Summary
Dit artikel beschrijft de verschillende procedures voor het screenen van ratten en muizen te detecteren endo-of ectoparasitism. Verschillende diagnostische assays zal worden aangetoond, zowel die geschikt zijn voor gebruik op levende dieren en die gebruikt worden na euthanasie van het dier. Foto's om te helpen bij de identificatie van de rat en muis parasieten zal worden opgenomen.
Abstract
Interne en externe parasieten blijft een belangrijke zorg in het laboratorium knaagdieren faciliteiten, en vele onderzoeksfaciliteiten haven een aantal geparasiteerd dieren. Alvorens een onderzoek van dieren op parasieten, moeten twee dingen worden overwogen. Een: wat gebruik wordt gemaakt van de verzamelde informatie, en twee: die test is het meest geschikt is. Wetende dat de dieren geparasiteerd kan iets zijn dat de faciliteit accepteert, maar er is vaak een noodzaak om dieren te behandelen en daarna naar de effectiviteit van behandeling te bepalen. Parasieten kunnen worden gedetecteerd in dieren via verschillende technieken, met inbegrip van monsters genomen van live of gedood dieren. Historisch gezien, de proeven met de grootste diagnostische gevoeligheid die nodig euthanasie van het dier, hoewel PCR heeft het mogelijk zeer gevoelige testen op verschillende soorten parasieten. Dit artikel toont aan procedures voor de detectie van endo-en ectoparasieten bij muizen en ratten. Dezelfde procedures zijn van toepassing op andere knaagdieren, hoewel de soort van de gevonden parasieten zullen verschillen.
Protocol
1. Endoparasiet onderzoek (tabel 1)
1. Perianale tape test (zie ook paragraaf 5, deze worden meestal uitgevoerd op hetzelfde tijdstip)
- Verwijder een lengte van duidelijke, niet mat, cellofaan tape van een dispenser. Tape moet lang genoeg te hanteren zijn door de ene kant, zonder het aanraken van de midden (ongeveer 5 cm). Het kan makkelijker zijn om meerdere lengtes afzien in een keer, waarmee ze aan de rand van een schoon werkvlak en gebruik als dat nodig is.
- Lift een muis uit zijn kooi en plaats op de kooi deksel, terwijl u hem aan de staart. Het uitvoeren van deze actie in een laminaire flow kast of bioveiligheid kabinet als de gezondheidstoestand van het dier het nodig heeft.
- Weerhoudt de muis door de staart, de intrekking van haar achterpoten uit de kooi. Pak het einde van de band tussen duim en wijsvinger, dan geldt het midden van de band stevig aan perineum van de muis, met inbegrip van het perianale gebied meerdere malen. Haar moet worden gezien als aanhanger van de tape zijn voor de test te worden als succesvol beschouwd.
- Plaats de muis terug in de kooi.
- Plaats een druppel van minerale olie op een label schoon glasplaatje, gelden de tape aan de dia, dan nog een druppel van minerale olie. Dek af met een glazen deksel slip.
- Lees het objectglaasje met de 10x en 40x objectieven op een lichtmicroscoop. De perianale tape-test is het beste op het opsporen Syphacia eieren, hoewel andere parasiet eieren worden soms gevonden.
2. Fecale flotatie
- Monteer flotatie oplossing, een platte bodem flacon (pil flacon of fecale flotatie apparaat zoals Ovatector), petrischaaltje dekglas, microscoopglaasje, en applicator / roerstaafjes. Drijfvermogen oplossing, zoals Fecasol, moet een soortelijk gewicht van 1.20 tot 1,30 en kunnen worden gemaakt van verschillende natriumzouten, suiker, zinksulfaat, of gekocht commercieel. (Tabel 2)
- Verzamel 2-5 fecale pellets uit de kooi of vers uit de dier (en) in de beursgang kamer. Als uitwerpselen zijn zeer droog, hetzij als gevolg van leeftijd of soorten productie van de ontlasting, het bevochtigen van de ontlasting met 500 pi van 0,9% zoutoplossing kan gunstig zijn.
- Plaats de flacon in de petrischaal op het werkvlak te beschermen tegen overstroming van de ontbonden uitwerpselen. Voeg een klein volume van de flotatie medium en aardappelpuree en roer goed. Geen grote stukken materiaal moet blijven. Blijf flotatie medium toe te voegen tot een meniscus vormt boven de rand van de flacon.
