Summary
Preimplantation의 배아는 세포 탈수를 일으킬 수있는 hypertonic cryoprotective 솔루션으로 배치 후 cryopreserved 수 있습니다. 평균 후, 얼음 결정 형성은 배아를 둘러싼 솔루션에 유도합니다. 배아가 천천히 스토리지를위한 액체 질소로 폭락하기 전에 서브 제로 온도에 냉각로 추가 탈수가 발생합니다.
Abstract
소, 양, 그리고 염소의 Preimplantation의 배아는 - 단기 또는 장기 저장을위한 cryopreserved 수 있습니다. Preimplantation의 배아 물을 주로 이루어져 및 cryopreservation 과정에서 세포내 얼음 결정 형성의 소지를 없애기는 배아 생존을 유지하기 위해 파라마운트 중요하다. 이러한 에틸렌 글리콜 (EG) 또는 세포 탈수를 용이하게 삼투 그라디언트를 만들 수 글리세롤 (GLYC)로 cryoprotective 에이전트 (CPA)의 - 태아도 hypertonic 솔루션 (1.5 M 1.4)에 배치됩니다. 배아는 CPA 솔루션의 삼투 평형에 도달 후, 그들은 개별적으로 냉동 0.25 ML 플라스틱 빨대로 hypertonic CPA 솔루션에로드됩니다. 태아도 -6 ° C.의 온도에서 제어 속도 냉장고에 넣습니다 얼음 결정 형성은 배아를 둘러싼 CPA 솔루션 유도하고, 결정은 더 탈수를 일으키는 세포, 배아 외부 공인 회계사의 농도 증가를 일으 킵니다. 배아는 액체 질소 (-196 ° C) 속으로 뛰어들었다되기 전에 -34 ° C의 온도로, 더 탈수 있도록, 0.5 ° C / 분 속도로 냉각됩니다. Cryopreserved 배아는 수신자 (대리) 여성 전송하기 전에 해동해야합니다. 배아를 포함 스트로스는 3-5 초위한 상온 공기에서 개최된 액체 질소 듀어,에서 제거하고 25-30 초위한 37 ° C의 물을 욕조에 게재됩니다. 공룡의 태아가받는 사람 (대리인) 여성 전송하기 전에 공인 회계사의 제거를위한 10 분 자당의 1 M 용액에 배치 GLYC에 cryopreserved. 배아는 EG의 cryopreserved 그러나, 직접받는 사람의 자궁으로 전송 수 있습니다.
Protocol
1. Cryopreservation 1 태아의 적합성을 평가
- 개인 기증자 여성의 생식 요로의 수확 표본은 stereomicroscope를 사용하여 평가하기 전에 10 분 isotonic 배아 보관 매체에 배치해야합니다. 배아 전송 자손의 부모임의 신분을 수 있도록 다른와는 별도로 각 기증자 여성의 배아를 유지하기 위해 특정 수 있습니다.
- 낮은 확대 (≤ 10X)를 사용, 개인 기증자 여성의 표본이 unfertilized 난자로 구성된 별도의 그룹으로 차별되어야, 배아, 또는 양도 품질 배아 타락한. 오직 품질 등급 1 또는 개발의 확장 blastocyst 단계를 통해 소형 morula 2 배아는 cryopreservation에 적합하며, 동기받는 여자 품질 3 학년 배아 약 25 후 전송 임신 률에 사용할 수있는 한 모든 사람이 (폐기되어야합니다 -30 %)가 허용 것으로 간주됩니다.
- 배아의 조나 pellucida이 그대로 있다고하고 어떤 자료가 조나 pellucida을 준수하는 (예를 들어, 세포, 점액)가 없다는 것을 보장하기 위해 ≥ 50X 배율에서 품질 학년 1과 확장 blastocyst 단계의 배아를 통해이 소형 morula을 검사합니다. 금이 또는 누락된 조나 pellucida 또는 점착 성의 물질을 가지고 조나 pellucida 가진 배아 다른 배아에서 차별되어야하며 어느 폐기하거나 별도로 처리되었습니다.
