Summary
着床前の胚は、細胞の脱水を引き起こすことが高張凍結保護溶液中に配置した後に凍結保存することができます。平衡化後、氷の結晶形成は、胚を囲む溶液中で誘導される。胚は徐々に保管するための液体窒素中に急落する前に氷点下の気温に冷却されるとさらに脱水が発生します。
Abstract
牛、羊、ヤギから着床前の胚は、短期または長期の保管のために凍結保存することができます。着床前の胚では、水から主に構成されており、凍結保存の過程で細胞内氷晶形成の回避は、胚の生存性を維持するために極めて重要である。細胞内脱水を促進する浸透圧勾配を作成するには、例えばエチレングリコール（EG）やグリセロールなどの凍結防止剤（CPA）（GLYC）の - 胚は高張液（1.5 M 1.4）に置かれます。胚は、CPAの溶液中で浸透圧平衡に到達した後、それらを個別に凍結用の0.25ミリリットルプラスチックストローに高張CPAのソリューションにロードされます。胚は-6℃の温度で制御された速度の冷凍庫に入れられます氷の結晶の形成は、胚を囲むCPAの溶液中で誘導され、結晶化は、さらに細胞内脱水を引き起こし、胚の外側のCPAの濃度の増加を発生させます。胚は液体窒素（-196℃）に突入する前に-34 ° Cの温度に、さらに脱水が可能、0.5℃/分の速度で冷却される。凍結胚は、受信者（代理）メスに転送する前に解凍する必要があります。胚を含むストローは5秒〜3室温の空気で開催された液体窒素デュワーから削除、25〜30秒間37℃の水浴中に配置されます。胚は、受信者（代理の）女性への転送前にCPAを除去するための10分間のショ糖の1 M溶液中に配置されているGLYCで凍結保存。 EGで凍結保存胚は、しかし、直接受信者の子宮に転送される場合があります。
Protocol
1。凍結保存1の胚の適合性を評価する
- 個々のドナーの女性の生殖器官から採取した試料は実体顕微鏡を用いた評価に先立って10分間、等張胚保持媒体中に配置する必要があります。胚移植の子孫の家系の同定を可能にするために互いに独立した各ドナーの女性から胚を保つために一定である。
- 低倍率（≤10倍）を使用して、個々のドナーの女性からの検体は未受精卵の卵子で構成される別々のグループに分離されるべきである、胚、または譲渡品質の胚を縮退。同期受信者の女性は、品質、グレード3の胚と約25の転送後の妊娠率のために利用可能な限り、開発の拡張胚盤胞の段階を経てコンパクトな桑実胚でのみ品質のグレード1または2の胚は凍結保存に適しており、他のすべては（破棄される必要があります-30％）は許容範囲内と考えられます。
- 胚の透明帯が損なわれていないこととは素材が透明帯に付着（例えば、細胞、粘液）がないことを保証するために≥50倍の倍率で高品質のグレード1と拡張胚盤胞期の胚を介した2コンパクト桑実胚を検査する。ひび割れや欠落している透明帯付きまたは付着物質を有する透明帯を持つ任意の胚は、他の胚から分離されるべきであり、どちらか破棄するか別々に処理。
2。疾病伝播2の可能性を減らすために胚を洗浄
- 培地を洗浄する胚の最初のウェルに培地を保持している張胚の最小限の量で透明帯、無傷の胚（例えば、リン酸塩は生理食塩水の抗生物質とウシ血清アルブミン、新生児ウシ血清、またはポリビニルアルコールで補強バッファリング）に移動します。各ドナーの女性からの胚とは別に保管してください、と一度に10以上の胚を洗浄しないでください。連続希釈≥1:100を達成するために各連続洗浄に培地の最小限の量で胚を移動し、それぞれの連続した洗浄の間に変更されている無菌胚の取扱いのヒントを使用するようにしてください。
- の2.1に記載されてさらに4回洗濯しても胚を移動します。
- ウイルス性疾患の伝播が問題となる場合、最長で90秒のトリプシンに合計複合曝露時間については、0.25％トリプシン溶液に胚を2回洗浄する。
- twoトリプシン回洗浄後、2.1で説明したように胚の洗浄培地で5倍以上の胚を洗浄。
- 最終的な胚の洗浄の後、等張性胚への場所の胚は、メディアを保持する。
3。凍結保存3に前に胚を脱水
- 胚は、例えばエチレングリコールやグリセリンなどの凍結防止剤（CPA）の高張液（1.4から1.5モル濃度）に培地を保持している張胚の最小限の量で転送する必要があります。
- 彼らは浸透圧平衡に到達するまでの胚は凍結培地（高張CPA液）に座ってすることができます。エチレングリコールは、より急速にグリセロール、平衡化時間は、通常、グリセロール（10分）に比べてエチレングリコール（5分）での胚のための小さいしないより胚細胞に浸透しているため。胚の間と後にこの平衡化時間の一部を達成することができるストロー（次のステップで説明）にロードされます。
4。凍結保存のために0.25mlのプラスチックストローに胚のロード
- 胚のローディング装置に0.25mlのプラスチックストロー（11.5センチメートル作業長）の綿栓の端を取り付け、適切にラベル付けさわらに高張CPA液の約1.3センチメートルを吸引除去する。ラベリング手順の様々なわらシーリングプラグのどちらか、またはわらアダプタに接続された別のわらに接続されている印刷されたラベルの使用を含め、存在する。