- Plaats het deksel slip op de meniscus en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Parasiet eieren en sommige protozoa oöcysten zal stijgen naar de top en zich houden aan de dekglas.
- Na de incubatie, lift en omkeren van de dekglas. Plaats het deksel slip op een glazen microscoopglaasje.
- Onderzoek de schuif met de 10x en 40x objectieven onder een lichtmicroscoop.
- Hoewel de low-tech en gemakkelijk te presteren in het algemeen, is deze techniek niet geschikt voor muizen of ratten. In de regel is het meer geschikt voor dieren die een groter volume van de ontlasting te produceren.
3. Fecale concentratie en centrifugeren
- Monteer flotatie oplossing, centrifugebuis, dekglas, microscoopglaasje, en applicator / roeren stokken en buizen caps. Flotatie-oplossing moet hebben een soortelijk gewicht van 1.18-1.30 en kunnen worden gemaakt van verschillende natriumzouten, suiker, zinksulfaat, of gekocht commercieel. (Tabel 2)
- Verzamel 20-10 fecale pellets uit de kooi of vers uit de dier (en) in een verzameling buis. Als uitwerpselen zijn zeer droog, hetzij als gevolg van leeftijd of soorten productie van de ontlasting, het bevochtigen van de ontlasting met 500 pi van 0,9% zoutoplossing of met de beursgang oplossing die u gebruikt kan gunstig zijn.
- Mengmonster in een geschikte flotatie-oplossing in een glazen centrifugebuis. Mechanisch roeren met een vortexer kan worden gebruikt om monsters te mengen. Als een vortexer wordt gebruikt, moet snap caps worden gelegd op de toppen van de buis om morsen en kruisbesmetting te voorkomen. Routinematig worden monsters bereid in 1.18 soortelijk gewicht zinksulfaat, maar andere oplossingen kunnen worden gebruikt naast (in een aparte voorbereiding buis) of ter vervanging.
- Voeg extra flotatie oplossing voor elke buis een lichte positieve meniscus op elke buis. Breng een plastic cover slip aan elke buis, en ervoor zorgen dat volledig contact met de buis lip is gemaakt. Plaats tube (s) in de centrifuge.
- Centrifugeer op ongeveer 616-760 RCF gedurende 10 minuten. Als dekglaasjes verloren gaan of worden afgebroken tijdens het centrifugeren proces, kan een nieuw dekglas worden geplaatst op het monster buis en de buis kan voorzichtig worden gekanteld, zodat de meniscus de nieuwe cover slip raakt. Geen extra centrifugeren is niet nodig.
- Verwijder het deksel slip uit centrifugebuis en plaats deze op een label, schone glazen microscoopglaasje. Als er meerdere oplossingen centrifugatie werden gebruikt om een monster ontlasting te evalueren, kunnen twee dekglaasjes worden geplaatst op dezelfde dia.
- Vlekken op de dia met jodium. Dit zorgt voor een eAsier identificatie van cysten.
- Onderzoek de schuif met de 10x en 40x objectieven op een lichtmicroscoop.
4. Rechtstreeks onderzoek van de darmen voor helminten en protozoa
- Plaats de muis of rat gedood karkas in dorsale decubitus op een schone dissectie board of soortgelijk werk oppervlak.
- Met behulp van een tang, til de buikwand in het genitale gebied. Met een schaar voorzichtig incise de ventrale buikwand van het genitale gebied aan de onderkant van de ribbenkast het verwijderen van zowel de huid en de spieren en het blootstellen van de darmen. Verwijder de ingewanden, beginnend bij de twaalfvingerige darm (het segment van de darm te beginnen bij de uitgang van de maag) en blijft de dalende dikke darm (het segment van de darm die eindigt bij de anus en bevat meestal gevormd ontlasting).
- Plaats darmen in een 100 ml petrischaal. Verzamel een deel van de blindedarm en twaalfvingerige darm van het dier laten inslapen en leg ze op een dissectie boord. Lengte incise elke intestinale segment naar de mucosa bloot te leggen.
- Met behulp van een schaar, knip de rest van darmen in kleine secties. Voeg genoeg leidingwater om de schotel te dompelen nauwelijks de verzamelde weefsel.
