Summary
हम यहाँ चूहे और मानव नाक cavities से घ्राण mucosa biopsying के लिए एक विधि का वर्णन. इन बायोप्सी या तो मस्तिष्क रोगों में आणविक विसंगतियों की पहचान करने या multipotent वयस्क स्टेम कोशिकाओं है कि मस्तिष्क आघात / रोग के पशु मॉडल में कोशिका प्रत्यारोपण के लिए उपयोग किया जा सकता है अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. चूहे में घ्राण mucosa का संग्रह
- तीन 35 मिमी पेट्री / DMEM हैम F12 एक साफ संस्कृति हुड में संस्कृति के माध्यम से भरा व्यंजन की तैयारी द्वारा शुरू करो.
- इच्छामृत्यु की कोई विधि अग्रिम में संस्था जानवरों की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए और योग्य कर्मियों द्वारा बाहर किए गए. बाद चूहे सोडियम / ketamine xylazine जैसे संज्ञाहरण के pentobarbital या अन्य इंजेक्शन रूपों के साथ गहरे संज्ञाहरण में प्रवेश किया है, सिर काटना, और त्वचा को हटा दें. Inhalant anesthetics बचा जाना चाहिए. संज्ञाहरण की पर्याप्तता पैर के अंगूठे चुटकी से मूल्यांकन किया जाएगा कत्ल करने के लिए पहले. कैंची के साथ निचले जबड़े निकालें और एक rongeur की मदद के साथ, दोनों पक्षों पर चेहरे की मांसपेशियों को समाप्त.
- Incisors के पीछे से शुरू है, एक rongeur नाक गुहा, एक समय में एक पक्ष को कवर हड्डी के साथ हटा दें. घ्राण turbinates दृष्टि में आने के रूप में अंगों / नारंगी भूरे रंग के नाक के पीछे में स्थित है.
- नाजुक एक संदंश के साथ turbinates त्यागें. सीधा प्लेट, cribriform थाली और नाक गुहा की छत की चाप: एक 26 गेज सुई का प्रयोग, घ्राण तीन लाइनों के साथ ऊतक काटने से पट पर झूठ बोल mucosa अलग.
- दोनों पक्षों पर बायोप्सी लीजिए और DMEM / हैम F12 भरा पेट्री डिश में उन्हें हस्तांतरण. यह प्रक्रिया अब शुरुआत इच्छामृत्यु से 10 मिनट से अधिक नहीं लेना चाहिए.
- अब, क्रम में बलगम निकालने के के लिए, मध्यम भरे पेट्री डिश में दो बार बायोप्सी हस्तांतरण.
2. घ्राण mucosa के मानव में संग्रह
- यह प्रक्रिया एक कान, नाक और गला (ईएनटी) सर्जन के द्वारा किया जाना चाहिए प्रासंगिक स्थानीय नैतिक समिति (ओं) के अनुसार, और हर आउट पेशेंट एक सूचित सहमति फार्म पर हस्ताक्षर करना चाहिए.
- 0 ° या 30 ° कठोर endoscope के (4 मिमी व्यास) का उपयोग करना, दोनों नाक cavities के निरीक्षण और जंतु या किसी भी भड़काऊ घाव के ख्यात उपस्थिति का आकलन. चुनें सबसे अच्छा नाक गुहा, खाते में पट के विचलन ले.
- एक कपास applicator का प्रयोग, एपिनेफ्रीन के साथ 10 मिनट के लिए एक स्थानीय चतनाशून्य करनेवाली औषधि lidocaine के रूप में लागू है.
- Throughcut सलाखें संदंश के साथ, एक दो वर्ग मिलीमीटर बायोप्सी या तो इकट्ठा मध्यम turbinate की औसत दर्जे का पहलू की जड़ में या dorsomedial क्षेत्र में पट पर.
- घ्राण बायोप्सी तो, स्थानांतरित कर रहा है एक बाँझ सुई का उपयोग कर एक बाँझ 2 मिलीलीटर DMEM / हैम F12 1 मिलीलीटर के साथ भर ट्यूब में. ट्यूब उल्टा नीचे टिप को यकीन है कि बायोप्सी मध्यम संस्कृति में डूब जाता है.
