Summary
قد يكون سابق للانغراس الأجنة cryopreserved بعد التنسيب إلى حل واق من البرد مفرط التوتر يسبب الجفاف الخلوية. بعد موازنة ، يتم بفعل الجليد تشكيل الكريستال في حل المحيطة الجنين. مزيد من الجفاف كما يحدث يبرد ببطء لدرجات حرارة تحت الصفر الجنين قبل سقوطها في النيتروجين السائل للتخزين.
Abstract
قد يكون سابق للانغراس الأجنة cryopreserved من الأبقار والأغنام والماعز لتخزين قصيرة أو طويلة الأجل. سابق للانغراس الأجنة وتتكون أساسا من الماء ، وتجنب تشكيل الكريستال الجليد بين الخلايا أثناء عملية الحفظ بالتبريد هو من أهمية قصوى للحفاظ على سلامة الجنين. توضع الأجنة في حل مفرط التوتر (1،4-1،5 م) من عامل واق من البرد (CPA) مثل جلايكول الإيثيلين (EG) أو الجلسرين (GLYC) لإنشاء التدرج التناضحي التي تسهل الجفاف الخلوية. بعد الوصول إلى توازن التناضحي الأجنة في حل سلطة الائتلاف المؤقتة ، التي يتم تحميلها منفردة في حل سلطة الائتلاف المؤقتة مفرط التوتر في قش البلاستيك 0.25 مل التجميد. توضع الأجنة في الفريزر معدل تسيطر على درجة حرارة مئوية -6 وبفعل الجليد تشكيل الكريستال في حل سلطة الائتلاف المؤقتة التي تحيط بالجنين ، وتبلور يسبب زيادة في تركيز سلطة الائتلاف المؤقتة خارج الجنين ، مما تسبب في مزيد من الجفاف الخلوية. ويتم تبريد أجنة بمعدل 0.5 درجة دقيقة / C ، مما يتيح المزيد من الجفاف ، وإلى درجة حرارة -34 درجة مئوية قبل أن سقطت في النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية). يجب إذابة Cryopreserved الأجنة قبل نقلها إلى المتلقي (مركب) من الإناث. تتم إزالة القش التي تحتوي على أجنة من ديوار النيتروجين السائل ، الذي عقد في الهواء درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 5 ثوان ، ووضع في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 25 إلى 30 ثانية. cryopreserved الأجنة في GLYC توضع في حل M 1 من السكروز لمدة 10 دقيقة لإزالة اتفاق السلام الشامل قبل نقلها إلى المتلقي (مركب) من الإناث. الأجنة في cryopreserved المصري ، ومع ذلك ، يمكن أن تنتقل مباشرة إلى الرحم من المتلقي.
Protocol
1. تقييم مدى ملاءمة الأجنة لحفظ البرودة 1
- ينبغي أن توضع العينات المأخوذة من الجهاز التناسلي للإناث المانحة الفردية إلى الجنين متساوي التوتر المتوسط عقد لمدة 10 دقائق قبل التقييم باستخدام stereomicroscope. تكون على يقين من أن تبقي الأجنة الإناث من كل الجهات المانحة منفصلة عن بعضها البعض لتمكين الوالدين من تحديد النسل نقل الأجنة.
- استخدام التكبير المنخفضة (≤ 10X) ، وينبغي عزل عينات من الإناث المانحة الفردية في مجموعات منفصلة تتكون من بويضة غير مخصبة ، تتحول أجنة ، أو نوعية الأجنة قابلة للتحويل. الصف الجودة فقط 1 أو 2 في الأجنة morula المضغوط عبر مراحل الكيسة الموسع التنمية هي مناسبة لحفظ البرودة ، ويجب أن يتم تجاهل كل الآخرين (إلا الإناث المتلقي متزامن متوفرة للأجنة الجودة 3 درجة ونسبة الحمل بعد نقل ما يقرب من 25 يعتبر مقبولا -30 ٪).