2. 워싱 공룡의 태아가 질병 전송 2 확률을 감소하기 위해
- 배아 세척 매체의 잘 첫 번째로 isotonic 배아 유지 매체의 최소 볼륨에서 조나 pellucida - 그대로 배아를 이동 (예, 인산염은 항생제와 소 혈청 알부민, 신생아 송아지 혈청 또는 폴리비닐 알코올 호수 확대를 버퍼). 별도의 각 기증자 여성에서 배아를 보관하고, 한 번에 10 개 이상의 배아를 씻어하지 마십시오. 직렬 희석 ≥ 1:100를 달성하고, 각각의 연속 세척 사이에 변경 살균 배아 처리 팁을 사용하여 특정하는 각 연속 세척에 매체의 최소 볼륨에서 배아를 이동합니다.
- 으로 2.1에서 설명한 네 더 세척을 통해 배아를 이동합니다.
- 바이러스성 질병의 전송이 관심있다면, 아니 90 개가 넘는 초 트립신에 총 결합하여 노출 시간을, 0.25 %의 트립신 솔루션 배아 두 번 씻는다.
- 두 트립신의 세척 후, 2.1에서 설명한대로 배아 세척 중간에 5 배 이상 배아를 씻으십시오.
- isotonic 배아로 배아 최종 세척, 장소 배아는 매체를 개최 후.
3. Cryopreservation 3 전에 배아를 Dehydrating
- 배아는 이러한 에틸렌 글리콜이나 글리세린 같은 cryoprotective 에이전트 (CPA)의 hypertonic 솔루션 (1.4-1.5 몰라 농도)로 isotonic 배아 개최 매체의 최소 볼륨에서 전송해야합니다.
- 그들은 삼투 평형에 도달할 때까지 배아는 냉동 매체 (hypertonic CPA 솔루션)에 앉을 수 있습니다. 에틸렌 글리콜보다 빠르게 글리세롤, 평균 시간은 일반적으로 글리세롤 (10 분)에 비해 에틸렌 글리콜 (5 분)에 배아의 저렴가보다 배아 세포를 permeates 때문입니다. 배아는 빨대 (다음 단계에서 설명)에 로드된 후이 평균 시간의 일부는 도중 달성 수 있습니다.
4. Cryopreservation위한 0.25 ML의 플라스틱 스트로우로 배아를 로딩
- 배아 로딩 장치에 0.25 ML 플라스틱 빨대 (11.5 cm 작업 길이)의 면화 플러그 엔드를 첨부하고, 적절하게 표시 빨대로 hypertonic CPA 솔루션의 약 1.3 센티미터 대기음. 라벨링 절차 다양한 빨대 씰링 플러그 중 하나 또는 빨대 어댑터와 연결 다른 빨대에 연결된 인쇄 라벨의 사용을 포함하여, 존재합니다.
- CPA 솔루션에서 짚을 제거하고 지푸라기 내에 작은 기포를 만드는 공기의 약 0.15 센티미터 대기음.
- 짚으로 hypertonic CPA 솔루션의 약 0.8 cm에서 단일 배아를 대기음.
- CPA 솔루션에서 짚을 제거하고 지푸라기 내에서 두 번째 작은 기포 (공기 방울이 실제로 빨대 안에 배아를 분리하는 역할)를 만드는 공기의 약 0.15 센티미터 대기음.
- 빨대 면화 플러그 엔드 내에 존재 분말 polyvinylchloride (PVC)을 축축하게하다하는 CPA 솔루션의 충분한 볼륨에 그려 특정되고, 완전히 짚을을 채우기 위해 CPA 솔루션의 약 9.1 센티미터 대기음. CPA 솔루션 젤로 PVC 분말을 원인과 빨대의 끝을 밀봉.
- PVC 분말, 플라스틱 짚 씰링 플러그 또는 열 실러와 빨대의 다른 쪽 끝을 밀봉합니다.
5. 규제 속도의 배아 냉동 기계로 태아 배치
- 메탄올 목욕이나 액체 질소 증기 냉동 기계 중 하나는 preimplantation의 배아의 cryopreservation에 대해 프로그래밍할 수 있습니다.
- 엠브리 들어있는 빨대를로드 온도가 주변 온도에서 -6으로 냉각되어 냉동 기계에 운영 체제 ° C. 로드 빨대 면화 플러그 최종 접속 (플라스틱 스트로우 씰링 플러그 또는 스트로우 어댑터는 사건 커튼 플러그 끝이 아래로 배치되는, 사용중인 제외).
