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Immunology and Infection

Ecto和实验室大鼠和小鼠体内寄生虫的诊断

doi: 10.3791/2767 Published: September 6, 2011

Summary

本文介绍了筛选大鼠和小鼠的各种程序,以检测内或ectoparasitism。几种诊断方法将被证明,那些适合使用活的动物和那些使用后的动物实施安乐死。将包括照片,以帮助确定大鼠和小鼠的寄生虫。

Abstract

内部和外部的寄生虫仍然是一个显著的关注,在实验室灭鼠设施和许多科研设施海港一些寄生的动物。开始对动物进行寄生虫检查前,应考虑两件事情。一:有什么用,将所收集的信息,和两个:这是最合适的测试。得知是寄生的动物,可能是设施接受的东西,但往往有一个需要治疗的动物,然后才能确定治疗的疗效。发现动物体内的寄生虫可能通过各种技术,包括从居住或实施安乐死的动物抽取样本。从历史上看,最大的诊断敏感性测试所需的动物实施安乐死,虽然PCR允许几种类型的寄生虫的高灵敏度的测试。本文演示程序的检测内,并在小鼠和大鼠体外寄生虫。同样的程序适用于其他啮齿类动物,虽然发现寄生虫的种类会有所不同。

Protocol

1。 Endoparasite考试(见表1)

1。肛周胶带测试(见第5节;这些通常是在同一时间执行)

  1. 从自动售货机中取出一个明确的长度,不磨砂,透明胶带。胶带应足够长的时间来处理,而不触及中间(约5厘米)一端。它可能会更容易免除一次几个长度,连接到一个干净的工作表面的边缘,并使用需要。
  2. 电梯从一只老鼠笼和笼盖的地方,它的尾巴。层流柜或生物安全柜中,如果​​动物的健康状况要求它执行此操作。
  3. 抑制鼠标的尾巴,从笼子里解除它的后腿。抓住拇指和食指之间的磁带结束,然后应用磁带中坚决鼠标会阴,包括肛周面积几次。头发,应看作是附着到磁带的检测,被认为是成功的。
  4. 将在笼子里的鼠标背部。
  5. 放在一个标记洁净的载玻片一滴矿物油,适用于磁带的幻灯片,然后又一滴矿物油。盖上玻璃盖滑。
  6. 阅读显微镜幻灯片,使用光学显微镜上的10倍和40倍的目标。肛周胶带测试是最好的检测Syphacia鸡蛋 ,虽然有时会发现其他寄生虫卵。

2。粪便浮选

  1. 组装浮选解决方案,平底瓶(丸小瓶或Ovatector如粪便浮选设备),培养皿,盖玻片,显微镜幻灯片,并撒施/搅拌棒。浮选解决方案,如Fecasol,应该有一个比重1.20-1.30具体,可制成各种钠盐,糖,硫酸锌,或购买商业。 (见表2)
  2. 收集到的浮选室2-5从笼子里的粪粒或新鲜的动物(S)。如果粪便是极其干燥的,无论是由于年龄或物种产生的排泄物,润燥用0.9%生理盐水500μL的粪便可能是有益的。
  3. 放置在培养皿中的小瓶保护工作表面溶解粪便溢出。添加浮选剂和糊状物的体积小,彻底搅拌。没有大块的材料应维持不变。继续添加到小瓶的边缘上方的半月板形式介质浮选。
  4. 将盖玻片上的半月板,在室温下孵育15分钟。寄生虫卵和一些原虫的卵囊将上升到顶部,坚持以盖玻片。
  5. 孵育后,升降机及反转盖玻片。将盖玻片上的玻璃显微镜幻灯片。
  6. 检查的幻灯片,使用光学显微镜下的10倍和40倍的目标。
  7. 虽然技术含量低,易于操作,一般来说,这种技术是不建议对小鼠或大鼠。作为一项规则,它是更合适的动物粪便产生量较大的。

