Summary
We beschrijven hier een methode voor biopsying olfactorische slijmvlies van de rat en mens neusholten. Deze biopten kunnen worden gebruikt voor zowel het identificeren van moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten of isoleren van multipotente volwassen stamcellen die gebruikt kunnen worden voor mobiele transplantatie in diermodellen van de hersenen trauma / ziekte.
Abstract
De olfactorische mucosa, gelegen in de neusholte, is belast met het opsporen van geuren. Het is ook de enige zenuwweefsel dat is blootgesteld aan de externe omgeving en goed bereikbaar in elk levend individu. Als gevolg hiervan, dit weefsel is uniek voor iedereen gericht op moleculaire afwijkingen in de hersenen pathologische identificeren of volwassen stamcellen te isoleren voor celtherapie.
Moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten zijn vaak bestudeerd met behulp van zenuwweefsel monsters verzameld post-mortem. Echter, dit materiaal heeft tal van beperkingen. In tegenstelling, de olfactorische slijmvlies is gemakkelijk toegankelijk en kan veilig worden gebiopteerd, zonder enig verlies van reukvermogen 1. Dienovereenkomstig, de olfactorische slijmvlies biedt een "open venster" in het volwassen menselijk waardoor men kan studeren ontwikkelingsstoornissen (bijv. autisme, schizofrenie), 2-4 of neurodegeneratieve (bijvoorbeeld Parkinson, Alzheimer) ziekten 4,5. Olfactorische mucosa kan worden gebruikt voor zowel vergelijkende moleculaire studies 4,6 of in vitro experimenten op neurogenese 3,7.
Het reukepitheel is ook een zenuwweefsel dat nieuwe neuronen produceren elke dag te vervangen die beschadigd zijn door vervuiling, bacteriële van virale infecties. Deze permanente neurogenese wordt ondersteund door voorlopers, maar ook stamcellen die binnen beide compartimenten van het slijmvlies, namelijk de neuroepithelium en de onderliggende lamina propria 8-10. We hebben onlangs een methode ontwikkeld om de volwassen stamcellen zich in de lamina propria zuiveren en, nadat aangetoond dat ze nauw verbonden zijn met het beenmerg mesenchymale stamcellen (BM-MSC), noemden we ze olfactorische ecto-mesenchymale stamcellen (OE- MSC) 11.
Interessant is dat in vergelijking met de BM-MSC's, OE-MSC's tonen een hoge proliferatie tarief, een verhoogde clonogenicity en een neiging om te differentiëren naar neurale cellen. We hebben voordeel van deze kenmerken studies gewijd aan de nieuwe kandidaat-genen in schizofrenie en de ziekte van Parkinson 4 onthullen uit te voeren. Wij en anderen hebben ook aangetoond dat de OE-MSC's in aanmerking komen voor celtherapie veelbelovend, na een ruggenmerg trauma 12,13, een cochleaire schade 14, of in een diermodellen van de ziekte van Parkinson 15 of 16 geheugenverlies.
In deze studie presenteren we methoden om olfactorische slijmvlies biopsie bij ratten en mensen. Na het verzamelen, is de lamina propria enzymatisch gescheiden van het epitheel en de stamcellen worden gezuiverd met behulp van een enzymatische of een niet-enzymatische methode. Gezuiverde olfactorische stamcellen kunnen dan ofwel die in grote aantallen en opgeslagen in vloeibare stikstof of aangezet tot sferen vorm of gedifferentieerd in neurale cellen. Deze stamcellen kunnen ook worden gebruikt voor vergelijkende omica (genomische, transcriptoom, epigenomisch, proteoom) studies.
Protocol
1. Het verzamelen van Olfactorische slijmvlies in ratten
- Begin met het opstellen van drie 35 mm petrischalen gevuld met DMEM / HAM F12 kweekmedium in een schone cultuur kap.
