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Immunology and Infection

Diagnose von Ekto-und Endoparasiten in Laborratten und Labormäusen

doi: 10.3791/2767 Published: September 6, 2011

Summary

Dieser Artikel beschreibt verschiedene Verfahren für das Screening von Ratten und Mäusen zu Endo-oder ectoparasitism erkennen. Mehrere diagnostische Assays gezeigt werden, sowohl die für den Einsatz von lebenden Tieren und denen, die nach Euthanasie der Tiere verwendet. Fotos zur Identitätsfeststellung von Ratte und Maus Parasiten Hilfe einbezogen werden.

Abstract

Interne und externe Parasiten bleiben ein wesentliches Anliegen in Labor Nagetier Einrichtungen, und viele Forschungseinrichtungen Hafen einige parasitierten Tiere. Bevor auf einer Untersuchung der Tiere auf Parasiten, sollten zwei Dinge berücksichtigt werden. One: welchen Gebrauch die gesammelten Informationen getroffen werden, und zwei: die Prüfung ist die am besten geeignete. Wissend, dass Tiere parasitiert sind vielleicht etwas, dass die Anlage akzeptiert werden, aber es ist oft ein Bedürfnis, Tiere zu behandeln und dann auf die Wirksamkeit der Behandlung zu bestimmen. Parasiten können Tiere durch verschiedene Techniken, einschließlich Proben von lebenden oder eingeschläfert Tieren entnommen erkannt werden. Historisch gesehen, werden die Tests mit dem größten diagnostische Sensitivität Euthanasie der Tiere, obwohl PCR hat eine hohe Empfindlichkeit Tests für verschiedene Arten von Parasiten erlaubt. Dieser Artikel zeigt, Verfahren für den Nachweis von Endo-und Ektoparasiten bei Mäusen und Ratten. Das gleiche Verfahren sind bei anderen Nagetieren, obwohl die Arten von Parasiten gefunden werden, abweichen.

Protocol

1. Endoparasit Untersuchung (Tabelle 1)

1. Perianale Tape-Test (siehe auch Abschnitt 5; diese sind in der Regel zur gleichen Zeit durchgeführt)

  1. Entfernen einer Länge von klaren, nicht mattiert, Klebeband aus einem Spender. Band sollte lang genug sein zu handhaben mit einem Ende ohne Berührung der Mitte (ca. 5 cm). Es kann einfacher sein, mehrere Längen auf einmal zu verzichten, die Befestigung an den Rand einer sauberen Arbeitsfläche und mit je nach Bedarf.
  2. Heben Sie eine Maus aus dem Käfig und auf den Käfig Deckel, wobei sie an der Rute. Führen Sie diese Aktion in einer laminaren Strömung Schrank oder Biosicherheitswerkbank, wenn der Gesundheitszustand des Tieres dies erfordert.
  3. Restrain die Maus am Schwanz, hob den Hinterbeinen aus dem Käfig. Fassen Sie das Ende des Bandes zwischen Daumen und Zeigefinger, dann die Mitte des Bandes fest mit der Maus Perineum, einschließlich der perianalen Bereich mehrmals. Die Haare sollten zu sehen sein Anhänger der Band für den Test als erfolgreich sein werden.
  4. Platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig.
  5. Geben Sie einen Tropfen Mineralöl auf ein markiertes sauberen Glasobjektträger, gelten die Band auf die Folie, dann eine andere Tropfen Mineralöl. Abdeckung mit einem Deckglas.
  6. Lesen Sie die Objektträger mit den 10x und 40x-Objektive auf einem Lichtmikroskop. Die perianale Tape-Test am besten bei der Erkennung Syphacia Eier, aber auch andere Parasiten Eier manchmal zu finden sind.

