Summary
Preimpianto degli embrioni possono essere crioconservati dopo l'inserimento in una soluzione ipertonica crioprotettivi a causare disidratazione cellulare. Dopo equilibrio, la formazione di cristalli di ghiaccio è indotta nella soluzione che circonda l'embrione. Disidratazione ulteriore verifica come l'embrione è lentamente raffreddato a temperature sotto lo zero prima di tuffarsi in azoto liquido per la conservazione.
Abstract
Embrioni preimpianto da bovini, pecore e capre possono essere crioconservati per la conservazione a breve oa lungo termine. Preimpianto degli embrioni sono costituiti prevalentemente da acqua, e la riduzione della formazione di cristalli di ghiaccio intracellulare durante il processo di crioconservazione è di fondamentale importanza per mantenere la vitalità dell'embrione. Gli embrioni sono posti in una soluzione ipertonica (1,4 - 1,5 m) di un agente crioprotettivi (CPA), come il glicole etilenico (EG) o glicerolo (GLYC) per creare un gradiente osmotico che favorisce la disidratazione cellulare. Dopo gli embrioni raggiungere l'equilibrio osmotico della soluzione CPA, sono singolarmente caricati nella soluzione ipertonica CPA in 0,25 ml cannucce di plastica per congelamento. Gli embrioni vengono inseriti in un congelatore velocità controllata ad una temperatura di -6 ° C. Formazione di cristalli di ghiaccio è indotta nella soluzione CPA che circonda l'embrione, e la cristallizzazione provoca un aumento della concentrazione di CPA al di fuori dell'embrione, provocando ulteriore disidratazione cellulare. Gli embrioni vengono raffreddati ad una velocità di 0,5 ° C / min, permettendo un'ulteriore disidratazione, ad una temperatura di -34 ° C prima di essere immersi in azoto liquido (-196 ° C). Embrioni crioconservati devono essere scongelati prima del trasferimento a un destinatario (surrogato) femminile. Cannucce contenente gli embrioni vengono rimossi dal dewar di azoto liquido, che si tiene a temperatura ambiente per 3 a 5 sec, e collocato in un bagno d'acqua a 37 ° C per 25 a 30 sec. Embrioni crioconservati in GLYC sono posti in una soluzione 1 M di saccarosio per 10 min per la rimozione del CPA prima del trasferimento a un destinatario (surrogato) femminile. Embrioni crioconservati in EG, tuttavia, può essere direttamente trasferito nell'utero di un destinatario.
Protocol
1. La valutazione di idoneità per la crioconservazione degli embrioni 1
- I campioni raccolti dal tratto riproduttivo delle donatrici individuali devono essere inseriti in un mezzo isotonico embrione tenendo per 10 minuti prima della valutazione utilizzando uno stereomicroscopio. Essere certi di mantenere embrioni provenienti da ogni femmina donatrice separati l'uno dall'altro di permettere l'individuazione di parentela della prole trasferimento di embrioni.
- Utilizzando basso ingrandimento (≤ 10 volte), i campioni da una femmina donatrice individuo dovrebbe essere divise in gruppi separati composta da ovuli non fecondati, embrioni degenerati, o embrioni di qualità trasferibile. Solo grado di qualità 1 o 2 embrioni alla morula compatta attraverso le fasi di sviluppo di blastocisti espanse sono adatte per la crioconservazione, e tutti gli altri deve essere scartato (a meno che le femmine destinatario sincrone sono disponibili per la qualità di grado 3 embrioni e un post-trasferimento tasso di gravidanza di circa 25 -30% è considerata accettabile).
- Ispezionare grado di qualità 1 e 2 morula compatta attraverso embrioni ampliato stadio di blastocisti con un ingrandimento 50X ≥ per garantire che la zona pellucida dell'embrione è intatto e che non vi sia materiale (per esempio, cellule, muco) aderendo alla zona pellucida. Ogni embrione con un rotto o mancante zona pellucida o con una zona pellucida avere materiale aderente dovrebbero essere separate dalle altre ed embrioni essere scartati o elaborati separatamente.