- Incubeer het monster mengsel bij 35-40 ° C in een laboratorium oven of incubator voor een minimum van 10 minuten. Dit zal bevrijden en bloot luminale helminten. Terwijl het monster is uitbroeden, het uitvoeren van de volgende stappen.
- Plaats twee druppels van 0,9% zoutoplossing naast elkaar op een enkel label glijbaan, om voor de voorbereiding van de monsters toestaan van twee intestinale segmenten (twaalfvingerige darm en blindedarm).
- Warmte steriliseren en cool een entnaald of gelijkwaardig.
- Schraap het slijmvlies van de twaalfvingerige darm en plaats de geschraapt aan de linkerkant van de dia (zij het dichtst bij de rand van frosted).
- Schraap het slijmvlies van de blindedarm en plaats de geschraapt uit aan de rechterkant van de dia.
- Top van de geschraapt met een dekglas. Onderzoek bereid schuif het gebruik van de 40x doelstelling van een fase-contrast microscoop), een stijging van vergroting als nodig is voor identificatie. Als parasieten worden gevonden, te identificeren op basis van morfologie.
- De schotel inhoud zal klaar zijn voor onderzoek door dit punt. Onderzoek de schotel inhoud onder een dissectie microscoop. Gebruik een sonde of een applicator blijven als nodig is om de inhoud te verplaatsen binnen de schotel aan een grondig onderzoek te voltooien. Als Oxyuren aanwezig zijn zullen ze verschijnen als kleine, witte, haar-achtige wormen. Als lintwormen aanwezig zijn, zullen ze verschijnen als gesegmenteerd, platte wormen (groter dan de draad-achtige Oxyuren).
- Als helminten ontdekt of vermoedt, het verzamelen van het monster met behulp van een klein pincet.
- Monteer het monster op een label, schoon glasplaatje in een druppel paraffine of minerale olie en leg een deksel slip op de top van het monster. Onderzoek de schuif met de 10x en 40x objectieven op een lichtmicroscoop.
2. Ectoparasiet onderzoek (tabel 3)
5. Fur plukken onderzoek tegen ectoparasieten (tape-test)
- Verwijder een lengte van duidelijke, niet mat, cellofaan tape van een dispenser. Tape moet lang genoeg te hanteren zijn door de ene kant, zonder het aanraken van de midden (ongeveer 5 cm). Het kan makkelijker zijn om meerdere lengtes afzien in een keer, waarmee ze aan de rand van een schoon werkvlak en gebruik als dat nodig is.
- Lift een muis of rat uit zijn kooi en plaats op de kooi deksel, terwijl u hem aan de staart. Het uitvoeren van deze actie in een laminaire flow kast of bioveiligheid kabinet als de gezondheidstoestand van het dier het nodig heeft.
- Beperken van de muis of rat. Pak de vacht met hemostats en zacht vacht plukken van scapulier van de muis gebied, ventrale cervicale regio, oksel gebied, lies gebied, en dorsale romp. Plaats de vacht op de band. Haar moet worden gezien als aanhanger van de tape zijn voor de test te worden als succesvol beschouwd. Plaats de muis of rat terug in zijn kooi.
- Plaats een druppel van minerale olie op een label schoon glasplaatje; toepassing van de band, toen nog een daling van minerale olie. Dek af met een glazen deksel slip.
- Lees het objectglaasje met de 10x en 40x objectieven onder een lichtmicroscoop.
- Dit onderzoek is het beste voor het opsporen van vacht mijten, zoals Radfordia, Myobia, en Myocoptes.
6. Huid schrapen
- Monteer de volgende materialen: dier te testen, minerale olie, microscoopglaasje, dekglas, scalpel en schaar. Als deze test moet worden uitgevoerd op levende dieren, moeten ze verdoofd worden voordat u begint.
- Proef de dorsum de buurt van de basis van de staart en de temporale regio van het hoofd. Als alternatief kan de huid laesies en / of andere sites worden geschraapt.
- Diep schrapen van de huid met de scalpel in de tegenovergestelde richting van de haargroei, de epidermis eroderen. Het trimmen van de vacht voorafgaand aan de scraping kunnen verbeteren screening de gevoeligheid door het verminderen van visuele obstructie (overtollige haren) op deglijbaan.
- Plaats een druppel olie op de dia. Breng het monster op de olie langs het mes af te vegen (met voorbeeld bevestigd) op het oppervlak van de dia. Voeg extra olie aan de dia, indien nodig, en leg er een dekglas.