2. Kot-Flotation

  1. Montieren Flotation Lösung, ein flaches Gefäß (Pille Fläschchen oder Kot-Flotation Gerät wie Ovatector), Petrischale, Deckglas, Objektträger und Applikator / Rührstäbchen. Floating-Lösung, wie Fecasol, sollte eine spezifische Dichte von 1,20 bis 1,30 und können aus verschiedenen Natrium-Salze, Zucker, Zinksulfat oder im Handel erworben werden. (Tabelle 2)
  2. Sammeln Sie 2-5 fäkalen Pellets aus dem Käfig oder frisch aus dem Tier (en) in die Flotation Kammer. Wenn Kot extrem trocken, entweder aufgrund von Alter oder Art der Herstellung der Fäkalien sind, Befeuchtung der Kot mit 500 ul 0,9% iger Kochsalzlösung kann vorteilhaft sein.
  3. Legen Sie die Flasche in der Petrischale auf die Arbeitsfläche von Überlauf des gelösten Kot zu schützen. Fügen Sie eine kleine Menge Auftrieb mittel-und Maische und gut durchrühren. Keine große Teile des Materials bleiben sollte. Weiter zum Börsengang mittelfristig, bis ein Meniskus bildet sich über dem Rand der Durchstechflasche hinzuzufügen.
  4. Legen Sie das Deckglas auf den Meniskus und Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Parasite Eier und einige Protozoen Oozysten wird nach oben steigen und sich an das Deckglas.
  5. Nach der Inkubation heben und drehen das Deckglas. Legen Sie das Deckglas auf einem Objektträger.
  6. Untersuchen Sie die Folie mit dem 10x und 40x-Objektive unter einem Lichtmikroskop.
  7. Obwohl low-tech und einfach durchzuführen, in der Regel ist diese Technik nicht für Mäuse oder Ratten zu empfehlen. In der Regel ist es besser geeignet für Tiere, die ein größeres Volumen an Kot produzieren.

3. Fecal Konzentration und Zentrifugieren

  1. Montieren Flotation Lösung, Zentrifugenröhrchen, Deckglas, Objektträger und Applikator / Rührstäbchen und Röhrchenabdeckungen. Flotation Lösung sollte ein spezifisches Gewicht von 1,18 bis 1,30 und können aus verschiedenen Natrium-Salze, Zucker, Zinksulfat oder im Handel erworben werden. (Tabelle 2)
  2. Sammeln 2-10 fäkalen Pellets aus dem Käfig oder frisch aus dem Tier (en) in ein Sammelrohr. Wenn Kot extrem trocken, entweder aufgrund von Alter oder Art der Herstellung der Fäkalien sind, Befeuchtung der Kot mit 500 ul 0,9% iger Kochsalzlösung oder mit dem Börsengang Lösung, die Sie verwenden kann vorteilhaft sein.
  3. Mischen Sie die Probe in einem geeigneten Flotation Lösung innerhalb eines Glas-Zentrifugenröhrchen. Mechanische Bewegung mit einem Vortexer verwendet werden, um Proben zu mischen. Wenn ein Vortexer verwendet wird, sollte Schnappdeckel auf den Gipfeln des Rohres platziert werden, um Verschütten und Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Routinemäßig werden Proben in 1.18 spezifisches Gewicht Zinksulfat vorbereitet, aber auch andere Lösungen zusätzlich verwendet werden können (in einer separaten Präparate Rohr) oder in Substitution.
  4. Fügen Sie zusätzliche Flotation Lösung in jedes Röhrchen eine leichte positive Meniskus auf jedes Rohr zu bilden. Tragen Sie einen Kunststoff-Deckglas in jedes Röhrchen, und sicherzustellen, dass vollem Kontakt mit Rohr Lippe gemacht wird. Das Röhrchen (s) in die Zentrifuge.
  5. Zentrifugation bei ca. 616-760 RCF für 10 Minuten. Wenn Deckgläser verloren oder defekt sind während der Zentrifugation, kann ein neues Deckglas auf das Probenröhrchen gegeben werden und das Rohr vorsichtig gekippt werden, so dass der Meniskus der neuen Deckglas berührt. Keine zusätzlichen Zentrifugation notwendig ist.
  6. Entfernen Deckglas aus Zentrifugenröhrchen und Platz auf einer markierten, saubere Objektträger. Wenn mehrere Zentrifugation Lösungen wurden verwendet, um eine Stuhlprobe zu bewerten, können zwei Deckgläser auf derselben Folie platziert werden.
  7. Stain die Folie mit Jod. Dies ermöglicht eAsier Identifizierung von Zysten.
  8. Untersuchen Sie die Folie mit dem 10x und 40x-Objektive auf einem Lichtmikroskop.

