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Immunology and Infection

연구실 고양이와 마우스에 외부의 뜻과 Endoparasites의 진단

doi: 10.3791/2767 Published: September 6, 2011

Summary

이 문서는 엔도 또는 ectoparasitism을 감지 선별 쥐 및 생쥐를위한 각종 절차에 대해 설명합니다. 여러 진단 assays이 시연되고, 살아있는 동물에서 사용하기에 적합 사람과 동물의 안락사 후 사용되는 모두. 쥐, 마우스 기생충의 식별에 도움을 사진이 포함됩니다.

Abstract

내부 및 외부 기생충 실험실 설치류 시설에 큰 관심 유지, 많은 연구 시설 일부 parasitized 동물을 품다. 기생충에 대한 동물 시험에 착수하기 전에, 두 가지가 고려되어야합니다. 하나 : 무엇을 사용이 수집한 정보의 만들어진 두 개의 것이다 : 어느 시험이 가장 적합합니다. 동물 parasitized 것을 아는 것은 시설 받아 무언가 수 있지만 동물 치료 후 치료의 효능을 결정하기 위해 필요가 종종 있습니다 있습니다. 기생충이 사는 euthanized 동물에서 가져온 샘플 등 다양한 기법을 통해 동물에서 검색된 수 있습니다. PCR은 기생충의 여러 유형에 대해 높은 감도 테스트를 사용할 수 있지만 역사적으로 가장 진단 감도 시험은 동물의 안락사를 필요합니다. 이 문서의 감지 엔도와 마우스 및 쥐의 ectoparasites 절차를 보여줍니다. 발견된 기생충의 종류가 다를 수 있지만 동일한 절차는 다른 설치류에 적용됩니다.

Protocol

1. Endoparasite 시험 (표 1)

1. 음부 테이프 테스트 (또한 섹션 5를 참조하십시오, 이들은 보통 동시에 수행됩니다)

  1. 디스펜서에서 맑은 길이 아니 프로스트, 셀로판 테이프를 제거합니다. 테이프의 중간 (약 5cm)을 만지하지 않고 한쪽으로 충분히 처리할 수 있어야합니다. 그것은 깨끗한 작업 표면의 가장자리에 부착하고 필요에 따라 사용하여 한 번에 여러 개의 길이를 분배하는 것이 더 쉽습 수 있습니다.
  2. 꼬리하여 잡고 케이지 뚜껑에 미치는 케이지 장소에서 마우스를 들어 봐요. 층류 흐름 캐비닛이나 동물의 건강 상태가 그것을 요​​구하는 경우 biosafety 캐비닛에서이 작업을 수행합니다.
  3. 케이지에서 뒷다리 리프팅, 꼬리로 마우스를 구속. 엄지와 집게손가락 사이에 테이프의 끝 부분을 파악 후 음부 지역 여러 번 포함 단단히 마우스의 회음부에 테이프의 가운데를 적용합니다. 머리를 성공적으로 고려하는 분석을위한 테이프에 자기편으로 볼 수 있습니다.
  4. 새장에 마우스를 다시 넣으십시오.
  5. 표시 깨끗한 유리 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울을 플레이스, 미네랄 오일의 다른 드롭 다음, 슬라이드에 테이프를 적용해야합니다. 유리 커버 전표로 커버.
  6. 가벼운 현미경에 10X와 40x 목표를 사용하여 현미경 슬라이드를 참조하십시오. 다른 기생충 알이 발견 가끔 있지만 음부 테이프 시험은, Syphacia의 계란을 검출에 가장 적합합니다.