- فحص نوعية الصف 1 و 2 morula المضغوط من خلال توسيع الأجنة مرحلة الكيسة في التكبير ≥ 50X لضمان الشفافة زونا الجنين سليم وعدم وجود المواد (على سبيل المثال ، الخلايا ، المخاط) التمسك الشفافة زونا. ينبغي فصل أي الجنين مع الشفافة زونا متصدع أو مفقود أو مع وجود المواد الشفافة زونا ملتصق من أجنة أخرى ، وإما أن يتم تجاهل أو معالجتها بشكل منفصل.
2. غسل الأجنة للحد من احتمال انتقال عدوى الأمراض 2
- نقل المنطقة الشفافة ، أجنة سليمة في الحد الأدنى من حجم الجنين متساوي التوتر المتوسط عقد في أول بئر المتوسطة الجنين الغسيل (مثل الفوسفات مخزنة المالحة دمجها مع المضادات الحيوية والألبومين في المصل البقري ، مصل العجل الوليد ، أو كحول البولي فينيل). إبقاء الأجنة الإناث من كل الجهات المانحة منفصلة ، وليس محاولة لغسل الأجنة أكثر من 10 في وقت واحد. نقل الأجنة في حجم أدنى من المتوسط في كل غسل المتعاقبة لتحقيق تخفيف المسلسل ≥ 1:100 ، ويكون لاستخدام بعض نصائح التعامل مع الجنين العقيمة التي يتم تغييرها بين كل غسل المتعاقبة.
- نقل الأجنة إلى 4 يغسل أكثر كما هو موضح في 2.1.
- إذا كان انتقال الأمراض الفيروسية من القلق ، وغسل الأجنة مرتين في محلول التربسين 0.25 ٪ ، وذلك لمدة التعرض المجموع الكلي لالتربسين لا يزيد على 90 ثانية.
- بعد يغسل التربسين اثنين ، غسل الأجنة 5 مرات اكثر في المتوسط الجنين الغسيل كما هو موضح في 2.1.
- بعد غسل الجنين النهائي والأجنة في مكان عقد الجنين متساوي التوتر المتوسط.
3. التجفيف الأجنة قبل الحفظ بالتبريد 3
- ينبغي نقل الأجنة في الحد الأدنى من حجم الجنين متساوي التوتر المتوسط عقد في حل مفرط التوتر (1،4-1،5 تركيز مولار) من عامل واق من البرد (CPA) مثل جلايكول الإثيلين أو الجلسرين.
- السماح للجلوس في الأجنة تجميد المتوسطة (CPA مفرط التوتر الحل) حتى تصل إلى التوازن التناضحي. لأن جلايكول الإثيلين يتخلل الخلايا الجنينية بسرعة أكبر مما يفعل الجلسرين ، مرات موازنة وعادة ما تكون أقل بالنسبة للأجنة في جلايكول الإثيلين (5 دقائق) مما كانت عليه في الجلسرين (10 دقيقة). ويمكن تحقيق جزء من موازنة هذا الوقت أثناء وبعد يتم تحميل الأجنة في القش (الموصوفة في الخطوة التالية).
4. تحميل الأجنة إلى مل بلاستيك سترو 0.25 للحفظ بالبرودة
- نعلق نهاية المكونات القطن من قش البلاستيك 0.25 مل (11.5 سم طول العمل) إلى الجنين جهاز التحميل ، ونضح ما يقرب من 1.3 سم من محلول مفرط التوتر اتفاق السلام الشامل في قش المسمى بشكل صحيح. مجموعة متنوعة من الإجراءات العلامات موجودا ، بما في ذلك استخدام التسميات المطبوعة المرفقة إما القش المكونات الختم أو القش لآخر اتصال مع محول القش.
- إزالة القش من حل سلطة التحالف المؤقتة ، ونضح ما يقرب من 0.15 سم من الهواء لخلق فقاعة الهواء الصغيرة داخل القش.