4. Direkte Untersuchung der Därme für Helminthen und Protozoen

  1. Legen Sie die eingeschläfert Maus oder Ratte Kadaver in Rückenlage auf einer sauberen Dissektion Bord oder eine ähnliche Arbeit Oberfläche.
  2. Mit einer Pinzette, heben Sie die Bauchdecke in den Genitalbereich. Mit einer Schere vorsichtig incise der ventralen Bauchwand aus dem Genitalbereich auf die Basis des Brustkorbs Entfernen beider Haut und Muskeln und Freilegen der Darm. Entfernen Sie die Eingeweide, beginnend bei den Zwölffingerdarm (der Darmabschnitt Anfang an der Ausfahrt des Magens) und weiterhin die Colon descendens (das Segment des Darms, die am After endet und enthält in der Regel gebildet Kot).
  3. Legen Darm in einem 100 ml Petrischale. Sammeln Sie einen Teil des Blinddarms und Zwölffingerdarm aus dem eingeschläfert Tier-und Platz auf dem Seziertisch Bord. Incise jeder Darm-Segment der Länge nach auf die Schleimhaut freizulegen.
  4. Mit einer Schere, schneiden Sie die verbleibenden Eingeweide in kleine Abschnitte. Fügen Sie genug Wasser, um die Schüssel auf knapp tauchen die gesammelten Gewebe.
  5. Inkubieren Sie die Probe Mischung bei 35-40 ° C in einem Trockenschrank oder Brutschrank für mindestens 10 Minuten. Dies wird zu befreien und setzen luminalen Helminthen. Während der Probe inkubiert, führen Sie die folgenden Schritte aus.
  6. Legen Sie zwei Tropfen 0,9% iger Kochsalzlösung nebeneinander auf einem einzigen markierten Folie, um zur Vorbereitung von Proben aus zwei Darmabschnitten (Duodenum und Caecum) zu ermöglichen.
  7. Hitze sterilisieren und kühl einer Impföse oder gleichwertig.
  8. Kratzen Sie die Schleimhaut des Duodenums und Ort der scrapings auf der linken Seite des Schiebers (Seite, die dem Mattrand).
  9. Kratzen Sie die Schleimhaut des Blinddarms und Ort der Proben aus auf der rechten Seite des Schlittens.
  10. Top der scrapings mit einem Deckglas. Untersuchen vorbereitet Objektträger unter dem 40fach Objektiv unter einem Phasenkontrastmikroskop); die Vergrößerung zu erhöhen als für die Identifikation benötigt. Wenn Parasiten festgestellt werden, basierend auf der Morphologie zu erkennen.
  11. Das Gericht Inhalte bereit sein wird für die Prüfung durch diesen Punkt. Untersuchen Sie die Schüssel Inhalte unter einem Binokular. Verwenden Sie eine Sonde oder Applikator-Stick als notwendig, um Inhalte innerhalb der Schale zu bewegen, um eine gründliche Prüfung abzuschließen. Wenn pinworms anwesend sind, werden sie als kleine, weiße, Haar-ähnliche Würmer erscheinen. Wenn Bandwürmer vorhanden sind, werden sie als segmentiert, flache Würmer (größer als die fadenförmigen pinworms) erscheinen.
  12. Wenn Helminthen nachgewiesen oder vermutet werden, sammeln die Probe mit einer kleinen Zange.
  13. Montieren Sie die Probe auf einen gekennzeichneten, sauberen Glasobjektträger in einen Tropfen Paraffin-oder Mineralöl und setzen Sie ein Deckglas auf der Probe. Untersuchen Sie die Folie mit dem 10x und 40x-Objektive auf einem Lichtmikroskop.

