Summary
Preimplantasyon embriyolar hücresel dehidratasyon neden hipertonik dondurucu bir çözüm içine yerleştirildikten sonra Kriyoprezerve olabilir. Dengeleme sonra embriyonun çevresindeki çözüm, buz kristal oluşumu meydana gelir. Embriyo yavaş depolama için sıvı azot içine dalan önce sıfırın altındaki sıcaklıklara soğutulduğunda daha fazla dehidrasyon oluşur.
Abstract
Preimplantasyon embriyolar, sığır, koyun, ve keçi, kısa veya uzun süreli depolama için Kriyoprezerve olabilir. Preimplantasyon embriyolarının ağırlıklı olarak su oluşur ve hücre içi buz kristali oluşumunu dondurulması işlemi sırasında kaçınma embriyo canlılığını korumak için büyük önem taşımaktadır. Etilen glikol (EG) veya hücresel dehidratasyon kolaylaştıran bir osmotik degrade oluşturmak için gliserol (GLYC) gibi dondurucu bir ajan (CPA) - Embriyolar hipertonik bir çözüm (1.5 M 1.4) yerleştirilir. Embriyolar EBM çözüm osmotik denge ulaştıktan sonra, ayrı ayrı, dondurma için 0.25 ml'lik plastik payet içine hipertonik EBM çözüm yüklenir. Embriyolar -6 ° C lik bir sıcaklık kontrollü bir oranda dondurucu yerleştirilir Buz kristal oluşumu, embriyonun çevresindeki EBM çözüm indüklenen ve kristalleşme daha hücresel dehidratasyon neden EBM konsantrasyonu embriyo dışında bir artışa neden olmaktadır. Embriyolar, sıvı azot (-196 ° C) daldı önce bir sıcaklık -34 ° C daha fazla dehidrasyon sağlayan 0.5 ° C / dak hızında soğutulur. Kriyoprezervasyon embriyolar bir alıcı (vekil) kadın aktarmak için önce çözülmüş olmalıdır. Embriyoları içeren Pipetler çıkarılır ve oda sıcaklığında 3 ila 5 saniye süreyle havada düzenlenen sıvı azot Dewar, 25 ila 30 saniye süreyle 37 ° C'lik su banyosuna yerleştirilir. Embriyolar bir alıcı (vekil) kadın aktarılmadan önce çıkarılması EBM için 10 dakika süreyle sükroz 1 M çözelti içine yerleştirilir. GLYC dondurularak saklanabilir. Embriyolar EG Kriyoprezerve Ancak, doğrudan bir alıcının rahim transfer olabilir.
Protocol
1. Kriyoprezervasyon 1 Embriyolar uygunluğu Değerlendirilmesi
- Bireysel donör kadın üreme yolları hasat Örnekler stereomikroskopta kullanarak değerlendirme öncesinde 10 dakika boyunca bir izotonik embriyo holding ortama yerleştirilmelidir. Embriyolar embriyo transferi döl Ebeveyni belirlenmesini sağlamak için birbirinden ayrı her donör kadın tutmak için bazı olun.
- Düşük büyütme (≤ 10X) kullanarak, bireysel bir donör kadın örnekleri döllenmemiş yumurtaları oluşan ayrı gruba ayrılmalıdır, embriyolar ya da devredilemez kaliteli embriyolar dejenere. Sadece kalite geliştirme genişletilmiş blastosist aşamalardan kompakt morula grade 1 veya 2 embriyoların dondurulması için uygundur ve senkron alıcı kadın kalite notu 3 embriyo ve yaklaşık 25-devret sonrası gebelik oranı vardır sürece tüm diğerleri (atılmalıdır -30%) kabul edilir.
- ≥ 50X Embriyonun zona pellusida sağlam olduğunu ve zona pellusida kalarak hiçbir malzeme (örneğin, hücreler, mukus) olduğuna emin olmak için bir büyütme kaliteli grade 1 ve 2 ile genişletilmiş blastosist aşamasına embriyoları kompakt morula inceleyin. Bir çatlak ya da eksik zona pellusida veya zona pellusida sahip bir yapışkan malzeme ile herhangi bir embriyo diğer embriyolar ayrı olmalı ve atılacak ya da ayrı ayrı işlenir.