3。粪便中的浓度和离心

  1. 组装浮选解决方案,离心管中,盖玻片,显微镜幻灯片,和撒施/搅拌棒和管帽。浮选解决方案应该有一个比重1.18-1.30具体,可制成各种钠盐,糖,硫酸锌,或购买商业。 (见表2)
  2. 一个收集管收集到2-10从笼子里的粪便颗粒或新鲜的动物(S)。如果粪便极为干燥,无论是由于年龄或物种产生的排泄物,粪便润燥500微升0.9%生理盐水或用浮选溶液您使用的可能是有益的的。
  3. 玻璃离心管内混合在一个合适的浮选解决方案样品。可用于与vortexer机械搅拌混合样品。如果使用一个vortexer,弹簧帽应放在管的顶部,以防止溢出和交叉污染。常规样品准备在1.18比重硫酸锌,但是其他的解决方案可用于除了在一个单独的准备管或替代。
  4. 每管添加额外的浮选解决方案,以形成积极在每个管有轻微的半月板。应用塑料盖玻片,每管,确保管唇接触。放置管(S)进入离心机。
  5. 在约616-760离心力离心10分钟。一个新的盖玻片,如果盖玻片在离心过程中丢失或破,可放在样品管和管可以轻轻放倒,使半月板接触到新的盖玻片。没有额外的离心是必要的。
  6. 删除一个标记,干净的玻璃显微镜玻片上覆盖离心管中的支路和地点。如果有多个离心解决方案被用来评价一个粪便样本,两个盖玻片可能被放在同一张幻灯片上。
  7. 与碘染色的幻灯片。这使得电子asier鉴定囊肿。
  8. 检查幻灯片,使用光学显微镜上的10倍和40倍的目标。

4。直接检查肠道寄生虫和原生动物

  1. 将安乐死鼠标在背斜卧在一个干净的夹层板或类似的工作表面或大鼠胴体。
  2. 使用镊子,电梯在生殖器部位的腹壁。用剪刀,小心地切开腹腹壁从生殖器区域除去皮肤和肌肉和肋骨露出的肠子基地。取出肠子,开始在十二指肠(小肠开始在胃的出口段)和继续降结肠(段结束在肛门和通常包含形成粪便的肠道)。
  3. 在100毫升的培养皿放置的肠子。收集从安乐死的动物和解剖板盲肠和十二指肠的一部分。段纵向切割每个肠道黏膜暴露。
  4. 用剪刀,剪切成小部分,其余的肠子。加入足够的自来水几乎淹没收集组织的菜。
  5. 在35-40℃在实验室烘箱或至少10分钟的孵化器,孵育样品的混合物。这将解放和揭露管腔寄生虫。而样本是孵化,进行以下步骤。
  6. 将两个下降0.9%生理盐水侧方的单个标记的幻灯片,允许从两个肠段(十二指肠和盲肠)的样品制备。
  7. 热杀菌和冷却接种环或同等学历。
  8. 刮十二指肠粘膜,并放置在左侧的幻灯片(最接近磨砂边侧)刮出。
  9. 刮盲肠黏膜和地点从右侧的幻灯片刮出。
  10. 顶部与盖玻片刮出。检查准备幻灯片,使用相衬显微镜下的40倍,目标);需要识别的增加放大。如果发现寄生虫,确定根据形态。
  11. 这道菜的内容将准备检查这一点。在解剖显微镜下检查的菜内容。使用作为探针或涂药棒内移动盘的内容,完成了全面检查。如果存在蛲虫,它们将出现小,白色,毛发状的蠕虫。如果绦虫存在,他们将出现分割,平面蠕虫(大于线程像蛲虫)。
  12. 如果蠕虫被发现或怀疑,用一个小镊子对收集标本。
  13. 安装在一个标记,石蜡或矿物油下降洁净的载玻片标本,标本上放置盖玻片。检查幻灯片,使用光学显微镜上的10倍和40倍的目标。

2。体外寄生虫检查(表3)

5。毛皮动物内脏外寄生虫检查(胶带测试)