2. Ektoparasit Untersuchung (Tabelle 3)

5. Fur zupfen Prüfung für Ektoparasiten (Tape-Test)

  1. Entfernen einer Länge von klaren, nicht mattiert, Klebeband aus einem Spender. Band sollte lang genug sein zu handhaben mit einem Ende ohne Berührung der Mitte (ca. 5 cm). Es kann einfacher sein, mehrere Längen auf einmal zu verzichten, die Befestigung an den Rand einer sauberen Arbeitsfläche und mit je nach Bedarf.
  2. Heben Sie eine Maus oder Ratte aus dem Käfig und auf den Käfig Deckel, wobei sie an der Rute. Führen Sie diese Aktion in einer laminaren Strömung Schrank oder Biosicherheitswerkbank, wenn der Gesundheitszustand des Tieres dies erfordert.
  3. Restrain der Maus oder Ratte. Fassen Sie das Fell mit Hämostatika und zupfen Sie sanft das Fell auf dem Maus Skapulier Bereich ventralen zervikalen Bereich, Achselbereich, Leistengegend und dorsalen Rumpf. Legen Sie das Fell auf dem Band. Die Haare sollten zu sehen sein Anhänger der Band für den Test als erfolgreich sein werden. Legen Sie die Maus oder Ratte zurück in seinen Käfig.
  4. Geben Sie einen Tropfen Mineralöl auf ein markiertes sauberen Glasobjektträger, gelten die Band, dann noch einen Tropfen Mineralöl. Abdeckung mit einem Deckglas.
  5. Lesen Sie die Objektträger mit den 10x und 40x-Objektive unter einem Lichtmikroskop.
  6. Diese Prüfung ist am besten zum Nachweis von Pelz Milben wie Radfordia, Myobia und Myocoptes.

6. Haut abkratzen

  1. Montieren Sie die folgenden Materialien: Tier getestet werden, Mineralöl, Objektträger, Deckglas, Skalpell und Schere. Ist dieser Test auf lebende Tiere durchgeführt werden, sollten sie vor Beginn der Narkose.
  2. Probieren Sie die Handrücken in der Nähe der Basis des Schwanzes und der zeitlichen Bereich des Kopfes. Alternativ können Hautveränderungen und / oder anderen Websites abgekratzt werden.
  3. Tief kratzen die Haut mit dem Skalpell in die entgegengesetzte Richtung des Haarwuchses, um die Epidermis zu erodieren. Das Trimmen des Haarkleides vor Schaben können Screening-Empfindlichkeit durch die Reduzierung Sichtbehinderung (vermehrte Behaarung) an der Verbesserunggleiten.
  4. Geben Sie einen Tropfen Öl auf die Folie. Übernehmen Sie die Probe auf die Öltropfen durch Abwischen der Klinge (mit Probe angebracht) auf der Oberfläche der Folie. Fügen Sie zusätzliche Öl auf die Folie, wenn nötig, und oben mit einem Deckglas.
  5. Lesen Sie die Objektträger mit den 10x und 40x-Objektive unter einem Lichtmikroskop.
  6. Die Haut kratzen ist in der Regel verwendet, um Demodex (und Dermatophyten Pilze) zu erkennen.