- Een methode van euthanasie moet vooraf worden goedgekeurd door dier van de instelling zorg en het gebruik commissie en uitgevoerd door gekwalificeerd personeel. Nadat de rat is aangegaan diepe narcose met natrium-pentobarbital of andere injecteerbare vormen van anesthesie, zoals ketamine / xylazine, onthoofden en verwijder de huid. Inhalatieoplossing anesthetica moeten worden vermeden. Toereikendheid van de anesthesie zal worden beoordeeld door de teen knijpen voorafgaand aan de onthoofding. Verwijder de onderkaak met een schaar en met de hulp van een rongeur, elimineren de gelaatsspieren aan beide zijden.
- Vanaf de achterkant van de snijtanden, verwijderen met een rongeur het bot met betrekking tot de neusholte, een kant tegelijk. De olfactorische neusschelpen komen in zicht als oranje / bruin organen zich in de achterkant van de neus.
- Voorzichtig verwijderen van de neusschelpen met een pincet. Met behulp van een 26 gauge naald, de oorzaak van het olfactorische slijmvlies liggend op het septum door te snijden van het weefsel langs drie lijnen: de boog van de loodrechte plaat, de getralied plaat en het plafond van de neusholte.
- Verzamel biopsies aan beide kanten en zet ze in een DMEM / HAM F12 gevulde petrischaal. Deze procedure mag niet langer duren dan 10 minuten van het begin euthanasie.
- Nu, om het slijm te verwijderen, overdracht van de biopten twee keer in het midden-gevulde petrischalen.
2. Het verzamelen van Olfactorische slijmvlies bij mensen
- Deze procedure moet worden uitgevoerd door een Oor Neus en Keel (KNO) chirurg, in overeenstemming met de relevante lokale ethische commissie (s), en iedere polikliniek moet een informed consent formulier ondertekenen.
- Met behulp van een 0 ° of 30 ° stijve endoscoop (4 mm diameter), controleer beide neusholten en beoordeling van de vermeende aanwezigheid van poliepen of een inflammatoire laesie. Kies de beste neusholte, rekening houdend met de afwijking van het septum.
- Met behulp van een katoenen applicator, toepassen van een plaatselijke verdoving, zoals lidocaïne met adrenaline, gedurende 10 minuten.
- Met een throughcut ethmoid tang, hetzij bij een twee vierkante millimeter biopsie aan de wortel van de mediale aspect van de middelste turbinate of op het septum in het dorsomediale gebied.
- De olfactorische biopsie wordt dan overgebracht, met een steriele naald, in een steriele 2 ml buis gevuld met 1 ml DMEM / HAM F12. Tip de buis ondersteboven om ervoor te zorgen dat de biopsie wordt ondergedompeld in het kweekmedium.
- Steek de buis in een gekoelde container en het transport naar het onderzoekslaboratorium. In dit stadium kan de biopsie worden gebruikt per se voor vergelijkende moleculaire studies gericht zijn op specifieke hersenaandoeningen of verwerkt voor het genereren van stamcellen.
3. Isolatie van Olfactorische stamcellen uit menselijke en Rat slijmvlies
- Was de biopten in DMEM / HAM F12. Incubeer de biopten in een petrischaal gevuld met 1 ml van dispase II-oplossing (2,4 IU / ml), gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Vervolgens onder een microscoop met dissectie een gebogen omgekeerd licht, is het reukepitheel verwijderd van de onderliggende lamina propria met behulp van een micro-spatel.
- Het reukepitheel is dunner en ziet er translucent over een zwarte achtergrond in vergelijking met de lamina propria die is gestreept oranje / bruin. Over een witte achtergrond, het epitheel ziet er grijs en de lamina propria, bruin.
- Eenmaal gezuiverd, overdracht van de lamina propria in een petrischaal gevuld met DMEM / HAM F12.
- Als het weefsel is van een knaagdier, knip dan de lamina propria in kleine stukjes met twee 25 gauge naalden. Dan overdracht van de stukken om een 15 ml buis gevuld met 1 ml collagenase IA.