- CPAソリューションからわらを削除し、藁の中で小さな気泡を作成するための空気の約0.15センチメートルを吸引除去する。
- わらに高張CPA液の約0.8 cmの単位で、単一の胚を吸引除去する。
- CPAソリューションからストローを取り出して、ストロー内の第小さな気泡（空気の泡が物理的に藁の中で胚を分離するのに役立つ）を作成するために空気の約0.15センチメートルを吸引除去する。
- わらの綿栓の端内に存在するポリ塩化ビニル（PVC）粉を湿らせてCPAソリューションの十分な量で描画する特定され、完全に藁を埋めるためにCPAのソリューションの約9.1センチメートルを吸引除去する。 CPAソリューションは、ゲルに塩ビの粉を発生させ、ストローの端部をシール。
- PVCの粉末、プラスチック製のストローのシーリングプラグ、またはヒートシーラーとわらのもう一方の端をシールします。
5。制御された速度の胚の冷凍機への胚の配置
- メタノール浴または液体窒素蒸気の凍結機のどちらかは、着床前の胚の凍結保存のためにプログラムすることができます。
- エンブリーを含むストローをロードする温度周囲温度から-6まで冷却された冷凍機へのOS℃に負荷のストローは、綿栓の終わりまで（プラスチック製のストローのシーリングプラグやわらアダプタは綿栓の端が下に置かれている場合には、使用されている場合を除く）。
- 胚は、先に進む前に、少なくとも2分間この温度で座ることができます。
6。種まき
- 一度胚は、-6に冷却している° C、トングを（または綿タッチして、わらの内部にCPAの溶液中で氷の結晶形成を誘導するために液体窒素（または液体窒素に浸漬綿棒）で過冷却トングのペアを使用します。胚の上または下のどちらかのソリューションの列に先端が棒）。
- CPAの溶液中の水は、液体窒素にさらされる領域では結晶化し、氷の結晶はすぐに胚を取り巻くCPAソリューションの列に広がってしまいます。
- さらに、冷却前に10分間、温度をシードで胚を保持する。
7。胚の継続的な脱水
- 0.5℃/ -34の温度にダウン分° Cの割合でクール胚この冷却速度は、胚の継続的な脱水性を確保することが重要です。
- -34で胚を保持℃で10分間液体窒素（-196℃）に胚を急落する前に。
- 場所は、適切に標識されたサトウキビに接続されて適切にラベル付けさゴブレット（液体窒素で満たされた）に胚を凍結保存し、短期または長期保存用液体窒素デュワーのキャニスターに杖を置く。
8。凍結保存胚の融解
- キャニスターは、以下のデュワーのフロストラインを保つように、液体窒素デュワーの首にキャニスターを引き出します。
- 融解する胚を含む杖を見つけ、迅速かつ慎重にゴブレットに他のストローを暖めるにならないようにという、ゴブレットからわらを取り除く。
- 追加の25〜30秒、37℃の水浴中に3〜5秒（ひび透明帯4の発生率を減少させる）ために空気中のわらを押しながら、水没。
- 、水浴からわらを削除わらを（藁で胚の識別を汚れに注意しながら）ワイプ、（藁の非綿プラグの端をチョキンと切るために藁切断装置を使用して、密封を使用して熱やPVCパウダー）、または慎重にどちらかのプラスチック製のシーリングプラグを取り外し、と。
- 同期胚の受信者に、可能な限り迅速に胚移植のデバイスとの転送に藁をロードする（ただし胚は、CPAとしてエチレングリコールを用いて凍結保存した場合のみ）、または
- ショ糖の1.0モル濃度（非透過した化合物）を含む皿上のわらの開放端を保持し、わらの綿栓の端を切断するはさみのペアを使用。わらの内容は自由にショ糖溶液にフローする必要がありますが、任意の残留媒体は藁内部に存在する場合はストローで空気の小さな列をプッシュする必要がある場合があります。胚を10分間蔗糖溶液の中に残さないようにして、10分のための媒体を保持する等張胚に胚を移す。胚を解凍後、新しいわらに負荷し、適切な受信者の女性への転送を評価する。
9。代表的な結果：
様々な要因は、妊娠に影響を及ぼすと同期受信者の女性5〜凍結融解初期胚の移転に起因する出生率を生きることができます。コンパクトな桑実胚よりも高度なまたは拡張胚盤胞よりも高度な発達段階での胚はしばしば同様にコンパクトな桑実胚、初期胚盤胞、胚盤胞、および胚発生の拡張胚盤胞の段階で胚などの凍結保存プロセスを生きていけない。品質のグレード1と2収量の胚の品質グレード3の胚は（一般的に低いため解凍後の妊娠率に凍結保存されていない）よりも高い解凍後の妊娠率。胚は低下妊娠率を示す可能性のある胚の凍結またはプロシージャを解凍胚中に誤って処理。その発情周期のドナーの女性のそれと同期していない受信者の女性に転送胚は通常、低妊娠率を生成する。 （例えば、生検または二等分） をin vitroで生成されるか、いくつかの方法で操作胚は通常より低い妊娠率が得られます。最適な条件下では、 生体由来胚の凍結融解の転送後に得られる妊娠率は、牛6,7、一般的に羊8,9,10,11 in 65から75パーセント、そしてヤギの60から70パーセント60から70パーセントです。 12,13,14,15。同様に、 体外生産胚の凍結融解の転送後に得られる妊娠率は、通常、牛6,16の40から50パーセント、羊17の25から35パーセント、およびヤギ18の30〜40％で。