- ट्यूब को एक प्रशीतित कंटेनर में डालें और यह अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए परिवहन. इस स्तर पर, बायोप्सी से प्रति तुलनात्मक आणविक विशिष्ट मस्तिष्क रोगों पर ध्यान केंद्रित या स्टेम सेल पैदा करने के लिए कार्रवाई के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकते हैं.
3. मानव और चूहा mucosa से घ्राण स्टेम सेल के अलगाव
- DMEM / हैम F12 में बायोप्सी धो लें. Dispase द्वितीय समाधान (2.4 आइयू / एमएल) का 1 मिलीलीटर के साथ भरा एक पेट्री डिश में बायोप्सी सेते हैं, 37 पर 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस
- अगले, एक diffracted औंधा प्रकाश के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत, घ्राण उपकला अंतर्निहित लामिना propria से एक सूक्ष्म रंग का उपयोग कर निकाल दिया जाता है.
- घ्राण उपकला पतली है और लामिना propria जो धारीदार है की तुलना में एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर पारदर्शी लगता है / नारंगी भूरे रंग के. एक सफेद पृष्ठभूमि पर ग्रे उपकला और लामिना propria, भूरे रंग दिखता है.
- एक बार शुद्ध, DMEM / हैम F12 के साथ भरा एक पेट्री डिश में लामिना propria हस्तांतरण.
- अगर ऊतक एक कृंतक से है, तो छोटे - छोटे टुकड़ों में दो 25 गेज सुई के साथ लामिना propria में कटौती. फिर, एक 15 मिलीलीटर collagenase आइए के 1 मिलीलीटर से भरा ट्यूब के टुकड़े हस्तांतरण.
- ट्यूब में, एक बाँझ प्लास्टिक विंदुक का उपयोग, ऊतक अलग कर देना. फिर, 10 मिनट के लिए 37 ट्यूब सेते डिग्री सेल्सियस
- हदबंदी को समाप्त करने के लिए, धीरे ट्यूब रॉक और Ca मुक्त और मिलीग्राम मुक्त पीबीएस के 9 मिलीग्राम और 5 मिनट के लिए 200 ग्राम पर अपकेंद्रित्र जोड़ें.
- सेल गोली Resuspend / DMEM हैम F12 संस्कृति 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, एंटीबायोटिक दवाओं और प्लास्टिक की संस्कृति बर्तन पर थाली के साथ पूरक मध्यम में.
- अब, अगर ऊतक मानव है, तो 200 से 500 सुक्ष्ममापी से लेकर एक मोटाई के साथ 3 से 4 टुकड़ों में लामिना propria टुकड़ा.
- अपने स्वयं के 2 सेमी व्यास संस्कृति पकवान में प्रत्येक पट्टी सम्मिलित करें, और बाँझ 1.3 सेमी व्यास का गिलास को कवर फिसल जाता है के साथ ऊतक कवर.
- फिर, प्रत्येक संस्कृति डिश के लिए संस्कृति के माध्यम से 500 μl (DMEM / हैम F12 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक) जोड़ने.
- या तो ऊतक प्रकार के लिए हर 2 से 3 दिनों संस्कृति के माध्यम नवीनीकृत.
- पांच से सात दिनों के बाद, स्टेम सेल संस्कृति डिश आक्रमण शुरू और दो सप्ताह के बाद वे मिला हुआ होना चाहिए. मार्ग है, जब confluency तक पहुँच जाता है और संस्कृति बोतल के लिए कोशिकाओं हस्तांतरण.
4. क्षेत्रः संरचना और Neuronal Differeघ्राण स्टेम सेल के ntiation
- स्टेम सेल क्षेत्रों उत्पन्न करने के लिए, 37 पर दो घंटे के लिए बोतल सेते ° सी पाली एल lysine साथ. (पाठ: 5 g/cm2).
- बोतल में इलाज वर्ग सेंटीमीटर प्रति 16,000 कोशिकाओं के घनत्व प्लेट में कोशिकाओं.