2. Gli embrioni di lavaggio per ridurre la probabilità di trasmissione delle malattie 2
- Spostare zona pellucida intatta-embrioni in un volume minimo di medio dell'embrione isotonico tenendo nel primo pozzo di medio dell'embrione lavaggio (ad esempio, tampone fosfato salino aumentata con antibiotici e albumina di siero bovino, siero di vitello neonato o alcool polivinilico). Mantenere gli embrioni da ogni femmina donatrice separati, e non tentare di lavare più di 10 embrioni alla volta. Spostare gli embrioni in un volume minimo di mezzo in ogni lavaggio successivo per ottenere una diluizione seriale ≥ 1:100, ed essere certi di utilizzare punte sterili manipolazione degli embrioni che sono cambiate tra ogni lavaggio successivo.
- Spostare gli embrioni a 4 lavaggi più come previsto al punto 2.1.
- Se la trasmissione di malattie virali è di preoccupazione, lavare gli embrioni due volte in una soluzione tripsina 0,25%, per un tempo totale esposizione combinata a tripsina di non più di 90 secondi.
- Dopo le due lavaggi tripsina, lavare gli embrioni 5 volte di più in media embrione lavaggio come descritto al punto 2.1.
- Dopo il lavaggio finale embrione, embrioni luogo in embrione isotonica tenendo media.
3. Disidratazione embrioni Prima di Crioconservazione 3
- Gli embrioni devono essere trasferiti in un volume minimo di mezzo isotonico tenendo dell'embrione una soluzione ipertonica (1,4-1,5 concentrazione molare) di un agente crioprotettivi (CPA), come il glicole di etilene o glicerolo.
- Lasciare embrioni di sedersi in media di congelamento (soluzione ipertonica CPA) fino a raggiungere l'equilibrio osmotico. Perché glicole etilenico permea le cellule embrionali più rapidamente di quanto non faccia glicerolo, tempi equilibrio sono in genere meno per gli embrioni in glicole etilenico (5 min) rispetto a glicerolo (10 min). Parte di questo tempo di equilibrio può essere raggiunto durante e dopo gli embrioni vengono caricati in cannucce (descritto nel passaggio successivo).
4. Caricamento di embrioni in un paglierino 0,25 ml in plastica per la crioconservazione
- Collegare l'estremità spina cotone di una cannuccia di plastica 0,25 ml (11,5 cm di lunghezza di lavoro) ad un dispositivo di caricamento embrione, e aspirare circa 1,3 cm di soluzione ipertonica CPA in una cannuccia correttamente etichettati. Una varietà di procedure di etichettatura esiste, compreso l'uso di etichette stampate collegato a un tappo di paglia chiusura o ad un altro paglia collegato con un adattatore di paglia.
- Rimuovere la paglia dalla soluzione CPA, e aspirare circa 0,15 cm di aria per creare una piccola bolla d'aria all'interno della paglia.
- Aspirare un singolo embrione di circa 0,8 cm di soluzione ipertonica CPA nella paglia.
- Rimuovere la paglia dalla soluzione CPA ed aspirare circa 0,15 cm di aria per creare una bolla d'aria secondo piccolo all'interno della paglia (bolle d'aria servono a isolare fisicamente l'embrione all'interno della paglia).
- Aspirare circa 9,1 cm di soluzione CPA di riempire completamente la paglia, la certezza di disegnare in un volume sufficiente di soluzione CPA per inumidire il polivinilcloruro (PVC) in polvere ciò che esiste entro la fine di cotone spina della paglia. La soluzione fa sì che il CPA polvere di PVC di gel e il sigillo che fine della paglia.
- Tenuta l'altra estremità della cannuccia con polvere di PVC, plastica tappi di paglia, o un sigillante di calore.
5. Posizionamento embrioni in una macchina a controllo di congelamento degli embrioni Vota
- Di vasca di azoto liquido metanolo o macchine congelamento vapore può essere programmato per la crioconservazione di embrioni preimpianto.
- Caricare il cannucce contenente le cellule staminali embrionali os in una macchina la cui temperatura di congelamento è stato raffreddato dalla temperatura ambiente a -6 ° C. Cannucce scaricare dei plug fine cotone verso l'alto (a meno di plastica tappi paglia o adattatori di paglia vengono utilizzati, nel quale caso spina cotone fine è posizionato in basso).
- Lasciare embrioni di sedersi a questa temperatura per almeno 2 minuti prima di procedere.
