Summary
En snabb metod för att få infiltrera leukocyter från mus hjärnan beskrivs. Denna metod använder en kontinuerlig Percoll lutning och diskontinuerliga Ficoll lutning för att välja och rena leukocyt-berikade lager. Isolerade leukocyter kan då präglas av flödescytometrisk mätningar.
Abstract
Vi beskriver en metod för att förbereda hjärnan infiltrera leukocyter (BILS) från möss. Vi visar hur du infektera möss med Theiler är murina encefalomyelit virus (TMEV) via en snabb intrakraniell injektionsteknik och hur man renar en leukocyt-berikad population av infiltrera celler från hela hjärnan. Kortfattat, möss är sövda med isofluran i en sluten kammare och är fri hand injiceras med en Hamilton sprutan i frontala cortex. Möss är sedan dödas vid olika tidpunkter efter infektion med isofluran överdos och hela hjärnor extraheras och homogeniseras i RPMI med en Tenbroeck vävnad kvarn. Brain homogenat centrifugeras genom en kontinuerlig 30% Percoll lutning för att ta bort myelinet och andra cell skräp. Cellsuspensionen sedan ansträngd vid 40 ìm, tvättas och centrifugeras för en diskontinuerlig Ficoll-Paque Plus lutning för att välja och rena leukocyter. Den leukocyter sedan tvättas och suspenderade i lämpliga buffertar för immunfenotypning med flödescytometri. Flödescytometri avslöjar en population av medfödda immunförsvaret celler i ett tidigt skede av infektionen i C57BL / 6 möss. 24 timmar efter infektion, flera delmängder av immunceller finns i BILS, med en berikad population av Gr1 +, CD11b + och F4/80 + celler. Därför är denna metod användbar i karakterisera immunsvaret mot akut infektion i hjärnan.
Protocol
1. Intrakraniell virus injektion:
Följande Tekniken har ändrats och används i stor utsträckning av våra labb och kollegor. Kortfattat (1, 10) intrakraniell injektion av Daniels stam av Theiler är murina encefalomyelit virus (TMEV) eller simulerade-infektion utförs på unga möss (helst 5-6 veckors ålder) för att väcka hjärnan infiltrera leukocyter (BILS). Observera att resultaten kommer att variera mellan Daniels stam och BEAN stam, och GDVII stammen. För skörd BILS, möss får 2x10 5 PFU av TMEV och är smittade i 24 timmar.
- Fäst injektionsnål (27 gauge, ¼ i, Kendall), en automatisk 1 ml Hamilton spruta och inställd på att leverera 10 ìl av virus.
- Upprätta TMEV i 10 mikroliter DMEM i sprutan med noggrann uppmärksamhet på luftbubblor. Vid behov bluff infekterade möss får 10 ìl virusfri DMEM.
- Strax före injektionen, häll ca 1 ml isofluran i en glaskupa som innehåller en tråd rutnät med bomull substrat under.
- Placera möss direclty på trådgaller i glaskupan tills de blir lätt sövda, okänslig för toe-nypa och immobiliserade av inhalant narkos, ungefär 10-15 sekunder. Möss bör inte komma i direkt kontakt med isofluran, eftersom substansen kan vara irriterande och frätande.
- Medan under narkos, förbereda möss för injektion genom att snabbt lokalisera lämpliga koordinater i frontala cortex regionen på skallen med rakning och infärgning. Det allmänna läget för injektion är 1 mm främre till bregma och 1 mm i sidled till sagittal sutur på höger sida (Figur 1). Medan stereotaktisk injektion kan vara lämplig för vissa experimentella situationer, har vi funnit att fri hand injektion utan rakning eller infärgning är lämplig för de flesta experimenten. Parting pälsen med nålen punkt längs båda axlarna är lämplig för injektion.
- För att göra en injektion, orientera nålen vinkelrätt mot skallen och trycker genom benet till ca 3 mm djup.
- Express viruset in i hjärnan genom att trycka på Hamilton sprutan knappen och vänta 2 sekunder för viruset att komma in i hjärnan innan man tar ut.
- Ta försiktigt bort nålen och placera musen i en ren och torr bur. Möss vakna upp ur narkos snabbt och återgå till normal funktion inom några minuter. Titta ordentligt på möss som uppvisar onormala symtom såsom kraftig blödning från injektionsstället, som dödshjälp av djuret kan vara lämpliga. Korrekt djurhantering 6 och anslutning till National Institutes of Health and Institutional Animal Care och använda riktlinjer kommittén måste följas.
2. Brain-infiltrera leukocyt cellberedningen:
- Förbered rundbottnad Oak rör Ridge centrifugen som kan hålla en kapacitet på 30 ml med 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll och 1 ml 10X PBS och rör bör sitta vid RT på bänken under hjärnan borttagningen.
- Ta Ficoll-Paque Plus till rumstemperatur (RT).