- 배아는 계속하기 전에 최소 2 분 동안이 온도에 앉을 수 있습니다.
6. 시딩
- 일단 배아는 -6로 냉각해야 ° C, 집게 (또는 목화 만져 빨대 안에 CPA 솔루션의 얼음 결정 형성을 유도하기 위해 액체 질소 (또는 액체 질소에 포장되어 솜 스쳐 스틱)에 supercooled 집게 한 쌍의를 사용하여 위 또는 아래의 배아 중 솔루션의 컬럼에 대해 통보 받기 스틱).
- CPA 솔루션의 물이 액체 질소에 노출 지역에서 구체화되며, 얼음 결정은 즉시 배아를 둘러싼 CPA 솔루션의 컬럼에 보급됩니다.
- 더욱 냉각하기 전에 10 분 정도 온도를 시딩에서 배아를 잡아.
7. 태아의 계속 탈수
- 0.5 ° C / -34의 온도로 분 ° C.의 속도 쿨 배아 이것은 냉각 속도는 배아의 지속적인 탈수를 보장하는 것이 중요합니다.
- -34에서 배아를 개최 ° C를 10 분 동안 액체 질소 (-196 ° C)에 배아를 폭락하기 전에.
- 장소는 적절하게 표시 지팡이에 부착된 적절하게 표시된 잔 (액체 질소로 가득)에 배아를 cryopreserved, 및 단기 또는 장기 저장을위한 액체 질소 듀어의 용기에 지팡이를 놓으십시오.
8. Cryopreserved 배아를 해동
- 용기 아래 듀어의 서리 라인 남아 있도록, 액체 질소 듀어의 목에 용기를 당겨.
- 해동하는 배아가 들어있는 지팡이를 찾아 신속하고 조심스럽게 잔의 다른 빨대를 따뜻하게하지 않는 특정되고, 잔에서 빨대를 제거합니다.
- 추가 25-30초에 대해 37 ° C의 물을 욕조에 3~5초 (금이 조나 pellucida 4의 발생을 줄이기 위해)을 공중에 밀짚을 보유하고 잠수함.
- , 물 목욕에서 짚을 제거 짚을 (빨대에 배아 식별을 자국 않도록 조심하고) 닦아 (빨대 아닌 무명 플러그 엔드를 싹둑 위해 짚을 절단 장치를 사용하는 경우 봉인 사용 열 또는 PVC 분말 ) 또는 신중 중 플라스틱 씰링 플러그를 제거하고 :
- 동기 배아받는 사람에게 가능한 빨리 배아 전송 장치 및 전송에 짚을로드 (하지만 배아는 CPA로서 에틸렌 글리콜을 사용하여 cryopreserved이었을 경우에만), 또는
- 자당의 1.0 몰라 농도 (비 permeating 화합물)이있는 접시 위에 짚을의 열린 끝을 보유하고 짚을의 면화 플러그 끝을 잘라 가위를 사용합니다. 지푸라기의 내용은 자유롭게 자당 솔루션 흘러해야하지만, 잔여 매체 빨대 안에 존재하면 빨대로 공기의 작은 컬럼을 추진하는 것이 필요할 수 있습니다. 배아는 10 분 자당 솔루션에 남아 있도록 허용하고, 다음 10 분 동안 중간을 잡고 isotonic 배아로 배아를 전송합니다. 새 짚으로로드하고, 적당한받는 여성을 전송, 배아 후 해동을 평가해보십시오.