2. Yıkama Embriyolar Bulaşı 2 olasılığını azaltmak için
- Zona pellusida sağlam embriyolar embriyo yıkama orta ilk izotonik embriyo tutarak orta bir minimal volüm Taşı (örneğin, fosfat, antibiyotik ve sığır serum albumin, yeni doğan buzağı serumu veya polivinil alkol ile serum fizyolojik artar tamponlu). Embriyoların her donör kadın ayrı tutun ve bir kerede 10'dan fazla embriyoların yıkamak için teşebbüs etmeyin. Bir seri seyreltme ≥ 1:100 ulaşmak ve birbirini izleyen her yıkama arasında değişmektedir steril embriyo taşıma ipuçları kullandığınızdan emin olmak için, birbirini izleyen her yıkama içine orta bir minimal volüm embriyolar taşıyın.
- 2.1 'de açıklandığı gibi 4 daha yıkar ile embriyolar taşıyın.
- Viral hastalıkların bulaşmasını endişe ise, toplam maruz kalma süresi en fazla 90 saniye tripsin,% 0.25 tripsin çözüm embriyolar iki kez yıkayın.
- Iki tripsin yıkar, sonra 2.1 'de açıklandığı gibi 5 kat daha fazla embriyo yıkama orta embriyolar yıkayın.
- Izotonik embriyo haline son embriyo yıkama, yer embriyolar orta tuttuktan sonra.
3. Kriyoprezervasyon 3 öncesinde Embriyolar Dehydrating
- Embriyolar hipertonik bir çözüm gibi etilen glikol veya gliserol gibi dondurucu bir ajan (CPA) (1,4-1,5 Molar konsantrasyon) izotonik embriyonun tutma orta minimal volüm transfer edilmelidir.
- Ozmotik dengeye ulaşana kadar embriyolar dondurma orta (hipertonik EBM çözüm) oturmak için izin verin. Etilen glikol, gliserol, dengeleme kez etilen glikol (5 dakika) embriyolar genellikle gliserol (10 dk) daha azdır daha embriyonik hücreler daha hızlı nüfuz Çünkü. Sonra embriyolar payet (sonraki adımda açıklandığı gibi) yüklenen bu dengeleme zaman kısmı sırasında ve elde edilebilir.
4. Kriyoprezervasyon 0.25 ml Plastik Straw Embriyolar Yükleniyor
- Bir embriyo yükleme cihazı için 0.25 ml'lik plastik saman (11,5 cm çalışma uzunluğu) pamuk fiş ucunu ve düzgün etiketli saman içine hipertonik EBM çözüm yaklaşık 1,3 cm aspiratının. Saman tapa ya ya da bir saman adaptör ile bağlı başka bir saman bağlı baskılı etiketler kullanımı da dahil olmak üzere, çeşitli etiketleme prosedürleri vardır.
- EBM çözüm saman çıkarın ve saman içinde küçük bir hava kabarcığı oluşturmak için yaklaşık 0,15 cm hava aspire.
- Hipertonik EBM çözüm yaklaşık 0.8 cm saman içine tek bir embriyo aspire edin.
- EBM çözüm çıkarın ve saman saman içinde ikinci bir küçük hava kabarcığı (hava kabarcıkları fiziksel saman içinde embriyo izole hizmet) oluşturmak için yaklaşık 0,15 cm hava aspire.
- Pamuk fiş sonuna saman içinde var toz polivinilklorür (PVC) nemlendirmek için yeterli bir hacim EBM çözüm çekmek için, belirli, tamamen saman doldurmak için yaklaşık 9,1 cm EBM çözüm aspire edin. EBM çözüm jel PVC tozu nedenleri ve saman bu sonlandırma.
- PVC tozu, plastik hasır tapalar, ya da bir ısı macunu ile saman diğer ucunu Seal.
5. Embriyolar Kontrollü Oranı Embriyo Dondurma Makinesi içine yerleştirilmesi
- Metanol banyo veya sıvı azot buharı dondurma makineleri Ya preimplantasyon embriyoların dondurulması için programlanmış olabilir.
- Yük Embry içeren payet sıcaklığı, ortam sıcaklığı -6 soğutmalı olan bir dondurma makinesi içine os ° C Yük payet pamuk fiş sonuna kadar (plastik saman tapalar veya saman adaptörleri kullanılır durumda pamuk fiş sonuna konduğu ediliyor sürece).