- Lees het objectglaasje met de 10x en 40x objectieven onder een lichtmicroscoop.
- De huid schrapen wordt meestal gebruikt om Demodex (en dermatophytic schimmels) te detecteren.
7. Rechtstreeks onderzoek van de vacht
- Plaats de muis of rat gedood op het podium van een dissectiemicroscoop.
- Onderzoek de haren van de vacht op ongeveer 10x met behulp van een applicator stick of een soortgelijk instrument om een deel van de haren en observeren de basis van de haarschacht.
- Onderzoek van de schedel, tussen de ogen en de oorschelpen, tussen de oorschelpen, tussen de schouderbladen, onder de kaak, en de lies en oksel gebieden. Als alternatief kan de hele karkas worden onderzocht.
- Verzamel alle ectoparasieten of verdachte materiaal gezien met een kleine pincet. Ectoparasieten kan er vaak uit als roos of een gele wasachtige opbouw aan de basis van een haarschacht of direct op de huid.
- Monteer het monster op een schoon glasplaatje in een druppel paraffine of minerale olie en leg een deksel slip op de top van het monster. Onderzoek de schuif met de 10x en 40x objectieven onder een lichtmicroscoop.
3. Representatieve resultaten:
Zie bijgevoegde bestanden identificeren van de volgende parasieten: (Let op: deze procedures zal elke ei, worminfecties, of cyste aanwezig zijn op te sporen in de ontlasting of op de huid en vacht, alleen een paar van deze staan hieronder vermeld)
Endoparasieten:
| Syphacia Muris (ei, worm) | Chilomastix bettencourti |
| Syphacia obvelata (ei, worm) | Hexamastix Muris |
| Aspiculuris tetraptera (ei, worm) | Retortamonas sp. |
| Rodentolepis nana (ei, worm) | Giardia spp. |
| Tritrichomonas Muris | Spironucleus Muris |
| Entamoeba Muris |
Ectoparasieten:
| Myocoptes musculinis | Radfordia affinis |
| Myocoptes musculinis | Radforida ensifera |
| Myobia musculi |
| Tape-test | Fecale flotatie | FCC | Direct examen een | PCR | |
| Protozoa | - | + | + + | + + + | + + + / NA 2 |
| Metazoa | |||||
| Pinworm | + / - 3 | + / - 4 | + 4 | + + + | + + + |
| Lintworm 5 | - | + | + + | + + + | NA |
| Andere rondwormen 5 | - | + | + + + | + + + | NA |
1. Deze methode vereist euthanasie van het dier.
2. Er zijn geen PCR-detectie-methoden die momenteel beschikbaar zijn voor elke protozoa.
3. Deze methode is meest geschikt is om Syphacia spp op te sporen.
4. Deze methode zal wellicht meer Aspiculuris te detecteren, en minder kans op Syphacia op te sporen.
5. Lintwormen en rondwormen andere dan de maden zijn zeer zeldzaam in het moderne laboratorium muizen en ratten.
Tabel 1. Klasse van endoparasiet en passende detectiemethode. Sommige methoden vereist euthanasie van het dier. NA geeft methode is op dit moment niet beschikbaar voor deze parasieten + geeft geschiktheid van de methode voor de detectie van de parasiet in kwestie, en -. Geeft aan dat de methode niet wordt aanbevolen voor deze parasiet.
| Oplossing | Soortelijk gewicht | Ingrediënten per 1 l H 2 O |
| Natriumchloride | 1.20 | 311 g natriumchloride |
| Natriumnitraat | 1.20 | 338 g natrium nitraat |
| Natriumnitraat | 1.30 | 616 g natrium nitraat |
| Suiker | 1.20 | 1170 g sucrose een |
| Sheather's suiker | 1.27-1.30 | 1563 g sucrose een |
| Zinksulfaat | 1.18 | 493 g zinksulfaat |
1. Deze oplossingen vereisen koeling of de toevoeging van 9 ml fenol als conserveermiddel.
Tabel 2. Fecale beursgang oplossingen (van Smith et al.).