9. 대표 결과 :
다양한 요인은 임신에 영향을하고 동기받는 여자 5 냉동 해동 preimplantation의 배아의 양도로 인한 출생 율을 살 수 있습니다. 확장 blastocyst보다 작고 morula보다 고급 이상의 고급 개발 단계에서 배아는 종종 cryopreservation 프로세스뿐만 아니라 태아 소형 morula에서 초기 blastocyst, blastocyst, 그리고 배아 개발의 확대 blastocyst 단계를 생존하지 않습니다. 품질 1 학년 및 품질 3 학년 배아는 (어떤 일반적으로 인해 낮은 사후 해동 임신 속도로 cryopreserved되지 않습니다)보다 두 수율 높은 포스트 해동 임신 요금의 배아. 배아는 임신 감소 속도를 전시 가능성이있는 배아 냉동 또는 절차를 해동 배아 동안 처리한. 그의 estrous주기 기증 여성의와 동기화되지 않은받는 여자로 전송 태아는 일반적으로 낮은 임신 률을 생산하고 있습니다. (예 : biopsied 또는 bisected) 체외에서 생산 또는 일부 방식으로 조작 태아는 일반적으로 낮은 임신 률을 얻을 수 있습니다. 최적의 조건에서, 임신 요금은 동결 - 해동 가축 6,7 년 60~70%, 양 8,9,10,11에 65~75% 및 60-70%가 일반적으로 생체내 파생 배아에서 염소의 양도 후 얻은 12,13,14,15. 마찬가지로 임신 요금의 전송 후 얻은 냉동 해동 체외 생산 배아에서 일반적으로 가축 6,16에 40-50%, 양 17 25-35%하고, 염소 18 30~40%입니다.
경 1 "/>동기받는 여성으로 국내 반추 가축의 종 냉동 해동 배아의 전달에 다음과 같은 표 1. 예상 임신 요금.
Discussion
배아는 주로 물로 이루어져 있기 때문에 preimplantation의 배아는 세포 얼음 결정 형성을 피하기 위해 본 설명 충분히 탈수 천천히 프로토콜에 따라 냉각하는 것이 중요합니다. 냉각 프로세스가 시작되면, 그것은 단방향 온도 변화를 유지하고 온도 변동을 방지하는 것이 중요합니다. 특정 CPA 솔루션에 적합한 온도에서 얼음 결정 형성 ( "시딩")의 취지는 매우 중요합니다.
이 느린 냉각 / preimplantation의 배아 cryopreservation에 대한 신속한 해동 방법에 대한 수정은 한 단계 방식 (지푸라기에 로드된 매체의 마지막 열에 자당 대신 CPA 솔루션입니다 어디에) 19 배아는 에틸렌 글리콜에 얼어 붙 어서 직접 전송 방법을 (포함 먼저 배아)에서 20 에틸렌 글리콜을 제거하지 않고 해동하고받는 여성의 자궁에 직접 전송됩니다. 에틸렌 글리콜의 볼륨을 줄이기 위해하는 것은 직접 송금 (DT)받는 여성의 자궁에 입금, 그것은 6cm가 이전에 설명한대로 계속하기 전에 매체를 가지고있는 0.25 ML 스트로우를 채우는 것이 좋습니다. 이것은 자발적인 표준 DT에 대한 cryopreserved preimplantation의 배아가 노란색 빨대에 냉동과 액화 질소 듀어에 노란색 goblets에 저장되어야한다는 상업 배아 전송 산업의 존재 것을인지해야합니다. 상업 산업도 따라야한다 모든 cryopreserved 배아의 특정 상표 요구하고 있습니다.
이 방법은 한 가지 대안은 vitrification 21보다 고농도 (6-8 M) CPA 솔루션 울트라 빠르게 CPA 솔루션 얼음없는 액체에서 "유리"상태로 변경하는 원인이 냉각 cryopreservation의 비 평형 방법입니다 크리스탈 형성. Vitrification는 증가 온도 민감도로 인해 소형 morula보다 발달 고급 아르 배아의 cryopreservation에 대한 가능성이 더 적합합니다.
연도 2008 년 이전 약 500,000 소 preimplantation의 배아 이상 55%가 cryopreserved 어디이 기술은 국제 상업 배아 전송 산업에 고유한 germplasm 자원 22 보전 신청,뿐만 아니라있다. 23
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
일부 자금은 USDA 다중 상태의 연구 프로젝트에서 W는 - 2171는 "가축의 개선을위한 배아 세포와 엠브료 개발 및 조작은"기꺼이 인정받고 있습니다. 이 문서의 비디오 부분에 대한 기술적인 그림을 준비 라이언 칼라,의 예술적 재능도 기꺼이 인정하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
| ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
| Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
| ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
| ViGrothaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
| Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
| BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
| Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
| ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
| SYNGROHolding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
| BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco's phosphate buffered saline |
| BioLifeBSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
| BioLifeantibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
| BioLifetrypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
| Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
| Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |
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