- Euthanize animaliska modifierad isofluran överdos 5 och snabbt ta bort hjärnan med hjälp av en rostfri stekspade stål vävnad och placera i ett 15 ml koniskt rör som innehåller 5 ml RPMI på is. Under vissa omständigheter kan PBS-perfusion vara lämpligt att ta bort cirkulerande perifera blodceller från BILS förberedelser. Möss ska vara fullständigt och korrekt bedövas före PBS-perfusion.
- Överföring hjärnan och RPMI lösning till en 7 ml glasflaska Pyrex varumärke Tenbroeck vävnad kvarn och försiktigt homogenisera med 10-15 slag.
- Pipettera ytterligare 5 ml RPMI i homogeniseringsblandare och pipettera upp och ner två gånger. Överföring hjärnan homogenatet (ca 10 ml) till tidigare förberedda rundbottnad rör och vänd försiktigt 2-3 gånger för att blanda.
- Spin hjärnan homogenatet på 7800g Ave i 30 min vid strålbehandling i en F0360 fast-vinkel rotor i en Beckman Allegra X-22R kliniska centrifug.
- Efter centrifugering, ta bort myelinet skräp som flöt till toppen av övertoningen. Samla leukocyter skikt som flyter ovanpå röda blodkroppar pellet (figur 2).
- Sila leukocyt lagret genom ett 40 ìm cell sil i en 50 ml konisk. Lösningen upp till 50 ml volym med rmpi.
- Spin rör som innehåller utspädd cellsuspension i en klinisk centrifugera vid 1500 rpm (600 g ave) i 5 min vid RT.
- Aspirera supernatanten och samla cellpelleten. Suspendera pelleten i 1 ml FACS Buffer (1% bovint serumalbumin, 0,02% natriumazid på kalcium och magnesium-fri PBS) och överför cellsuspensionen till 5 botten ml runda FACS rör.
- Noggrant underlag fjädring med 1 ml Ficoll-Paque Plus.
- Spin rör vid 2500 rpm (1400 gav) i kliniska centrifugera i 25 minuter vid RT utan broms.
- Ta bort vitt, fluffigt lager i gränssnittet (Figur 2) med 1 ml pipett och för över till nya 5 ml FACS rör. Tvätta Calnar med 4 ml FACS buffert.
- Spin rör vid 1500 rpm (600 g ave) i 5 min vid RT i kliniska centrifug till pellets celler.
- Aspirera supernatanten och samla cellpelleten. Resuspendera leukocyter pelleten i lämplig buffert och hålla på is i nya FACS röret.
- Räkna celler, bedöma cellviabiliteten av Trypan blå utslagning och analysera med flödescytometri. I allmänhet kan utredarna räkna med att få ungefär 5 x 10 5 celler / djur.
3. Flödescytometrisk immunofenotypning
- Efter att isolera och räkna leukocyter, snurra cellerna i 3 minuter vid 1500 rpm (600 gav) i en klinisk centrifug.
- Återsuspendera pelleten i blockerande buffert som innehåller följande: FACS buffert, supernatanten från 2.4G2 Hybridomteknik (Fc block; anti-CD16/32) och fetalt bovinserum i förhållandet 10:05:01 och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C .
- Förbered och lägg konjugerade antikroppar mot extracellulära antigener till de blockerade cellerna vid en koncentration av 1:200 och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C i mörker. Fläcken och inkubera celler i 200 l av en 96-brunnars V-bottenplatta. Lämpliga kontroller inkluderar ofärgade celler och fluorokrom prover ersättning, om det behövs.
- Snurra färgade celler vid RT i 3 minuter vid 1500 rpm (600 gav) i en klinisk centrifug med hjälp av en rotor lämplig för plattor med 96 brunnar.
- Aspirera supernatanten och tvätta cellerna med 200 l FACS buffert genom att försiktigt pipettera upp och ned tre gånger.
- Upprepa ovanstående tvätt tekniken två gånger.
- Efter tvättning, resuspendera cellerna i 2% paraformaldehyd och transfer till FACS rör. Fixering krävs för flödescytometrisk analys av celler infekterade av biosäkerhetsnivå 2 reagenser.
- Kör den fasta celler på en BD FACS Calibur efter en modifierad flödescytometri metod 8 och analysera filer offline med hjälp FlowJo, WinMDI eller andra tillgängliga flödescytometri analysprogram.
- Analysen av 50-100,000 händelser per prov krävs i allmänhet för tillräcklig immunfenotypning.
Direkt konjugerade antikroppar som används i detta experiment:
CD45 upptäcktes med klon 30-F11. Ly6C / G upptäcktes med klon Gr1, RB6-8C5. CD11b upptäcktes med klon M1/70. F4/80 upptäcktes med klon BM8.
4. Representativa resultat:
Vi visar resultat cell fenotypning för mus BILS 24 timmar efter infektion (figur 3). Leukocyter färgades med PerCP-konjugerat anti-mus CD45 för att upptäcka immunceller, PE-konjugerat anti-mus Ly6C / G för att upptäcka inflammatoriska monocyter, APC-konjugerat anti-mus CD11b och APC-konjugerat anti-mus F4/80 att upptäcka celler av monocyter härstamning. Analysen utfördes med en BD FACS Calibur instrument.