- In de buis, met behulp van een steriele plastic pipet, dissociëren het weefsel. Vervolgens wordt de buis incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Tot beëindiging van de dissociatie, schud de buis en voeg 9 ml Ca-Mg-vrij en vrij PBS en centrifugeer bij 200 g gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de celpellet in DMEM / HAM F12 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal kalf serum, antibiotica en de plaat op plastic cultuur gerechten.
- Nu, als het weefsel mens is, dan snijd de lamina propria in 3 tot 4 stukken met een dikte van 200 tot 500 pm.
- Steek elke strip in een eigen 2 cm diameter cultuur schotel en bedek het weefsel met steriele 1,3 cm diameter glazen dekglaasjes.
- Dan, voeg 500 ul kweekmedium (DMEM / HAM F12 aangevuld met 10% foetaal kalf serum en antibiotica) om elke cultuur gerecht.
- Voor beide weefsel type, vernieuwen van de cultuur medium om de 2 tot 3 dagen.
- Vijf tot zeven dagen na, zal stamcellen beginnen met de cultuur schotel binnen te vallen en na twee weken moeten ze worden confluent. Wanneer confluentie bereikt is, passage en de overdracht van de cellen aan de cultuur kolven.
4. Sphere Vorming en neuronale Differentiation van olfactorische Stem Cells
- Voor het genereren van stamcellen bollen, incubeer de kolven gedurende twee uur bij 37 ° C met poly-L-lysine. (TEXT: 5 g/cm2).
- Het bord van de cellen bij een dichtheid van 16.000 cellen per vierkante centimeter in de behandelde kolven.
- Om de twee dagen, voeden de cellen met 0,2 ml per vierkante centimeter aangevuld medium (DMEM / HAM F12 aangevuld met insuline, transferrine, selenium (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) en FGF2 (50 ng / ml)).
- Twee tot vijf dagen later, het verzamelen van drijvend cel sferen en een re-plaat of losmaken voordat enten in diermodellen van celtherapie.
- Om onderscheid te olfactorische stamcellen in neuron-achtige cellen, kweken ze gedurende 21 dagen in Neurobasal medium met B-27, penicilline, streptomycine, glutamine en glutamaat.
- Maak medium verandert elke drie dagen. Neuron-achtige cellen zou moeten verschijnen na twee tot drie weken.
5. Representatieve resultaten:
Neus menselijke explant-ontgroeien stamcellen (Figuur 2A) zijn snel delende en confluentie kunnen bereiken binnen een tot twee weken. Een belangrijk kenmerk van stemness, Nestin expressie, werd geëvalueerd (figuur 2B). Wanneer gekweekt op poly-L-lysine met een serum-vrij kweekmedium aangevuld met EGF (50 ng / ml) en FGF2 (50 ng / ml), olfactorische stamcellen aanleiding geven tot bollen (figuur 2C). Wanneer ze groeien in serum-bevattend kweekmedium nieuw vergulde bollen aanleiding geven tot GFAP expressie cellen (~ 50%), tubuline expressie cellen (~ 10-15%) en O4 expressie cellen (~ 2-5%) 9 (Cijfers 2D-F). Kan echter het lot van de bol-afgeleide cellen worden aangepast. Bijvoorbeeld, wanneer ze groeien in een Neurobasal kweekmedium aangevuld met B27 en glutamaat, het grootste deel van de nasale olfactorische stamcellen in neuron-achtige cellen die β-tubuline III (figuur 2G) en MAP2 (figuur 2H).