| Fur plukken (tape-test) | Huid schrapen een | Direct examen een | PCR | |
| Luizen | - | - | + + | NA |
| Mijten | + | + | + + + | + + + / NA 3 |
| Vlooien 4 | - | - | + | NA |
| Teken 4 | - | - | + + | NA |
1. Deze methode vereist anesthesie als het moet worden uitgevoerd op een levend dier.
2. Deze methode vereist euthanasie van het dier.
3. Er zijn geen PCR-detectie-methoden die momenteel beschikbaar zijn voor elke soort van mijt.
4. Vlooien en teken zijn uiterst zeldzaam in de moderne proefdieren faciliteiten.
Tabel 3. Class van ectoparasiet en passende detectiemethode. Sommige methoden vereist euthanasie van het dier, en andere methoden vereist verdoving om ze uit te voeren in levende dieren. NA geeft methode is op dit moment niet beschikbaar voor deze parasieten. NA geeft methode is op dit moment niet beschikbaar voor deze parasieten + geeft geschiktheid van de methode voor de detectie van de parasiet in kwestie, en -. Geeft aan dat de methode niet wordt aanbevolen voor deze parasiet.
Discussion
Bij het werken in een laboratorium, moet de veiligheid altijd een bron van zorg. Vergeet niet de juiste beschermingsmiddelen te dragen bij het werken met dieren en om uw werkplek schoon met een desinfecterend middel voor en na. Deze methoden zijn vooral bedoeld om eventuele parasieten van het laboratorium knaagdieren te vinden in de onderzochte locaties, dat wil zeggen, ze kunnen detecteren exotische of uiterst zeldzaam parasieten als de meer gebruikelijke draadwormen en vacht mijten. Hoewel ze zijn eveneens van toepassing op andere soorten, misschien wilde knaagdieren hebben extra parasieten op locaties zoals lever, subcutis en de hersenen, niet geëvalueerd door de bovenstaande methoden.
Disclosures
De auteurs zijn alle medewerkers van de Charles River, een leverancier van diagnostische tests en reagentia, met inbegrip van de tests hierboven beschreven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting board | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Cat #36114 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910, G204 | 23mm blades, 3.5” length, straight |
| Medium scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6808, G207 | 5” |
| Forceps-Curved | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 (M1/21004) | 4.5”, serrated, slight curve |
| Forceps-Microdissecting | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5238 | Hudson-(EWALD) |
| Forceps-Tissue Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8160 | Rat tooth |
| Metal probe | VWR international | Cat#25778-000 | |
| Hemostats | Vantage | V97-48 | |
| Applicator sticks | Puritan | 6in Applicators, Ref#807 | |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ51, Schott, ACE1 | |
| Petri dish | VWR international | 100mm, Cat#3401PDNL | |
| Cover slips | VWR international | Micro cover glass, Cat#48366-067 | |
| Slides | VWR international | VistaVision microscope slides Cat#16004-368 | |
| Inoculating loop | VWR international | Cat#50815-040 | |
| Light microscope | Olympus Corporation | Model#BX41TF | |
| Laboratory oven | Quincy Lab Inc. | Model 10 Lab Oven | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allegra X-12R | |
| Vortexer | VWR international | Mini-Vortexer | |
| Test tube | Kimble Chase | 15 ml disposable centrifuge tube, Cat#73790-15 | |
| Cover slips | VWR international | Plastic microscope cover slips, 22mm, Cat#48376-049 | |
| White caps | VWR international | Cat#60869-089 | |
| Iodine | Rowley biochemical institute | Cat#SO-364 | |
| Zinc sulfate | Sigma-Aldrich | Cat#1000917519, Z4750-500G | |
| Sucrose | Mallinckrodt Baker Inc. | Cat#8360-06 | |
| Phenol | EMD Millipore | Cat#PX0510-1 | |
| Cellophane tape | Staples | Invisible tape, Cat#504712 | |
| Mineral oil | Mallinckrodt Baker Inc. | Cat#6358 |
References
- Baker, D. G. Chapter 23. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).
- Baker, D. G. Chapter 11. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. , Blackwell. 303-398 (2007).
- Owen, D. G. Parasites of Laboratory Animals. 12, Royal Society of Medicine. (1992).
- Pritchett, K. R. Chapter 22. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).
- Smith, P. H., Wiles, S. E., Malone, J. B., Monahan, C. M. Chapter 1. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. , Blackwell. 1-13 (2007).
- Wasson, K. Chapter 21. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Vol. 2, Academic Press. 517-550 (2007).