7. Direkte Untersuchung der pelage

  1. Legen Sie die eingeschläfert Maus oder Ratte auf der Bühne einem Binokular.
  2. Untersuchen Sie die Haare auf dem Fell auf ca. 10x mit einem Applikator-Stick oder ähnliches Instrument, an den Haaren und beobachten die Basis des Haares.
  3. Untersuchen Sie den Oberkopf, zwischen den Augen und der Ohrmuschel, zwischen den Ohrmuscheln, zwischen den Schulterblättern, unterhalb des Kiefers und der Leistengegend und axillären Bereichen. Alternativ kann der gesamte Korpus untersucht werden.
  4. Sammeln Sie alle Ektoparasiten oder verdächtiges Material zu sehen mit einer kleinen Zange. Ektoparasiten oft wie Schuppen oder einem gelben wachsartigen Ablagerungen auf der Basis eines Haares oder direkt auf der Haut zu achten.
  5. Montieren Sie die Probe auf einen sauberen Glasobjektträger in einen Tropfen Paraffin-oder Mineralöl und setzen Sie ein Deckglas auf der Probe. Untersuchen Sie die Folie mit dem 10x und 40x-Objektive unter einem Lichtmikroskop.

3. Repräsentative Ergebnisse:

Siehe beigefügte Dateien identifizieren folgende Parasiten: (Hinweis: diese Verfahren werden alle Ei, Würmern oder Zyste im Kot oder auf der Haut und Fell zu erkennen, nur ein paar von ihnen sind unten aufgeführt)

Endoparasiten:

Syphacia muris (Ei, Wurm) Chilomastix bettencourti
Syphacia obvelata (Ei, Wurm) Hexamastix muris
Aspiculuris tetraptera (Ei, Wurm) Retortamonas sp.
Rodentolepis nana (Ei, Wurm) Giardia spp.
Tritrichomonas muris Spironucleus muris
Entamoeba muris

Ektoparasiten:

Myocoptes musculinis Radfordia affinis
Myocoptes musculinis Radforida Ensifera
Myobia musculi
  Tape-Test Kot-Flotation FCC Direkte Prüfung 1 PCR
Protozoen - + + + + + + + + + / NA 2
Metazoa
Pinworm + / - 3 + / - 4 + 4 + + + + + +
Tapeworm 5 - + + + + + + NA
Andere Rundwürmer 5 - + + + + + + + NA

1. Diese Methode erfordert Euthanasie des Tieres.
2. Es gibt keine PCR-Nachweis derzeit verfügbaren Methoden für jeden Protozoen.
3. Diese Methode ist am besten geeignet, um Syphacia spp erkennen.
4. Diese Methode wird eher Aspiculuris erkennen, und weniger wahrscheinlich zu Syphacia erkennen.
5. Bandwürmer und Spulwürmer andere als pinworms sind sehr selten in modernen Labor-Mäuse und Ratten.

Tabelle 1. Class of Endoparasit und geeignete Nachweismethode. Einige Methoden erfordern Euthanasie des Tieres. NA zeigt Methode ist derzeit nicht verfügbar für diese Parasiten + zeigt Eignung der Methode für den Nachweis des Parasiten in Frage, und -. Zeigt an, dass die Methode nicht für die Parasiten empfohlen.

Lösung Spezifisches Gewicht Zutaten pro 1L H 2 O
Kochsalz 1,20 311 g Natriumchlorid
Natriumnitrat 1,20 338 g Natriumnitrat
Natriumnitrat 1,30 616 g Natriumnitrat
Zucker 1,20 1170 g Saccharose 1
Sheather Zucker- 1,27-1,30 1563 g Saccharose 1
Zinksulfat 1,18 493 g Zinksulfat

1. Diese Lösungen erfordern Kühlung oder die Zugabe von 9 ml Phenol als Konservierungsmittel.

Tabelle 2. Fecal Flotation Lösungen (von Smith et al.)

Fur zupfen (Tape-Test) Haut abkratzen 1 Direkte Prüfung 1 PCR
Läuse - - + + NA
Milben + + + + + + + + / NA 3
Flöhe 4 - - + NA
Ticks 4 - - + + NA

1. Diese Methode erfordert Anästhesie, wenn sie auf ein lebendes Tier durchgeführt werden soll.
2. Diese Methode erfordert Euthanasie des Tieres.
3. Es gibt keine PCR-Nachweis derzeit verfügbaren Methoden für jede Art von Milben.
4. Flöhe und Zecken sind äußerst selten in modernen Labors Tierhaltung.