  1. 从自动售货机中取出一个明确的长度,不磨砂,透明胶带。胶带应足够长的时间来处理,而不触及中间(约5厘米)一端。它可能会更容易免除一次几个长度,连接到一个干净的工作表面的边缘,并使用需要。
  2. 电梯从鼠标或老鼠笼和笼盖的地方,它的尾巴。层流柜或生物安全柜中,如果​​动物的健康状况要求它执行此操作。
  3. 抑制小鼠或大鼠。抓住皮草与止血和鼠标的肩胛区,腹侧颈部,腋窝区域,腹股沟区,背臀部,轻轻地摘下从毛皮。放置在磁带上的毛皮。头发,应看作是附着到磁带的检测,被认为是成功的。将它在笼中的小鼠或大鼠背部。
  4. 放置一个标记洁净的载玻片上滴的矿物油,适用于磁带,然后又一滴矿物油。盖上玻璃盖滑。
  5. 阅读使用光显微镜下的10倍和40倍的目标的显微镜幻灯片。
  6. 这种检查是最好的检测,如Radfordia,MyobiaMyocoptes皮毛螨。

6。皮肤刮

  1. 汇编下列材料:动物进行测试,矿物油,显微镜载玻片,盖玻片,手术刀,剪刀。如果这个测试是在活的动物,它们应该被麻醉,然后再开始。
  2. 样品背部的尾巴和头部颞区附近的基地。另外,皮肤损伤和/或其他网站可能会被刮掉。
  3. 深用手术刀刀片刮皮肤,毛发的生长方向相反,削弱表皮。修剪毛发刮前,可能会提高筛查的灵敏度,减少视觉上阻塞(多余的毛发)幻灯片。
  4. 在幻灯片上放置一个石油下降。应用范例滴油抹刀片表面上的幻灯片(与样本附后)。如果有必要的幻灯片,并与盖玻片上添加额外的石油。
  5. 阅读使用光显微镜下的10倍和40倍的目标的显微镜幻灯片。
  6. 皮肤刮一般是用来检测的蠕形螨(和dermatophytic真菌) 。

7。直接检查的​​皮毛

  1. 将安乐死鼠标或大鼠解剖显微镜的阶段。
  2. 检查的皮约10倍的头发,使用涂药棒或类似的文书部分的头发和观察基地的头发轴。
  3. 检查颅地区,眼睛和羽片之间的羽片,肩胛之间,下颌骨,以及腹股沟和腋窝地区之间。另外,整个胴体进行审查。
  4. 收集任何体外寄生虫或使用小镊子对可疑物质看到。体外寄生虫往往可能看起来像头皮屑或黄色的头发轴的基地,或直接在皮肤上的蜡质堆积。
  5. 山石蜡或矿物油的下降,在洁净的载玻片上的标本,标本上放置盖玻片。检查的幻灯片,使用光学显微镜下的10倍和40倍的目标。

3。代表性的成果:

参见确定下面的寄生虫附加文件:(注:这些程序会检测到任何鸡蛋,蠕虫,或囊肿目前,在粪便中,或在皮肤上和皮毛;其中只有少数是下面列出)

体内寄生虫:

Syphacia muris(鸡蛋,蠕虫病毒) Chilomastix bettencourti
Syphacia obvelata(鸡蛋,蠕虫病毒) Hexamastix muris
Aspiculuris tetraptera(鸡蛋,蠕虫病毒) Retortamonas SP。
Rodentolepis娜娜 (鸡蛋,蠕虫病毒) 贾第虫菌。
Tritrichomonas muris Spironucleus muris
阿米巴muris

体外寄生虫:

Myocoptes musculinis Radfordia affinis
Myocoptes musculinis Radforida ensifera
Myobia musculi
  胶带测试 粪便浮选 联邦通讯委员会 直接考试1 PCR扩增
原生动物 - + + + + + + / NA 2
后生动物
蛲虫 + / - 3 + / - 4 + 4个 + + + +
绦虫5 - + + + + 不适用
5其他蛔虫 - + + + + + 不适用

1,这种方法需要的动物实施安乐死。
2,有没有PCR检测方法,目前每原生动物。
3,这种方法是最合适的检测Syphacia SPP。
4,此方法将会更容易检测Aspiculuris,并不太可能检测Syphacia。
5,绦虫和蛔虫,蛲虫等,是非常罕见的,在现代化的实验室小鼠和大鼠。

表1。类的endoparasite和适当的检测方法。有些方法会要求安乐死的动物。 NA表示方法目前没有可用于这些寄生虫+表示寄生虫问题的检测方法的适用性, - 表明,该方法是不建议,寄生虫。