- نضح جنين واحد في حوالي 0.8 سم من محلول مفرط التوتر اتفاق السلام الشامل في القش.
- إزالة القش من حل سلطة التحالف المؤقتة ونضح ما يقرب من 0.15 سم من الهواء لإنشاء الثاني فقاعة الهواء الصغيرة داخل القش (فقاعات الهواء تعمل على عزل فعليا الجنين داخل القش).
- نضح حوالي 9.1 سم من حل سلطة التحالف المؤقتة لملء تماما من القش ، ويجري معينة لجذب حجم كاف من حل سلطة التحالف المؤقتة لترطيب فينيل (PVC) المسحوق الموجود داخل القطن نهاية المكونات من القش. الحل CPA يؤدي إلى مسحوق هلام بولي كلوريد الفينيل وختم بأن نهاية القش.
- ختم الطرف الآخر من القش مع مسحوق البلاستيك ، وسدادات من البلاستيك الختم القش ، أو السداده الحرارة.
5. وضع الجنين في سعر آلة التحكم تجميد الأجنة
- قد تكون مبرمجة إما حمام الميثانول أو آلات تجميد السائل بخار النيتروجين عن الحفظ بالتبريد سابق للانغراس الأجنة.
- تحميل القش التي تحتوي على جنين السراج في جهاز التجميد الذي تم تبريده في درجة الحرارة من درجة حرارة الهواء المحيط إلى -6 درجة مئوية. القش تحميل القطن حتى نهاية المكونات (ما لم يتم استخدام سدادات بلاستيكية الختم القش أو محولات القش ، والتي وضعت في نهاية حالة المكونات الأقطان).
- السماح للجلوس على الأجنة هذه الدرجة لمدة لا تقل عن 2 دقيقة قبل المتابعة.
6. زراعة
- بمجرد أن يبرد الأجنة إلى -6 درجة مئوية ، واستخدام زوج من الملاقط فائق التبريد في النيتروجين السائل (أو عصا القطن ذات الرؤوس منغمسين في النيتروجين السائل) للحث على تكوين بلورات الثلج في حل سلطة الائتلاف المؤقتة داخل القش عن طريق لمس ملقط (أو القطن يميل العصا) إلى عمود من الحل إما فوق أو تحت الجنين.
- فإن الماء في حل بلورة اتفاق السلام الشامل في المنطقة تتعرض لالنيتروجين السائل ، وبلورات الجليد سوف تمتد الى عمود من حل سلطة التحالف المؤقتة على الفور المحيطة الجنين.
- عقد أجنة في بذر درجة الحرارة لمدة 10 دقيقة قبل تبريد أخرى.
7. استمرار الجفاف الجنين
- بارد الأجنة بمعدل 0.5 C. C / دقيقة لتصل إلى درجة حرارة -34 ° ° هذا المعدل التبريد مهم لضمان استمرار الجفاف الجنين.
- عقد أجنة في -34 لمدة 10 دقائق درجة مئوية قبل تغرق الأجنة في النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية).
- cryopreserved مكان الأجنة إلى القدح المسمى بشكل مناسب (مليئة النيتروجين السائل) تعلق على قصب المسمى بشكل مناسب ، ووضع العصا في علبة من ديوار النيتروجين السائل لتخزين قصيرة أو طويلة الأجل.
8. ذوبان الأجنة Cryopreserved
- سحب علبة في عنق ديوار النيتروجين السائل ، وضمان أن تظل العلبة تحت خط الصقيع في ديوار.
- موقع القصب يحتوي على الجنين أن إذابة ، وبسرعة وبدقة إزالة القش من القدح ، ويجري بعض القش بعدم دافئة أخرى في القدح.
- الاستمرار على القش في الهواء لمدة 3-5 ثواني (للحد من وقوع لالشفافة زونا تصدع 4) ، ثم تغرق في حمام مائي 37 ° C ل25-30 ثانية إضافية.
