILs）はフィコール勾配から収集されます。

図3。 24時間後に感染。マウスの白血球における脳infilatrating白血球の免疫表現型は、組織が ​​頭蓋内感染24時間後に動物から調製したホモジネートの差密度遠心分離によって脳から単離された。細胞は、マウスCD45、Ly6C / G、CD11b、およびF4/80に対する蛍光標識抗体で染色した。最初のゲートは、前方散乱光（FSC）、セルサイズの指標（C）に対して、CD45、免疫細胞のマーカーをプロットすることにより行った。 CD45 ^{HI（A、D）、CD45 LO（B、E）、}およびCD45 ^{NEG（F、G）}の人口は、単球とマクロファージマーカーLy6C / G、F4/80（A、Bの相対的な発現レベルについて分析した、F）、およびCD11b（D、E、G）。 Ly6C / G ⁺ F4/80 ⁺ CD11b ⁺炎症性単球は末梢からのこれらの細胞の浸潤と一致し、CD45 ^{ハイテクの}人口（A、D）でほとんど独占的に発見された。対照的に、Ly6C/G-F4/80 ^LO CD11b ⁺マクロファージが常駐表現型と一致し、CD45 ^{LO（B、E）}とCD45 ^NEG（G）の集団でほぼ全面的に認められた。数々の実験では、我々はCD45 ^ハイテク細胞や非感染の脳または擬似感染のLy6C / G ⁺ F4/80 ⁺ CD11b ⁺炎症性単球を観察したことがないテッドマウス（データは示さず）。

Discussion

我々は日常的に脳浸潤細胞調製物の品質の両方を決定するためにフローサイトメトリーを使用し、免疫細胞^2,9の異なる集団を区別する。急性の時間の時点で、私たちのBILsメソッドはCD45hi集団内の炎症性単球と同様にCD45lo集団におけるマクロファージの高い割合の高い割合を得られます。これは、脳内で再現性の免疫応答が確実に私たちの方法によって特徴付けることができることを示しています。

この手法は、マウスの脳から免疫細胞の十分に特徴付けられた集団を必要とする実験のための特に重要である。我々は以前に尾静脈注射^7を介してホストのマウスに白血球が浸潤私たちの脳に注入することにより養子移入実験を実施している、と我々 は 、in vitro の実験⁹ の様々な経由でBILsを特徴付けている。私たちのBILsの準備が常駐マクロファージとミクログリアを含む脳の居住者細胞から免疫細胞の異なる集団を区別する必要の実験では特に有益です。興味の別のアプリケーションでは、エフェクター機能^3を識別するために、7日後に感染症でBILsから単離した全RNAで実行、リアルタイムRT - PCR解析を含みます。例えば、我々は、パーフォリン、有能から7日後の感染で収集BILsでGAPDH、グランザイムBとパーフォリンRNAを測定し、欠損TMEVに感染した動物。我々はまた、NKG2Dは、急性感染マウスの⁴の脳から消去TMEVに寄与する方法を決定するために我々のBILsメソッドを利用してきた。

方法のいくつかの重要な側面があります。それは白血球に過度のストレスを避けるために、適切な濃度測定の分離を確保するために事前の準備に室温にすべてのソリューションをもたらすことが不可欠です。白血球上のストレスは、細胞の生集団が養子宿主動物に転送されるin vivo実験でのに対して、特に信頼性になる細胞死、に貢献しています。我々はまた冷たいパーコールの使用だけでなく不連続勾配の密度を変更するだけでなく、白血球の質に影響を与えることを決定した。別の重要な要素は、脳組織の十分かつ穏やかな均質化である。我々は顕微鏡やフローサイトメトリーで見られる細胞の破片の豊富な量の脳組織の結果のその不十分とラフな均質化を発見した。細胞残渣はまた、適切なサイズのセルストレイナーで脳ホモジネートを負担しないから可能性があります。細部への適切な配慮はさらなる実験と解析のために十分な、十分なBILsを準備するキーです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TMEV	Howe Lab	N/A
Daniel’s strain	Invitrogen	21063-029
isoflurane	Novaplus	NDC 0409-3292-49
round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes	Nalge Nunc international	3118-0030
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Percoll	GE Healthcare	17-0891-02
10X PBS	Roche Group	11666789001
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Trypan Blue 0.4% (w/v)	Mediatech, Inc.	25-900-CI
15 ml conical tubes	BD Biosciences	352097
7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder	Fisher Scientific	08-414-10B
40 μm cell strainer	BD Biosciences	352340
50 mL conical	BD Biosciences	352070
bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647
sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
CMF-PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
FACS tubes	BD Biosciences	352054
fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F4135
2.4G2 hybridoma	ATCC	HB-197
Costar V-bottom plate	Corning	3894
Allegra X-22R centrifuge or equivalent	Beckman Coulter Inc.	N/A
96-well plate bucket and rotor	Beckman Coulter Inc.	S2096
Fixed-angle rotor	Beckman Coulter Inc.	F0360
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
BD FACS Calibur	BD Biosciences	N/A
FlowJo 7.5	Tree Star, Inc.	N/A
CD45	BD Biosciences	557235	clone: 30-F11
Gr1 (Ly6C/G)	BD Biosciences	553128	clone: RB6-8C5
CD11b	eBioscience	17-0112-83	clone: M1/70
F4/80	eBioscience	17-4801-82	clone: BM8