BLE 1"/>同期受信者の女性に国内の反すう家畜種からの凍結融解胚の転送は、次の表1。予想される妊娠率。
Discussion
胚が水から主に構成されているため、それが着床前の胚は十分に脱水し、徐々に細胞内氷晶形成を回避するために本明細書に記載のプロトコルに従って冷却することが重要です。冷却プロセスが開始されると、それは、単方向の温度変化を維持するために、温度の変動を回避することが重要です。特定のCPAのソリューションのための適切な温度で氷の結晶の形成（"種まき"）の開始が重要です。
この徐冷/着床前の胚の凍結保存のための迅速な解凍方法に変更を加えると、一段階法（わらにロードされたメディアの最後の列には、ショ糖の代わりに、CPAのソリューションです）19と胚は、エチレングリコール中で凍結直接転送方法を（含まれています第一胚）20からのエチレングリコールを除去せずに解凍し、受信者の女性の子宮に直接転送されます。エチレングリコールの量を削減するため、直接転送（DT）受信者の女性の子宮に入金、それは6 CMは前述のように続行する前に培地を保持していると0.25mlのストローを記入することをお勧めします。それは自主的な標準がDTのために凍結保存し着床前の胚は黄色のストローで凍結し、液体窒素デュワーに黄色のゴブレットに格納するように商業的な胚移植の業界内で存在することに留意すべきである。コマーシャル業界にも従わなければならないすべての凍結保存胚のための固有のラベル表示要件があります。
この方法の1つの代替手段はガラス化21、より高濃度（6-8 M）CPAソリューションはCPAのソリューションは、氷なしで液体から"ガラス"状態に変化させる超急速に冷却され凍結保存の非平衡方式です。結晶形成。ガラス化は、その温度上昇の感受性のためにコンパクトな桑実胚よりも発育の高度な胚の凍結保存のために可能性が適しています。
この手法は、独自の遺伝資源の資源の保全22アプリケーションだけでなく、2008暦年に転送さ約50万ウシ初期胚の55％以上が凍結保存された国際的な商業胚移植の業界にしています。23
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
USDAマルチ状態の研究プロジェクトW - 2171"家畜の改善のための生殖細胞と胚発生と操作が"感謝されるから部分的な資金調達。この記事のビデオ部分のためのテクニカルイラストレーションを作成したライアンキャラハンの芸術的才能は、、また感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
| ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
| Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
| ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
| ViGrothaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
| Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
| BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
| Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
| ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
| SYNGROHolding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
| BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco's phosphate buffered saline |
| BioLifeBSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
| BioLifeantibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
| BioLifetrypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
| Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
| Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |
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