Tabelle 3. Class of Ektoparasit und geeignete Nachweismethode. Einige Methoden erfordern Euthanasie der Tiere und andere Methoden erfordert Anästhesie, um sie in lebenden Tieren durchzuführen. NA zeigt Methode ist derzeit nicht verfügbar für diese Parasiten. NA zeigt Methode ist derzeit nicht verfügbar für diese Parasiten + zeigt Eignung der Methode für den Nachweis des Parasiten in Frage, und -. Zeigt an, dass die Methode nicht für die Parasiten empfohlen.

Discussion

Bei der Arbeit in einem Labor, sollte Sicherheit immer ein Anliegen sein. Denken Sie daran, angemessene Schutzkleidung zu tragen, wenn die Arbeit mit Tieren und Ihren Arbeitsplatz mit Desinfektionsmittel sauber vor und nach. Diese Methoden sind in erster Linie entwickelt, um Parasiten von Labornagern in den Orten finden geprüft, dh, sie können erkennen, exotische oder sehr selten Parasiten sowie die häufiger pinworms und Fell Milben. Obwohl sie gleichermaßen für andere Arten sind, können wilden Nagetieren zusätzliche Parasiten in Orten wie Leber, Unterhaut und Gehirn haben, nicht durch die oben genannten Methoden ausgewertet.

Disclosures

Die Autoren sind alle Mitarbeiter von Charles River, einem Anbieter von diagnostischen Tests und Reagenzien, einschließlich der oben beschriebenen Prüfungen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cutting board Thermo Fisher Scientific, Inc. Cat #36114
Small scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5910, G204 23mm blades, 3.5” length, straight
Medium scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6808, G207 5”
Forceps-Curved Roboz Surgical Instruments Co. RS-8254 (M1/21004) 4.5”, serrated, slight curve
Forceps-Microdissecting Roboz Surgical Instruments Co. RS-5238 Hudson-(EWALD)
Forceps-Tissue Forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-8160 Rat tooth
Metal probe VWR international Cat#25778-000
Hemostats Vantage V97-48
Applicator sticks Puritan 6in Applicators, Ref#807
Dissecting microscope Olympus Corporation SZ51, Schott, ACE1
Petri dish VWR international 100mm, Cat#3401PDNL
Cover slips VWR international Micro cover glass, Cat#48366-067
Slides VWR international VistaVision microscope slides Cat#16004-368
Inoculating loop VWR international Cat#50815-040
Light microscope Olympus Corporation Model#BX41TF
Laboratory oven Quincy Lab Inc. Model 10 Lab Oven
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X-12R
Vortexer VWR international Mini-Vortexer
Test tube Kimble Chase 15 ml disposable centrifuge tube, Cat#73790-15
Cover slips VWR international Plastic microscope cover slips, 22mm, Cat#48376-049
White caps VWR international Cat#60869-089
Iodine Rowley biochemical institute Cat#SO-364
Zinc sulfate Sigma-Aldrich Cat#1000917519, Z4750-500G
Sucrose Mallinckrodt Baker Inc. Cat#8360-06
Phenol EMD Millipore Cat#PX0510-1
Cellophane tape Staples Invisible tape, Cat#504712
Mineral oil Mallinckrodt Baker Inc. Cat#6358

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, D. G. Chapter 23. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).
  2. Baker, D. G. Chapter 11. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. Blackwell. 303-398 (2007).
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  4. Pritchett, K. R. Chapter 22. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).
  5. Smith, P. H., Wiles, S. E., Malone, J. B., Monahan, C. M. Chapter 1. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. Blackwell. 1-13 (2007).
  6. Wasson, K. Chapter 21. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Vol. 2, Academic Press. 517-550 (2007).
Diagnose von Ekto-und Endoparasiten in Laborratten und Labormäusen
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Cite this Article

Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice. J. Vis. Exp. (55), e2767, doi:10.3791/2767 (2011).More

Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice. J. Vis. Exp. (55), e2767, doi:10.3791/2767 (2011).

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