- हर दो दिन, 0.2ml (DMEM / हैम F12 इंसुलिन, transferrin, सेलेनियम (इसके एक्स, 1%), (50 एनजी / एमएल) EGF और (FGF2 के साथ पूरक पूरक मध्यम वर्ग सेंटीमीटर प्रति के साथ कोशिकाओं फ़ीड 50 एनजी / ) मिलीलीटर).
- दो से पांच दिनों के बाद, अस्थायी सेल क्षेत्रों और या तो फिर से थाली इकट्ठा या सेल थेरेपी के पशु मॉडल में कलम बांधने का काम पहले उन्हें अलग कर देना.
- न्यूरॉन की तरह कोशिकाओं में घ्राण स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए, उन्हें Neurobasal माध्यम से 21 दिनों बी 27, पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन glutamine, और ग्लूटामेट युक्त करने के लिए खेती.
- फिर हर 3 दिनों मध्यम परिवर्तन कर. न्यूरॉन कोशिकाओं की तरह दो से तीन सप्ताह के बाद दिखाई देनी चाहिए.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
नाक मानव explant outgrowing स्टेम कोशिकाओं (चित्रा 2A) तेजी से विभाजित कर रहे हैं और एक से दो सप्ताह के भीतर confluency पहुँचा जा सकता है है. Stemness की एक प्रमुख विशेषता, nestin अभिव्यक्ति, (चित्रा 2B) मूल्यांकन किया गया था. जब एक सीरम मुक्त संस्कृति (50 एनजी / एमएल) EGF और FGF2 (50 एनजी / एमएल) के साथ पूरक मध्यम के साथ पाली एल lysine पर हो, घ्राण स्टेम कोशिकाओं क्षेत्रों (आंकड़ा 2C) को जन्म दे. जब सीरम युक्त संस्कृति के माध्यम में हो नव मढ़वाया क्षेत्रों GFAP-व्यक्त कोशिकाओं (~ 50%), ट्यूबिलिन व्यक्त कोशिकाओं (~ 10-15%) और O4 व्यक्त कोशिकाओं (~ 2-5%) (9 आंकड़े को जन्म दे 2 डी एफ). हालांकि, क्षेत्र व्युत्पन्न कोशिकाओं के भाग्य को संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, जब Neurobasal संस्कृति B27 और ग्लूटामेट, नाक न्यूरॉन की तरह β-III (चित्रा 2 जी) ट्यूबिलिन और MAP2 (चित्रा 2H) व्यक्त की कोशिकाओं में घ्राण स्टेम कोशिकाओं के अधिकांश के साथ पूरक मध्यम में हो.
चित्रा 1 प्रयोग के समग्र योजना. घ्राण mucosa बायोप्सी चूहे या मानव नाक गुहा से excised हैं. Explants से प्रति तुलनात्मक आणविक मस्तिष्क रोगों में biomarkers की पहचान करने के लिए लक्ष्य के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. घ्राण स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए, लामिना propria के बीच बातचीत और न्यूरो उपकला dispase द्वितीय एंजाइम के साथ बाधित कर रहे हैं और 45 मिनट के बाद उपकला एक सूक्ष्म रंग के साथ हटा दिया जाता है. कृंतक घ्राण स्टेम कोशिकाओं आगे collagenase आइए साथ लामिना propria अलग द्वारा चयनित हैं. मानव ऊतक के लिए, घ्राण लामिना propria के टुकड़े कांच coverslip के तहत सुसंस्कृत हैं जब तक outgrowing स्टेम कोशिकाओं पूरी अच्छी तरह से आक्रमण. प्रसार के बाद, एक उपयुक्त संस्कृति माध्यम का उपयोग करते हुए, घ्राण स्टेम कोशिकाओं क्षेत्रों उत्पन्न या न्यूरॉन की तरह कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं. घ्राण स्टेम कोशिकाओं मैं इस्तेमाल किया जा सकता है) की मरम्मत मस्तिष्क रोगों या आघात या ii) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों के आणविक मार्कर की पहचान. रेखांकन Servier मेडिकल कला की मदद के साथ बना रहे हैं.