Figuur 1. Algehele opzet van het experiment. Olfactorische slijmvlies biopten worden uitgesneden uit rat of menselijke neusholte. Explanten kan worden gebruikt per se voor vergelijkende moleculaire studies gericht op biomarkers bij hersenziekten te identificeren. Voor het isoleren van olfactorische stamcellen, zijn de interacties tussen de lamina propria en de neuro-epitheel verstoord met de dispase II enzym, en na 45 minuten, het epitheel wordt verwijderd met een micro-spatel. Knaagdier olfactorische stamcellen worden verder geselecteerd door dissociatie van de lamina propria met collagenase IA. Voor menselijk weefsel, zijn stukjes van olfactorische lamina propria gekweekt onder glas dekglaasje totdat ontgroeien stamcellen binnen te dringen het geheel goed. Na de proliferatie, met behulp van een geschikt kweekmedium, kan olfactorische stamcellen te genereren bollen of differentiëren naar neuron-achtige cellen. Olfactorische stamcellen kunnen worden gebruikt om i) te repareren hersenziekten of trauma of ii) identificeren van moleculaire merkers van het centrale zenuwstelsel ziekten. Illustraties zijn gemaakt met de hulp van Servier Medical Art.
Figuur 2. Cultuur en differentiatie van nasale menselijke olfactorische stamcellen. Menselijke stamcellen uit de lamina propria explantatie (A) groeit snel delende, toen gecultiveerd in een serum-bevattend medium. Stamcellen express de stemness marker Nestin (B). Wanneer geplateerd op poly-L-lysine-gecoate kunststof en gekweekt in een serum-vrije cultuur medium aangevuld met EGF en FGF2, olfactorische stamcellen te genereren bollen (C). Sphere-afgeleide cellen, wanneer uitgeplaat in serum-bevattende kweekmedium, aanleiding geven tot GFAP expressie cellen (~ 50%), tubuline expressie cellen (~ 10-15%) en O4 expressie cellen (~ 2-5%) 9 (DF). Wanneer ze groeien in een Neurobasal kweekmedium aangevuld met B27 en glutamaat, ze differentiëren tot neuron-achtige cellen die β-III tubuline (G) en MAP2 (H).
Discussion
De technieken die hier maken het knaagdier-en menselijke reuk slijmvlies een nuttig model voor klinisch onderzoek naar de oorzaken van neurologische en neurodegeneratieve ziekten en als een instrument voor het herstellen van de pathologische of getraumatiseerd hersenen. Het protocol is betrekkelijk eenvoudig en kan gemakkelijk worden uitgevoerd door een ervaren celbioloog. Het slagingspercentage voor de biopsie en de cultuur technieken is hoog.
Kritische stappen
- Voor het verzamelen van knaagdieren olfactorische mucosa, wordt aanbevolen om geen tijdslimiet van 10 minuten tussen euthanasie en de uiteindelijke excisie van de olfactorische weefsel overschrijden.
- De dissociatie van het knaagdieren olfactorische lamina propria wordt gewoonlijk bereikt na 10 minuten. incubatie in collagenase IA. Zo niet, dan raden wij u aan de dag verzamelen na de supernatant waarin ongedissocieerde stukjes van de lamina propria float, het centrifugeren bij 200 g en mechanisch dissociëren de drijvende lamina met behulp van een Pasteur pipet voor replating de cellen in een nieuwe put. De eerste goed met de reeds aan cellen is gevuld met vers kweekmedium.
- Voor de menselijke lamina propria, wat meer is compacter dan de knaagdieren weefsel, raden we een enzymatische dissociatie. Het weefsel is gesneden en elk Explantatie wordt ingevoegd tussen de bodem van de plastic schotel en een glas dekglaasje aan. Succesvolle culturen zijn explantaten waarvan de dikte van 200 tot 500 pm.
Eventuele wijzigingen
- Het huidige protocol kan enigszins worden gewijzigd om olfactorische neuronen in vitro te genereren. Voor dat doel is het neuro-epitheel niet verwijderd en het hele olfactorische mucosa is gesneden met een McIlwain chopper (200 micrometer dikte). Elke Explantatie is bedekt met een schotel, gedeeltelijk gedroogde gedurende een uur en daarna gerehydrateerd met FCS-bevattende kweekmedium. Tijdens de eerste dagen na de plating, epitheliale en mesenchymale cellen groeien uit de explantatie. Dan zal neuron voorouders migreren op de top van deze cel laag en differentiëren tot neuronen.