- Embriyolar devam etmeden önce en az 2 dakika süreyle bu sıcaklıkta oturmak için izin verin.
6. Yayımlamak
- Bir kez embriyolar -6 soğuyana ° C, bir çift maşa (veya pamuk dokunarak saman içinde EBM çözüm buz kristali oluşumunu uyarmak için sıvı azot (ya da sıvı nitrojen içinde batırılmış pamuk uçlu çubuk) süpersoğutmalı maşa kullanın embriyo üstünde veya altında ya çözüm sütun uçlu çubuğu).
- EBM çözüm su, sıvı azot maruz kalan bölgede kristalize ve buz kristalleri hemen embriyo çevreleyen EBM çözüm sütun yayılacak.
- 10 dakika önce daha fazla soğutma sıcaklığı ekim embriyolar tutun.
7. Embriyoların Sürekli Dehidrasyon
- 0.5 ° C lik bir sıcaklık -34 / dak ° C hızında Soğuk embriyolar Bu soğutma hızı embriyo devam dehidratasyon sağlamak için önemlidir.
- -34 Embriyolar tutun ° C 10 dakika boyunca embriyolar sıvı azot (-196 ° C) içine dalan önce.
- Uygun bir şekilde etiketlenmiş kamışı bağlı bir şekilde etiketlenmiş kadeh (sıvı azot dolu) içine yerleştirin embriyolar Kriyoprezerve ve kısa veya uzun süreli depolama için bir teneke kutu içine bir sıvı nitrojen Dewar kamışı.
8. Kriyoprezervasyon Embriyolar Çözülme
- Spreyi aşağıda Dewar don çizgi kalmasını sağlayarak spreyi, sıvı azot Dewar boyun çekin.
- Çözülmüş olması embriyo içeren kamışı bulun, hızlı ve dikkatli bir kadeh diğer çörek ısıtmak için değil, belirli, saman kadeh kaldırmak.
- 3-5 saniye (bir kırık zona pellusida 4 insidansını azaltmak için) için ek bir 25-30 saniye süreyle 37 ° C su banyosu içine saman havada tutun ve sonra daldırın.
- Su banyosu, saman çıkarın, saman (saman embriyo kimliği bulaşmaya dikkat edin) silin, (saman-pamuk olmayan fiş sonuna snip bir saman kesme cihazı kullanmak mühürlü kullanarak ısı veya PVC tozu ), ya da dikkatli bir şekilde ya da plastik tapa kaldırmak ve:
- ancak senkron bir embriyo alıcıya mümkün olduğunca çabuk bir embriyo transferi cihazı ve transfer içine saman yükü (CPA olarak etilen glikol kullanılarak embriyo Kriyoprezerve SADECE), veya
- sakaroz 1.0 Molar konsantrasyonu (olmayan bir nüfuz bileşik) içeren bir çanak üzerinden saman açık ucunu tutun ve saman pamuk fiş sonuna kesmek için bir makas kullanın. Sakaroz çözeltisini içine saman İçeriği serbestçe akmalıdır, ancak herhangi bir kalıntı orta saman içinde varsa kamışla hava küçük bir sütun iterek gerekli olabilir. Embriyolar 10 dakika sakaroz çözeltisini kalmaya izin ver ve sonra 10 dakika boyunca orta tutarak izotonik embriyo embriyo transferine. Yeni bir saman yüklemek ve uygun alıcı kadın transfer, embriyoların-çözülme sonrası değerlendirin.