चित्रा 2 संस्कृति और नाक मानव घ्राण स्टेम कोशिकाओं की भिन्नता. मानव स्टेम कोशिकाओं लामिना propria explant (ए) के बाहर से बढ़ तेजी से विभाजित कर रहे हैं, जब एक सीरम युक्त मध्यम में खेती. स्टेम सेल stemness मार्कर nestin (बी) व्यक्त करते हैं. जब पाली एल lysine-लेपित प्लास्टिक पर चढ़ाया और सीरम मुक्त EGF और FGF2 के साथ पूरक एक संस्कृति माध्यम में खेती, घ्राण स्टेम कोशिकाओं क्षेत्रों (सी) को उत्पन्न करते हैं. क्षेत्रः व्युत्पन्न कोशिकाओं, जब सीरम युक्त संस्कृति के माध्यम में चढ़ाया, जन्म दे करने के लिए GFAP व्यक्त कोशिकाओं (~ 50%), ट्यूबिलिन व्यक्त कोशिकाओं (~ 10-15%) और O4 व्यक्त कोशिकाओं (~ 2-5%) 9 (लोमो). जब Neurobasal संस्कृति B27 और ग्लूटामेट के साथ पूरक मध्यम में हो, वे न्यूरॉन की तरह β-III (G) ट्यूबिलिन और MAP2 (एच) व्यक्त की कोशिकाओं में अंतर है.
Discussion
तकनीक यहाँ प्रस्तुत कृंतक और neurodevelopmental और neurodegenerative रोगों के रूप में अच्छी तरह के रूप में रोग या मस्तिष्क आघात की मरम्मत के लिए एक उपकरण के कारणों में मानव घ्राण mucosa नैदानिक अनुसंधान के लिए एक उपयोगी मॉडल बनाने. प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है और आसानी से एक अनुभवी सेल जीवविज्ञानी द्वारा किया जा सकता है बाहर ले. बायोप्सी और संस्कृति तकनीक के लिए सफलता की दर अधिक है.
महत्वपूर्ण कदम
- कृंतक घ्राण mucosa के संग्रह के लिए, यह इच्छामृत्यु और घ्राण ऊतक के अंतिम छांटना के बीच 10 मिनट की एक समय सीमा से अधिक नहीं करने के लिए सिफारिश की है.
- कृंतक घ्राण लामिना propria के पृथक्करण आमतौर पर 10 मिनट के बाद हासिल की है. collagenase आइए में ऊष्मायन. यदि नहीं, तो हम सतह पर तैरनेवाला लामिना propria नाव के undissociated टुकड़े, जिसमें यह 200 ग्राम में अपकेंद्रित्र और यंत्रवत् अलग कर देना अस्थायी लामिना का उपयोग कर एक अच्छी तरह से नई कोशिकाओं replating से पहले एक पाश्चर विंदुक के बाद दिन इकट्ठा करने की सलाह देते हैं. पहले अच्छी तरह से पहले से ही जुड़ी कोशिकाओं से युक्त ताजा संस्कृति के माध्यम से भरा है.
- मानव लामिना propria, जो कृंतक ऊतकों की तुलना में और अधिक कॉम्पैक्ट है के लिए, हम एक enzymatic पृथक्करण सिफारिश नहीं है. ऊतक कटा हुआ है और प्रत्येक explant प्लास्टिक पकवान के नीचे और एक गिलास coverslip के बीच डाला जाता है. सफल संस्कृतियों explants जिनकी मोटाई रेंज 200 से 500 सुक्ष्ममापी तक शामिल हैं.
संभावित संशोधनों
- वर्तमान प्रोटोकॉल थोड़ा क्रम में इन विट्रो में घ्राण न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए संशोधित कर सकते हैं. उस प्रयोजन के लिए, न्यूरो उपकला और हटाया नहीं पूरे घ्राण mucosa की एक McIlwain हेलिकॉप्टर (200 सुक्ष्ममापी मोटाई) के साथ कटा हुआ है. प्रत्येक explant एक डिश में चढ़ाया हुआ है, आंशिक रूप से एक घंटे के लिए सूखे और फिर FCS युक्त मध्यम संस्कृति के साथ rehydrated है. पहले दिन पोस्ट चढ़ाना के दौरान उपकला और mesenchymal कोशिकाओं explant से बाहर हो जाना. फिर, न्यूरॉन progenitors इस सेल परत के शीर्ष पर विस्थापित और न्यूरॉन्स में अंतर होगा.