6. Semina
- Una volta che gli embrioni si sono raffreddati a -6 ° C, utilizzare una coppia di pinze molto fredde in azoto liquido (o un bastoncino di cotone con la punta immersa in azoto liquido) per indurre la formazione di cristalli di ghiaccio nella soluzione all'interno del CPA paglia toccando le molle (o cotone bastone a punta) alla colonna di soluzione sopra o sotto l'embrione.
- L'acqua nella soluzione CPA si cristallizzano nella regione esposti a azoto liquido, e cristalli di ghiaccio si diffonderà alla colonna di soluzione CPA immediatamente circostante l'embrione.
- Tenere gli embrioni al momento dell'inoculazione temperatura per 10 minuti prima di un ulteriore raffreddamento.
7. Disidratazione continua di embrioni
- Embrioni fresco ad una velocità di 0,5 ° C / min fino ad una temperatura di -34 ° C. Questa velocità di raffreddamento è importante per garantire la disidratazione continua dell'embrione.
- Tenere gli embrioni a -34 ° C per 10 minuti prima di tuffarsi embrioni in azoto liquido (-196 ° C).
- Mettere gli embrioni crioconservati in un calice adeguatamente etichettati (riempito con azoto liquido) collegato a un bastone opportunamente etichettati, e posizionare la canna in una scatola metallica di un dewar di azoto liquido per la conservazione a breve oa lungo termine.
8. Scongelamento embrioni crioconservati
- Tirare il contenitore nel collo del dewar di azoto liquido, assicurando che il contenitore rimane al di sotto della linea di gelo nel dewar.
- Individuare la canna che contiene l'embrione di essere scongelati, e rapidamente e con attenzione rimuovere la paglia dalla coppa, la certezza di non caldo cannucce altri nel calice.
- Tenere la paglia in aria per 3-5 secondi (per ridurre l'incidenza di una incrinato zona pellucida 4), e poi immergersi in un bagno d'acqua a 37 ° C per altri 25-30 secondi.
- Rimuovere la paglia dal bagnomaria, pulire la paglia (facendo attenzione a non sporcare l'identificazione degli embrioni sulla paglia), utilizzare un dispositivo di paglia di taglio per tagliare la non-cotone fine spina della paglia (se sigillati con il calore o PVC in polvere ), o rimuovere con attenzione il tappo di plastica di tenuta, e:
- caricare la paglia in un dispositivo di trasferimento degli embrioni e trasferire il più rapidamente possibile a un destinatario embrione sincrono (ma solo se l'embrione crioconservato è stato con il glicole etilenico come il CPA), o
- tenere l'estremità aperta della paglia sopra un piatto contenente una concentrazione 1,0 molare di saccarosio (un non permea composti), e utilizzare un paio di forbici per tagliare la spina cotone fine della paglia. Contenuto della paglia deve fluire liberamente nella soluzione di saccarosio, ma spingendo una piccola colonna d'aria attraverso la cannuccia può essere necessaria se qualsiasi mezzo residuale esiste dentro la paglia. Lasciare embrioni di rimanere in soluzione di saccarosio per 10 minuti, e poi trasferire gli embrioni in embrione isotoniche tenendo medio per 10 minuti. Valutare gli embrioni post-disgelo, caricare in una nuova paglia, e il trasferimento alle femmine ricevente idoneo.