9 - Temsilcisi Sonuçlar:
Çeşitli faktörlerin etkisi ve gebelik senkron alıcı kadın 5 dondurulmuş çözülmüş preimplantasyon embriyo transferi kaynaklanan canlı doğum oranları olabilir. Genişletilmiş blastosist daha kompakt morula daha az gelişmiş ya da daha ileri gelişim aşamalarında Embriyolar genellikle yanı sıra embriyoların dondurulması işlemi kompakt morula, erken blastosist, blastosist ve genişletilmiş blastosist embriyonik gelişim aşamalarında hayatta yoktur. Embriyolar kaliteli grade 1 ve kalite notu 3 embriyolar (bu genellikle düşük-çözülme sonrası gebelik oranları nedeniyle Kriyoprezerve değil) daha 2 verimi daha yüksek-çözülme sonrası gebelik oranları. Embriyo dondurma veya çözdürme embriyo prosedürler sırasında yanlış Embriyolar azaltılmış gebelik oranları sergilemek muhtemeldir. Östrus döngüleri donör kadın ile senkronize değildir alıcı kadın için transfer Embriyolar genellikle düşük gebelik oranları üretirler. (Örneğin, biyopsi veya örtülmüş), in vitro olarak üretilen ya da bir şekilde manipüle Embriyolar genellikle düşük gebelik oranları verim . Optimal koşullar altında, dondurulmuş-çözülmüş, sığır 6,7% 60-70, koyun 8,9,10,11% 65-75 ve% 60-70 tipik in vivo elde edilen embriyoların keçi transferinden sonra elde edilen gebelik oranları 12,13,14,15. Benzer şekilde, transferi sonrası elde edilen gebelik oranları, in vitro üretilen embriyolar dondurulmuş-çözülmüş, genellikle% 40-50, sığır 6,16, koyun 17% 25-35 ve% 30-40 keçi 18.
ble 1 "/>Tablo 1 senkron alıcı kadın iç ruminant hayvancılık türleri dondurulmuş çözülmüş embriyo transferi sonrası beklenen gebelik oranları.
Discussion
Embriyolar ağırlıklı olarak su oluşur Çünkü, preimplantasyon embriyolar hücre içi buz kristali oluşumunu önlemek için burada anlatılan yeterince kurutulmuş ve yavaş yavaş protokol uyarınca soğutmalı olması çok önemlidir. Soğutma işlemi başladıktan sonra, tek yönlü sıcaklık değişimi korumak ve sıcaklık dalgalanmaları önlemek için önemlidir. Belirli bir EBM çözümü için uygun bir sıcaklıkta buz kristal oluşumu ("tohumlama") başlatılması kritik öneme sahiptir.
Bu yavaş soğutma / preimplantasyon embriyo dondurulması için hızlı çözülme yöntemi Değişiklikler tek adımlı bir yöntem (saman yüklenen orta son sütunda sakaroz yerine EBM çözüm olduğu) 19 ve dondurulmuş embriyolar etilen glikol doğrudan aktarma yöntemi ( İlk embriyo) 20 etilen glikol çıkarmadan çözülmüş ve bir alıcı kadın rahim direkt olarak aktarılabiliyor. Etilen glikol miktarını azaltmak için doğrudan transfer (DT) alıcı kadın rahim içine yatırılır, daha önce açıklandığı gibi devam etmeden önce orta tutarak 6 cm ile 0.25 ml saman doldurmak için tavsiye edilir. Bu gönüllü bir standart sarı renkli payet DT Kriyoprezerve preimplantasyon embriyolar dondurulmuş ve sıvı azot Dewar sarı renkli kadehler saklanan gerektiğini ticari embriyo transferi sanayi içinde mevcut olduğuna dikkat edilmelidir. Ticari sektörü de takip edilmesi gereken tüm Kriyoprezerve embriyolar için özel etiketleme gereksinimleri vardır.
Bu yöntemin bir alternatif vitrifikasyon 21, daha yüksek konsantrasyonlu (6-8 M) EBM çözüm, ultra hızla EBM çözüm buz olmadan bir sıvı "camsı" devlet değiştirmek için neden soğutulur kriyoprezervasyon olmayan bir denge yöntemi kristal oluşumu. Vitrifikasyon kompakt morula artan sıcaklık hassasiyeti nedeniyle daha az gelişimsel gelişmiş embriyoların dondurulması için muhtemelen daha uygun.
Bu teknik, 2008 takvim yılı içinde aktarılan yaklaşık 500.000 büyükbaş preimplantasyon embriyolar% 55 daha fazla olduğu Kriyoprezerve 22 benzersiz germplazma kaynakların korunması için uluslararası ticari embriyo transferi sanayi uygulamanın yanı sıra 23
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Kısmi fon USDA çok devlet araştırma projesi W-2171 "Hayvancılık İyileştirme Germ Hücre ve Embriyo Gelişim ve Manipülasyon" minnetle kabul edilmektedir. Bu makalenin video bölümü için teknik çizimler hazırlanan Ryan Callahan, sanatsal yeteneklerini de minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
| ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
| Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
| ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
| ViGrothaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
| Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
| BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
| Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
| ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
| SYNGROHolding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
| BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco's phosphate buffered saline |
| BioLifeBSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
| BioLifeantibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
| BioLifetrypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
| Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
| Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |
References
- Lindner, G. M., Wright, R. W. Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology. 20, 407-416 (1983).