Figur 1. Anatomiska lokalisering av injektionsstället. Injektionsstället ligger 1 mm främre till bregma och 1 mm i sidled till sagittal sutur på höger sida.
Figur 2. Illustration av lutning separering av leukocyter och BILS. Leukocyter initialt samlas direkt under myelinet skräp lager och ovanför RBC pellets i Percoll lutning. Den vita, fluffiga lager (BILS) i gränssnittet samlas in från Ficoll lutning.
Figur 3. Immunofenotyp av brain-infilatrating leukocyter vid 24 tim efter infektion. Mouse leukocyter var isolerade från hjärnan genom differential täthet centrifugering av vävnad homogenat framställda av djur på 24 tim efter intrakraniell infektion. Cellerna färgades med fluorescerande-konjugerade antikroppar mot mus CD45, Ly6C / G, CD11b och F4/80. Inledande gating utfördes genom att rita CD45, en markör för immunceller mot Forward Scatter (FSC), en indikator på cellens storlek (C). CD45 hej (A, D), CD45 lo (B, E) och CD45 neg (F, G) populationer har sedan analyserats för relativa uttryck nivåer av monocyter och makrofager markörer Ly6C / G, F4/80 (A, B , F) och CD11b (D, E, G). Ly6C / G + F4/80 + CD11b + inflammatoriska monocyter påträffades nästan uteslutande i CD45 hi befolkningen (A, D), i linje med infiltration av dessa celler från periferin. Däremot var Ly6C/G-F4/80 lo CD11b + makrofager finns nästan uteslutande i de CD45 lo (B, E) och CD45 neg (G) populationer, i överensstämmelse med en invånare fenotyp. I många experiment har vi observerade aldrig CD45 hi celler eller Ly6C / G + F4/80 + CD11b + inflammatoriska monocyter i hjärnan hos infekterade eller simulerade-infektionTed möss (data visas inte).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi använder rutinmässigt flödescytometri för att avgöra både kvaliteten av hjärnan infiltrera cellberedningen och för att skilja olika populationer av immunceller 2, 9. Vid akuta gånger, ger våra BILS metod hög andel av inflammatoriska monocyter inom CD45hi befolkningen samt hög andel av makrofager i CD45lo befolkningen. Detta tyder på att ett reproducerbart immunsvar i hjärnan kraftigt kan präglas av vår metod.
Denna teknik är av särskild betydelse för experiment som kräver en väldefinierad population av immunceller från musen hjärnan. Vi har tidigare utfört adoptiv transfer experiment genom att injicera vår hjärna infiltrerande leukocyter i värd möss via svansvenen injektion 7, och vi har präglat BILS via olika in vitro-försök 9. Vår BILS beredning är särskilt fördelaktig i experiment som måste skilja på olika populationer av immunceller från inhemska celler i hjärnan, inklusive bosatt makrofager och mikroglia. En annan tillämpning av intresse inkluderar realtids-RT-PCR analysen utföras på totalt RNA isoleras från BILS vid 7 dagar efter infektion för att identifiera effektorfunktioner 3. Till exempel mätte vi GAPDH, granzyme B och perforin RNA i BILS samlas vid 7 dagar efter infektion från perforin-kompetent och-brist djur infekterade med TMEV. Vi har också utnyttjat våra BILS metod för att avgöra hur NKG2D bidrar till att rensa TMEV från hjärnan av akut infekterade möss 4.
Det finns flera kritiska aspekter av metoden. Det är viktigt att få alla lösningar till rumstemperatur före beredning för att undvika onödig stress på leukocyter och för att säkerställa korrekt densitometriska separation. Stress på leukocyter bidrar till celldöd, vilket gör dem särskilt opålitliga för in vivo-experiment där en levande population av celler adoptively överförs till ett värddjur. Vi har också fastställt att användningen av kalla Percoll inte bara förändringar i densitet diskontinuerliga lutning, men påverkar också kvaliteten på leukocyter. En annan central faktor är tillräcklig och skonsam homogenisering av hjärnvävnad. Vi har funnit att bristfällig och grov homogenisering av resultat hjärnvävnad i kopiösa mängder av cellfragment ses av mikroskopi och flödescytometri. Cellfragment kan också uppstå av att inte anstränga hjärnan homogenatet med lämplig storlek cellen sil. Korrekt uppmärksamhet på detaljer är nyckeln för att förbereda god och tillräcklig BILS för vidare experimenterande och analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag NS64571 från NINDS (CLH), genom en tidig karriär utmärkelse från Mayo Clinic (CLH), och genom en generös gåva från Donald och Frances Herdrich (CLH). Vi vill tacka de Mayo Clinic Kärna flödescytometrisystem för hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalge Nunc international | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche Group | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder | Fisher Scientific | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Biosciences | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman Coulter Inc. | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter Inc. | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | eBioscience | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | eBioscience | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. B. rown, , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
- Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