- घ्राण स्टेम कोशिकाओं के शोधन प्रवाह cytometry का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है है. विशिष्ट सतह मार्करों लक्षण वर्णन कागज 11 में प्रकाशित की गई सूची में से लिया जा सकता है है.
- प्रत्यारोपण के प्रयोगों के लिए, यह चूहों जिसका घ्राण स्टेम सेल GFP पॉजिटिव के एक तनाव का उपयोग करने के लिए संभव है. यह चूहा तनाव (Sprague Dawley, EGFP PGK प्रमोटर द्वारा संचालित) ITERT (नेंट्स, फ्रांस) पर उपलब्ध है. GFP मानव घ्राण स्टेम कोशिकाओं में जीन डालने के लिए, हम एक lentivirus संक्रमण के आधार पर विधि का उपयोग करें.
- इस कागज घ्राण ecto mesenchymal स्टेम सेल पर केंद्रित है. हालांकि, ब्याज, घ्राण ensheathing कोशिकाओं, का एक और सेल प्रकार एक ही ऊतकों से शुद्ध किया जा सकता है. हम उनके संग्रह और 1,17 शुद्धि के लिए एक विधि का वर्णन है और हम एक चरण मैं / IIa paraplegic 18 रोगियों में चिकित्सीय परीक्षण के लिए मानव नाक ensheathing कोशिकाओं का इस्तेमाल किया.
- Mesenchymal स्टेम सेल superfamily के एक सदस्य के रूप में, ँ MSCs कर रहे हैं, उचित संस्कृति की शर्तों के तहत, adipocytes osteocytes, और 11 myocytes में अंतर है.
भविष्य अनुप्रयोगों
- हम पहले से ही मानव घ्राण बायोप्सी आत्मकेंद्रित, द्विध्रुवी विकार, पारिवारिक दुःस्वायत्तता, पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग और 2-7 एक प्रकार का पागलपन के साथ रोगियों में सेलुलर और आणविक विसंगतियों के अध्ययन का इस्तेमाल किया है. सिद्धांततः, सभी मस्तिष्क रोगों नाक बायोप्सी या परिधीय घ्राण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है.
- कृंतक और मानव नाक घ्राण स्टेम कोशिकाओं को पहले से ही भूलने की बीमारी, पार्किंसंस रोग, cochlear नुकसान और रीढ़ की हड्डी 12-16 आघात के पशु मॉडल में grafted किया गया है. यह अल्जाइमर रोग, मस्तिष्क ischemia, एकाधिक काठिन्य के पशु मॉडल में इन कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए बोधगम्य है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम आर्थिक ANR (Agence Nationale डे ला Recherche) AFM (एसोसिएशन Française contre les myopathies), PACA और IRME में Feder (Institut डी Recherche सुर ला Moelle épinière एट Encéphale l') द्वारा समर्थित किया गया. हम कृतज्ञता मैरी पियरे Blanchard (जीन रॉश संस्थान) को समय चूक रिकॉर्डिंग के दौरान उसे कुशल मदद के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection of olfactory mucosa in rats | |||
| DMEM/HAM F12 | Invitrogen | 31331-028 | |
| Sodium Pentobarbital | |||
| Rongeur | Fine Science Tools | ||
| 26 gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN-2613R | |
| Forceps | |||
| Collection of olfactory mucosa in humans | |||
| Rigid endoscope | Karl Storz or Richard Wolf Medical | ||
| Lidocaine | |||
| Epinephrine | |||
| Throughcut ethmoid forceps | Karl Storz or Richard Wolf Medical | ||
| Isolation of olfactory stem cells | |||
| Dispase II | Roche Group | 10 295 825 001 | |
| Dissecting microscope | |||
| Micro spatula | Fine Science Tools | ||
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Ca-free/Mg-free PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 10270098 | |
| Glass coverslip | Knittel Glaser | 001/35 | |
| Sphere formation and neuronal differentiation | |||
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| Insulin transferrin selenium (ITS) | Invitrogen | 51500056 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030024 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich |
References
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