- Stringfellow, D. A., Givens, M. D. Recommendations for the sanitary handling of in vivo derived embryos. Manual of the International Embryo Transfer Society. , 4th ed, International Embryo Transfer Society. Champaign, Illinois, USA. 65-68 (2010).
- Youngs, C. R., Leibo, S. P., Godke, R. A. Embryo cryopreservation in domestic mammalian livestock species. CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources. , (2010).
- Rall, W. F., Meyer, T. K. Zona fracture damage and its avoidance during the cryopreservation of mammalian embryos. Theriogenology. 31, 683-692 (1989).
- Spell, A. R., Beal, W. E., Corah, L. R., Lamb, G. C. Evaluating recipient and embryo factors that affect pregnancy rates of embryo transfer in beef cattle. Theriogenology. 56, 287-297 (2001).
- Hasler, J. F. The current status of oocyte recovery, in vitro embryo production, and embryo transfer in domestic animals, with an emphasis on the bovine. J. Anim. Sci. 76, Suppl 3. 52-74 (1998).
- Hasler, J. F. Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle. Theriogenology. 56, 1401-1415 (2001).
- Heyman, Y., Vincent, C., Garnier, V., Cognie, Y.
- McGinnis, L. K., Duplantis, S. C., Youngs, C. R. Cryopreservation of sheep embryos using ethylene glycol. Anim. Reprod. Sci. 30, 273-280 (1993).
- Shelton, J. N. Factors affecting viability of fresh and frozen-thawed sheep demi-embryos. Theriogenology. 37, 713-721 (1992).
- Bettencourt, E. M., Bettencourt, C. M., Silva, J. C. E., Ferreira, P., Matos, C. P., Ramão, R. J., Rocha, A. Fertility rates following the transfer of ovine embryos cryopreserved using three protocols. Small Ruminant Research. 82, 112-116 (2009).
- Chemineau, P., Procureur, R., Cognié, Y., Lefèvre, P. C., Locatelli, A., Chupin, D. Production, freezing and transfer of embryos from a bluetongue-infected goat herd without bluetongue transmission. Theriogenology. 26, 279-290 (1986).
- Baril, B., Casamitjana, P., Perrin, J., Vallet, J. C. Embryo production freezing and transfer in Angora, Alpine and Saanen goats. Zuchthyg. 24, 101-115 (1989).
- Guignot, F., Bouttier, A., Baril, G., Salvetti, P., Pignon, P., Beckers, J. F., Touzé, J. L., Cognié, J., Traldi, A. S., Cognié, Y., Mermillod, P. Improved vitrification method allowing direct transfer of goat embryos. Theriogenology. 66, 1004-1011 (2006).
- Nowshari, M. A., Holtz, W. In vitro culture of goat morulae to blastocysts before freezing. Theriogenology. 44, 983-988 (1995).
- Machatkova, M., Hulinska, P., Reckova, Z., Hanzalova, K., Spanihelova, J., Pospisil, R. In vitro production of embryos from high performance cows and the development of frozen-thawed embryos after transfer: a field study. Veterinarni Medicina. 53, 358-364 (2008).
- Martínez, A. G., Valcárcel, A., Furnus, C. C., de Matos, D. G., Iorio, G., de las Heras, M. A.
- Han, Y., Meintjes, M., Graff, K., Denniston, R., Zhang, L., Ziomek, C., Godke, R. Caprine offspring born from fresh and frozen-thawed in vitro-produced embryos. Veterinary Record. 149, 714-716 (2001).
- Leibo, S. P. A one-step method for direct nonsurgical transfer of frozen-thawed bovine embryos. Theriogenology. 21, 767-790 (1984).
- Voelkel, S. A., Hu, Y. X. Use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females. Theriogenology. 37, 687-697 (1992).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Notter, D. R. The importance of genetic diversity in livestock populations of the future. J. Anim. Sci. 77, 61-69 (1999).
- Thibier, M. Data retrieval committee statistics of embryo transfer- year 2008. The worldwide statistics of embryo transfers in farm animals. Embryo Transfer Newsletter. 27, 13-19 (2009).