- إزالة القش من حمام الماء ، مسح القشة (الحرص على عدم تلطيخ تحديد الجنين على القش) ، واستخدام جهاز لقطع القش القصاصة قبالة نهاية المكونات غير القطن من القش (إذا أغلقت الحرارة باستخدام مسحوق أو PVC ) ، أو إزالة المكونات بعناية ختم البلاستيك ، وإما :
- تحميل القش الى جهاز نقل الجنين ونقل في أسرع وقت ممكن إلى مستلم الجنين متزامن (ولكن فقط إذا كان الجنين به cryopreserved جلايكول الإثيلين واتفاق السلام الشامل) ، أو
- عقد نهاية مفتوحة لأكثر من طبق القش التي تحتوي على تركيز 1.0 مولار من السكروز (مركب غير تتخلل) ، واستخدم مقصا لقطع القطن نهاية المكونات من القش. وينبغي أن محتويات القش تتدفق بحرية الى حل السكروز ، ولكن دفع عمود صغير من الهواء من خلال القش قد يكون ضروريا في حال وجود أي وسيط المتبقية داخل القش. يسمح للبقاء في الأجنة حل سكروز لمدة 10 دقائق ، ثم نقل الأجنة في جنين عقد متساوي التوتر المتوسط لمدة 10 دقيقة. تقييم الأجنة في مرحلة ما بعد ذوبان الجليد ، تحميل في قش جديدة ، ونقلها إلى المتلقي الإناث مناسبة.
9. ممثل النتائج :
قد مجموعة متنوعة من العوامل التي تؤثر على الحمل والعيش معدلات المواليد الناتجة من نقل أجنة مجمدة سابق للانغراس إذابة للإناث المتلقي متزامن 5. أجنة في مراحل النمو أقل تقدما من morula المضغوط أو أكثر تقدما من الكيسة توسعت في كثير من الأحيان لا تنجو من عملية الحفظ بالتبريد وكذلك الأجنة في morula المدمجة ، الكيسة في وقت مبكر ، الكيسة ، ومراحل الكيسة الموسع التطور الجنيني. أجنة من الدرجة 1 و 2 جودة المحصول ارتفاع معدلات الحمل في مرحلة ما بعد ذوبان الجليد مما تفعل الجودة الصف 3 أجنة (التي عادة لا cryopreserved بسبب انخفاض معدلات الحمل في مرحلة ما بعد ذوبان الجليد). أساء الأجنة خلال تجميد الجنين أو الجنين ذوبان الإجراءات من المرجح أن تظهر انخفاض معدلات الحمل. نقل الأجنة الإناث إلى المتلقي الذي دقي دورات غير متزامنة مع تلك الأنثى المانحة تنتج عادة انخفاض معدلات الحمل. الأجنة المنتجة في المختبر أو التلاعب بها بطريقة ما (على سبيل المثال ، تحتاج فحص أو شطر) العائد عادة انخفاض معدلات الحمل. في ظل ظروف مثلى ، بعد الحصول على معدلات الحمل نقل المجمدة المذابة - الماعز في الأجنة الحية المستمدة عادة 60-70 ٪ 6،7 في الماشية ، 65-75 ٪ في الأغنام 8،9،10،11 ، و60-70 ٪ في 12،13،14،15. وبالمثل ، فإن معدلات الحمل تم الحصول عليها بعد نقل مجمدة مذوبة في المختبر أجنة المنتجة عادة 40-50 ٪ في الأبقار 6،16 ، 25-35 ٪ في الاغنام 17 و 30-40 ٪ في الماعز 18.
بلي 1 "/>الجدول 1. معدلات الحمل المتوقعة التالية نقل أجنة مجمدة إذابة الأنواع المحلية من تربية الحيوانات المجترة للإناث المتلقي متزامن.