解决方案 比重 成份每公升H 2 O
氯化钠 1.20 311克氯化钠
硝酸钠 1.20 338克硝酸钠
硝酸钠 1.30 616克硝酸钠
1.20 1170克, 蔗糖 1
Sheather的糖 1.27-1.30 1563年克蔗糖1
硫酸锌 1.18 493克硫酸锌

1,这些解决方案需要冷藏或加入9毫升苯酚作为防腐剂。

表2。粪便浮选解决方案(Smith 等人。)

毛皮动物内脏(磁带测试) 皮肤刮1 直接考试1 PCR扩增
虱子 - - + 不适用
+ + + + + + + / NA 3
跳蚤4 - - + 不适用
4 - - + 不适用

1。这种方法需要麻醉,如果它是一个活的动物进行。
2,这种方法需要的动物实施安乐死。
3,有没有目前螨的每一个物种的PCR检测方法。
4,跳蚤和扁虱是极其罕见的,在现代化的实验动物设施。

表3类外寄生物和适当的检测方法。有些方法会要求安乐死的动物,和其他方法将需要麻醉执行他们在活的动物。 NA表示方法目前没有这些寄生虫。 NA表示方法目前没有可用于这些寄生虫+表示寄生虫问题的检测方法的适用性, - 表明,该方法是不建议,寄生虫。

Discussion

在实验室工作时,安全应始终关注的问题。记得穿适当的防护设备,与动物的工作时,并用消毒剂清洁之前和之后您的工作站。这些方法主要是设计中的位置找到任何啮齿类实验动物寄生虫检查,也就是说,他们可以检测外来的或极其罕见的寄生虫以及更常见的蛲虫和毛皮螨。虽然它们同样适用于其他物种,野生啮齿类动物可能有额外寄生虫,如肝,皮下和脑的位置,而不是通过上述方法进行评估。

Disclosures

作者是查尔斯河,诊断测试和试剂的供应商,包括上文所述的测试的所有员工。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cutting board Thermo Fisher Scientific, Inc. Cat #36114
Small scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5910, G204 23mm blades, 3.5” length, straight
Medium scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6808, G207 5”
Forceps-Curved Roboz Surgical Instruments Co. RS-8254 (M1/21004) 4.5”, serrated, slight curve
Forceps-Microdissecting Roboz Surgical Instruments Co. RS-5238 Hudson-(EWALD)
Forceps-Tissue Forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-8160 Rat tooth
Metal probe VWR international Cat#25778-000
Hemostats Vantage V97-48
Applicator sticks Puritan 6in Applicators, Ref#807
Dissecting microscope Olympus Corporation SZ51, Schott, ACE1
Petri dish VWR international 100mm, Cat#3401PDNL
Cover slips VWR international Micro cover glass, Cat#48366-067
Slides VWR international VistaVision microscope slides Cat#16004-368
Inoculating loop VWR international Cat#50815-040
Light microscope Olympus Corporation Model#BX41TF
Laboratory oven Quincy Lab Inc. Model 10 Lab Oven
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X-12R
Vortexer VWR international Mini-Vortexer
Test tube Kimble Chase 15 ml disposable centrifuge tube, Cat#73790-15
Cover slips VWR international Plastic microscope cover slips, 22mm, Cat#48376-049
White caps VWR international Cat#60869-089
Iodine Rowley biochemical institute Cat#SO-364
Zinc sulfate Sigma-Aldrich Cat#1000917519, Z4750-500G
Sucrose Mallinckrodt Baker Inc. Cat#8360-06
Phenol EMD Millipore Cat#PX0510-1
Cellophane tape Staples Invisible tape, Cat#504712
Mineral oil Mallinckrodt Baker Inc. Cat#6358

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Baker, D. G. Chapter 11. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. Blackwell. 303-398 (2007).
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  4. Pritchett, K. R. Chapter 22. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).
  5. Smith, P. H., Wiles, S. E., Malone, J. B., Monahan, C. M. Chapter 1. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. Blackwell. 1-13 (2007).
  6. Wasson, K. Chapter 21. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Vol. 2, Academic Press. 517-550 (2007).
Ecto和实验室大鼠和小鼠体内寄生虫的诊断
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Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice. J. Vis. Exp. (55), e2767, doi:10.3791/2767 (2011).More

Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice. J. Vis. Exp. (55), e2767, doi:10.3791/2767 (2011).

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