9. Rappresentante dei risultati:
Una varietà di fattori possono influenzare la gravidanza e vivere tassi di natalità derivanti dal trasferimento di embrioni congelati, scongelati preimpianto alle femmine destinatario sincrono 5. Gli embrioni in stadi di sviluppo meno avanzati di morula compatta o più avanzato di blastocisti espansa spesso non sopravvivono al processo di crioconservazione degli embrioni così come la morula compatta, blastocisti precoce, blastocisti, e ampliato blastocisti fasi dello sviluppo embrionale. Embrioni di grado di qualità 1 e 2 maggiore resa post-disgelo tassi di gravidanza di quanto non facciano qualità di grado 3 embrioni (che in genere non vengono crioconservati a causa del basso tasso di disgelo post-gravidanza). Gli embrioni maltrattato durante il congelamento dell'embrione o degli embrioni scongelamento procedure sono suscettibili di esporre tassi di gravidanza ridotto. Embrioni trasferiti alle femmine destinatario il cui estro cicli non sono sincronizzati con quello del donatore femminile in genere producono più bassi tassi di gravidanza. Gli embrioni prodotti in vitro o manipolato in qualche modo (ad esempio, biopsie o tagliata in due), di solito resa tassi di gravidanza più bassi. In condizioni ottimali, i tassi di gravidanza ottenuta dopo il trasferimento di decongelati embrioni concepiti in vivo è di solito il 60-70% nei bovini 6,7, 65-75% nelle pecore 8,9,10,11, e 60-70% nelle capre 12,13,14,15. Analogamente, i tassi di gravidanza ottenuta dopo il trasferimento di decongelati embrioni in vitro prodotto è tipicamente 40-50% nei bovini 6,16, 25-35% negli ovini 17, e il 30-40% nelle capre 18.
BLE 1 "/>Tabella 1. Attesi tassi di gravidanza dopo il trasferimento di embrioni congelati, scongelati da specie domestiche di allevamento ruminanti femmine destinatario sincrona.
Discussion
Perché gli embrioni sono costituiti prevalentemente da acqua, è fondamentale che gli embrioni preimpianto essere adeguatamente disidratata e lentamente raffreddato in conformità con il protocollo descritto nel presente documento al fine di evitare la formazione di cristalli di ghiaccio intracellulare. Una volta che il processo di raffreddamento è iniziato, è importante mantenere il cambiamento unidirezionale di temperatura e per evitare sbalzi di temperatura. L'inizio della formazione di cristalli di ghiaccio ("seeding") a una temperatura adeguata per la soluzione specifica CPA è critica.
Modifiche al presente raffreddamento lento / scongelamento rapido metodo per la crioconservazione degli embrioni preimpianto includono il metodo ad un passo (dove l'ultima colonna della media caricati nella paglia è saccarosio al posto della soluzione CPA) 19 e il metodo di trasferimento diretto (in cui gli embrioni congelati in glicole etilenico sono scongelati e trasferiti direttamente nell'utero di una femmina destinatario senza prima rimuovere il glicole etilenico dall'embrione) 20. Per ridurre il volume di glicole etilenico depositato in utero di un trasferimento diretto (DT) femminile destinatario, si consiglia di riempire la paglia 0,25 ml con 6 centimetri tenendo medio prima di continuare come descritto in precedenza. Va notato che una norma volontaria esiste all'interno del settore commerciale che il trasferimento degli embrioni pre-impianto degli embrioni crioconservati per DT devono essere congelati in colore giallo, cannucce e conservati in colore giallo calici nel dewar di azoto liquido. Il settore commerciale ha anche i requisiti specifici di etichettatura per tutti gli embrioni crioconservati da seguire.
Un'alternativa a questo metodo è vetrificazione 21, un metodo di non equilibrio della crioconservazione, dove viene raffreddato una più alta concentrazione (6-8 M) CPA soluzione ultra-rapido che causa la soluzione CPA per passare da liquido a uno stato "vetroso" senza ghiaccio la formazione di cristalli. La vitrificazione è probabilmente più adatto per la crioconservazione di embrioni che sono meno avanzati di evolutivamente morula compatta a causa della loro sensibilità alla temperatura aumentata.
Questa tecnica è l'applicazione per la conservazione delle risorse germoplasma unico 22, così come per il settore commerciale internazionale il trasferimento di embrioni in cui oltre il 55% dei circa 500.000 embrioni preimpianto bovina trasferiti nell'anno solare 2008 sono stati crioconservati. 23
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Finanziamento parziale dalla multi-stato di progetto di ricerca USDA W-2171 "di cellule germinali e sviluppo embrionale e manipolazione per il miglioramento del bestiame" è riconosciuto con gratitudine. Il talento artistico di Ryan Callahan, che ha preparato le illustrazioni tecniche per la parte video di questo articolo, sono inoltre ringrazia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
| ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
| Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
| ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
| ViGrothaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
| Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
| BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
| Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
| ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
| SYNGROHolding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
| BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco's phosphate buffered saline |
| BioLifeBSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
| BioLifeantibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
| BioLifetrypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
| Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
| Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |
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