Discussion
تتكون في الغالب لأن الأجنة من المياه ، فمن الأهمية بمكان أن تكون الأجنة سابق للانغراس المجففة والمبردة كاف ببطء وفقا لبروتوكول الموصوفة هنا لتجنب تشكيل الخلايا الكريستال الجليد. مرة واحدة في عملية التبريد قد بدأت ، من المهم للحفاظ على اتجاه وتغير درجات الحرارة وتجنب التقلبات في درجات الحرارة. الشروع في تكوين بلورات الثلج ("بذور") في درجة حرارة مناسبة لإيجاد حل سلطة الائتلاف المؤقتة محددة أمر بالغ الأهمية.
تعديلات على هذا التبريد البطيء / سريعة الذوبان لطريقة الحفظ بالتبريد سابق للانغراس الجنين وتشمل طريقة من خطوة واحدة (حيث العمود الأخير من المتوسط تحميلها في القش هو الحل بدلا من السكروز CPA) (19) وأسلوب النقل المباشر (حيث الأجنة المجمدة في غليكول الاثيلين وإذابة ونقل مباشرة إلى رحم الأنثى المتلقية دون إزالة أول جلايكول الإثيلين من الجنين) 20. لتقليل حجم غليكول الاثيلين أودع في رحم النقل المباشر (DT) الأنثى المتلقية ، فإنه من المستحسن لملء القش 0.25 مل 6 سم مع عقد المتوسطة قبل المتابعة كما هو موضح سابقا. وتجدر الإشارة إلى أن معيار طوعي موجود في صناعة نقل الجنين التجارية التي ينبغي تجميد الأجنة لDT cryopreserved سابق للانغراس في اللون الأصفر وتخزينها في قش أصفر اللون في كؤوس ديوار النيتروجين السائل. صناعة تجارية كما متطلبات وضع العلامات المحددة لجميع الأجنة cryopreserved التي ينبغي اتباعها.
بديل واحد إلى هذا الأسلوب هو التزجيج 21 ، وهي طريقة غير متوازنة من حيث الحفظ بالتبريد هو تبريد أكثر مركزة للغاية حل سلطة الائتلاف المؤقتة (6-8 M) بسرعة فائقة مما تسبب في حل سلطة الائتلاف المؤقتة إلى التغيير من السائل إلى حالة "زجاجي" دون الجليد تشكيل الكريستال. التزجيج هو المرجح أكثر ملاءمة لحفظ البرودة الأجنة التي هي أقل تقدما تنمويا من morula المضغوط بسبب حساسيتها لزيادة درجة الحرارة.
هذه التقنية قد طلب الحفاظ على الموارد الوراثية الفريدة 22 ، فضلا عن الدولية التجارية جنين حيث تم نقل صناعة cryopreserved أكثر من 55 ٪ من حوالي 500،000 سابق للانغراس الأجنة البقرية نقل في السنة التقويمية 2008 (23).
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بتمويل جزئي من وزارة الزراعة الأميركية للأبحاث مشروع متعدد الدولة W - 2171 "خلية جرثومة وتطور الجنين والتلاعب لتحسين الثروة الحيوانية" هي بالتقدير والعرفان. هي أيضا من المواهب الفنية رايان كالاهان ، الذي أعد الرسومات الفنية للجزء الفيديو من هذه المادة ، بالتقدير والعرفان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
| ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
| Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
| ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
| ViGrothaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
| Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
| BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
| Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
| ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
| SYNGROHolding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
| BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco's phosphate buffered saline |
| BioLifeBSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
| BioLifeantibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
| BioLifetrypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
| Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
| Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |
References
- Lindner, G. M., Wright, R. W. Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology. 20, 407-416 (1983).
- Stringfellow, D. A., Givens, M. D. Recommendations for the sanitary handling of in vivo derived embryos. Manual of the International Embryo Transfer Society. , 4th ed, International Embryo Transfer Society. Champaign, Illinois, USA. 65-68 (2010).