- Zuivering van olfactorische stamcellen kunnen worden bereikt met behulp van flow cytometrie. Specifieke oppervlakte merkers kunnen worden opgehaald uit de lijst die is gepubliceerd in de karakterisering papier 11.
- Voor de transplantatie-experimenten, is het mogelijk gebruik te maken van een stam van ratten, waarvan olfactorische stamcellen zijn GFP-positief. Deze rat stam (Sprague Dawley, eGFP gedreven door de PGK promoter) is beschikbaar op ITERT (Nantes, Frankrijk). Voor het invoegen van de GFP-gen in menselijke geur stamcellen maken wij gebruik van een methode gebaseerd op lentivirus infectie.
- Dit document is gericht op olfactorische ecto-mesenchymale stamcellen. Kan echter een ander celtype van belang, de olfactorische ensheathing cellen, worden gezuiverd van hetzelfde weefsel. We beschreven een methode voor de afvoer en zuivering 1,17 en we menselijke neus ensheathing cellen die worden gebruikt voor een fase I / IIa klinische studie bij dwarslaesie patiënten van 18.
- Als lid van de mesenchymale stamcellen superfamilie, OE-MSC's zijn in staat, onder de juiste kweekomstandigheden, om te differentiëren in adipocyten, osteocyten en myocyten 11.
Toekomstige toepassingen
- We hebben al gebruikt de menselijke reuk biopten cellulaire en moleculaire afwijkingen bij patiënten met autisme, bipolaire stoornis, familiale dysautonomie, de ziekte van Parkinson, Alzheimer en schizofrenie 2-7 te bestuderen. Theoretisch kunnen alle hersenaandoeningen worden bestudeerd met behulp van nasale biopsies of perifere olfactorische stamcellen.
- Knaagdier-en menselijke nasale olfactorische stamcellen zijn al geënt in diermodellen van geheugenverlies, de ziekte van Parkinson, cochleaire schade en het ruggenmerg trauma 12-16. Het is denkbaar om deze cellen te transplanteren in diermodellen van de ziekte van Alzheimer, de hersenen ischemie, Multiple sclerose.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Myopathie), Feder in PACA en IRME (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l'Encéphale). We dankbaar danken Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Instituut) voor haar een efficiënte hulp tijdens time lapse opname.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection of olfactory mucosa in rats | |||
| DMEM/HAM F12 | Invitrogen | 31331-028 | |
| Sodium Pentobarbital | |||
| Rongeur | Fine Science Tools | ||
| 26 gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN-2613R | |
| Forceps | |||
| Collection of olfactory mucosa in humans | |||
| Rigid endoscope | Karl Storz or Richard Wolf Medical | ||
| Lidocaine | |||
| Epinephrine | |||
| Throughcut ethmoid forceps | Karl Storz or Richard Wolf Medical | ||
| Isolation of olfactory stem cells | |||
| Dispase II | Roche Group | 10 295 825 001 | |
| Dissecting microscope | |||
| Micro spatula | Fine Science Tools | ||
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Ca-free/Mg-free PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 10270098 | |
| Glass coverslip | Knittel Glaser | 001/35 | |
| Sphere formation and neuronal differentiation | |||
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| Insulin transferrin selenium (ITS) | Invitrogen | 51500056 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030024 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich |
References
- Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).
- Ronnett, G. V. Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome. Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).
- Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia. Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).
- Matigian, N. Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders. Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).
- Arnold, S. E. Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease. Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).
- Boone, N. Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia. PLoS One. , (2010).
- McCurdy, R. D. Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses. Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).
- Roisen, F. J. Adult human olfactory stem cells. Brain Res. 890, 11-22 (2001).
- Murrell, W. Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa. Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).
- Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa. Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).
- Delorme, B. The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties. Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).
- Xiao, M. Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery. Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).
- Xiao, M. Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery. Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).
- Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss. Stem Cells. , (2011).
- Murrell, W. Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease. Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).
- Nivet, E. Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Mackay-Sim, A. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial. Brain. 131, 2376-2386 (2008).