- Youngs, C. R., Leibo, S. P., Godke, R. A. Embryo cryopreservation in domestic mammalian livestock species. CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources. , (2010).
- Rall, W. F., Meyer, T. K. Zona fracture damage and its avoidance during the cryopreservation of mammalian embryos. Theriogenology. 31, 683-692 (1989).
- Spell, A. R., Beal, W. E., Corah, L. R., Lamb, G. C. Evaluating recipient and embryo factors that affect pregnancy rates of embryo transfer in beef cattle. Theriogenology. 56, 287-297 (2001).
- Hasler, J. F. The current status of oocyte recovery, in vitro embryo production, and embryo transfer in domestic animals, with an emphasis on the bovine. J. Anim. Sci. 76, Suppl 3. 52-74 (1998).
- Hasler, J. F. Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle. Theriogenology. 56, 1401-1415 (2001).
- Heyman, Y., Vincent, C., Garnier, V., Cognie, Y.
- McGinnis, L. K., Duplantis, S. C., Youngs, C. R. Cryopreservation of sheep embryos using ethylene glycol. Anim. Reprod. Sci. 30, 273-280 (1993).
- Shelton, J. N. Factors affecting viability of fresh and frozen-thawed sheep demi-embryos. Theriogenology. 37, 713-721 (1992).
- Bettencourt, E. M., Bettencourt, C. M., Silva, J. C. E., Ferreira, P., Matos, C. P., Ramão, R. J., Rocha, A. Fertility rates following the transfer of ovine embryos cryopreserved using three protocols. Small Ruminant Research. 82, 112-116 (2009).
- Chemineau, P., Procureur, R., Cognié, Y., Lefèvre, P. C., Locatelli, A., Chupin, D. Production, freezing and transfer of embryos from a bluetongue-infected goat herd without bluetongue transmission. Theriogenology. 26, 279-290 (1986).
- Baril, B., Casamitjana, P., Perrin, J., Vallet, J. C. Embryo production freezing and transfer in Angora, Alpine and Saanen goats. Zuchthyg. 24, 101-115 (1989).
- Guignot, F., Bouttier, A., Baril, G., Salvetti, P., Pignon, P., Beckers, J. F., Touzé, J. L., Cognié, J., Traldi, A. S., Cognié, Y., Mermillod, P. Improved vitrification method allowing direct transfer of goat embryos. Theriogenology. 66, 1004-1011 (2006).
- Nowshari, M. A., Holtz, W. In vitro culture of goat morulae to blastocysts before freezing. Theriogenology. 44, 983-988 (1995).
- Machatkova, M., Hulinska, P., Reckova, Z., Hanzalova, K., Spanihelova, J., Pospisil, R. In vitro production of embryos from high performance cows and the development of frozen-thawed embryos after transfer: a field study. Veterinarni Medicina. 53, 358-364 (2008).
- Martínez, A. G., Valcárcel, A., Furnus, C. C., de Matos, D. G., Iorio, G., de las Heras, M. A.
- Han, Y., Meintjes, M., Graff, K., Denniston, R., Zhang, L., Ziomek, C., Godke, R. Caprine offspring born from fresh and frozen-thawed in vitro-produced embryos. Veterinary Record. 149, 714-716 (2001).
- Leibo, S. P. A one-step method for direct nonsurgical transfer of frozen-thawed bovine embryos. Theriogenology. 21, 767-790 (1984).
- Voelkel, S. A., Hu, Y. X. Use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females. Theriogenology. 37, 687-697 (1992).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Notter, D. R. The importance of genetic diversity in livestock populations of the future. J. Anim. Sci. 77, 61-69 (1999).
- Thibier, M. Data retrieval committee statistics of embryo transfer- year 2008. The worldwide statistics of embryo transfers in farm animals. Embryo Transfer Newsletter. 27, 13-19 (2009).