2. 방패 선법

  1. 부양 솔루션 평면 바닥 유리병 (예 : Ovatector 같은 알약의 약병이나 배설물 부양 장치), 페트리 접시, 커버 슬립, 현미경 슬라이드 및 작은 주걱 / 감동 빨대를 조립. 같은 Fecasol 같은 부양 솔루션, 1.20-1.30의 비중이 있어야하고 다양한 나트륨 소금, 설탕, 황산 아연, 또는 상업적으로 구입에서 만들 수 있습니다. (표 2)
  2. 부양 챔버에 2-5 배설물은 새장에서 알약이나 동물 (S)에서 신선한를 수집합니다. 배설물은 0.9 %의 식염수 500 μl로 대변을 moistening 매우 건조 중 연령이나 대변을 생산 수종에 의한 경우에는 도움이 될 수 있습니다.
  3. 녹아 대소변의 오버플로에서 작업 표면을 보호하기 위해 배양 접시에있는 병을를 놓습니다. 부양 매체와 매시의 작은 볼륨을 추가하고 철저 저어. 자료 없음 대형 조각 남아해서는 안됩니다. 유리병의 가장자리 위에 초승달 모양의 형태까지 부양 미디어를 추가로 진행합니다.
  4. 초승달 모양에 커버 슬립을 놓고 15 분 동안 상온에서 알을 품다. 기생충 알 및 일부 protozoan의 oocysts은 정상에 오르는 및 커버 슬립을 준수합니다.
  5. 부화 후, 리프트와 커버 슬립을 반전. 유리 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 놓습니다.
  6. 가벼운 현미경 10X와 40x 목표를 사용하여 슬라이드를 검사합니다.
  7. 낮은 기술하고 쉬운가 일반적으로 수행하지만,이 기술은 마우스 또는 쥐 권장하지 않습니다. 원칙적으로, 그것은 대소변의 큰 볼륨을 생산 동물에 대한 더 적합합니다.

3. 방패 농도 및 원심 분리

  1. 부양 솔루션, 원심 분리기 튜브, 커버 슬립, 현미경 슬라이드 및 작은 주걱 / 교반 막대기 및 관 뚜껑을 조립. 부양 솔루션은 1.18-1.30의 비중이 있어야하고 다양한 나트륨 소금, 설탕, 황산 아연, 또는 상업적으로 구입에서 만들 수 있습니다. (표 2)
  2. 컬렉션 튜브에 20-10 배설물은 새장에서 알약이나 동물 (S)에서 신선한를 수집합니다. 배설물은 식염 0.9 % 500 μl 또는 부양 솔루션의 대소변을 moistening 매우 건조 중 연령이나 대변을 생산 수종에 의한 경우 사용하는가 도움이 될 수 있습니다.
  3. 유리 원심 분리기 튜브 내에 적절한 부양 용액에 샘플을 섞는다. vortexer와 기계 교반은 샘플을 혼합하는 데 사용할 수 있습니다. vortexer를 사용하는 경우, 스냅 모자는 spillage 및 교차 오염을 방지하기 위해 튜브의 꼭대기에 위치해야합니다. 일상적으로, 샘플은 그러나 다른 솔루션 이외에 사용 (별도 준비 튜브) 또는 대체에있을 수 있습니다, 비중 1.18의 황산 아연에 준비가되어 있습니다.
  4. 각각의 튜브에 약간의 긍정적인 초승달 모양을 형성하기 위해 각 튜브에 추가 부양 솔루션을 추가합니다. 각각의 튜브에 플라스틱 커버 슬립을 적용하고, 튜브 입술 전체에 연락이 만들어 있는지 확인합니다. 장소 튜브 (S) 원심 분리기로.
  5. 10 분 약 616-760 RCF에서 원심 분리기. 커버 전표를 분실하거나 원심 분리 과정에서 깨진 경우, 새로운 커버 슬립이 샘플 튜브에 배치 수 있으며 튜브가 부드럽게 초승달 모양이 새로운 커버 슬립을 건드리면 너무 밀고 수 있습니다. 추가 원심 분리가 필요하지 않습니다.
  6. 라벨 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 원심 분리기 튜브의 슬립과 장소를 커버 제거합니다. 여러 개의 원심 분리 솔루션 하나의 배설물 샘플을 평가하는 데 사용했다면, 두 커버 전표가 같은 슬라이드에 추가할 수 있습니다.
  7. 요오드와 슬라이드를 얼룩. 이것은 E에 대한 수cysts의 asier 식별.
  8. 가벼운 현미경에 10X와 40x 목표를 사용하여 슬라이드를 검사합니다.

4. 직접 helminths에 대한 창자의 시험 및 원생 동물문

  1. 깨끗한 절개 보드 또는 이와 유사한 작업 표면에 지느러미 드러누움에 euthanized 마우스 또는 쥐 시체를 놓습니다.
  2. 포셉 사용하여 성기 영역에서 복부 벽에 리프트. 가위를 사용하여 조심스럽게 성기 지역에서 피부와 근육을 모두 제거하고 장의 위치를​​ 노출 ribcage의 기본으로 복부 복벽을 절개. 십이지장에서 시작 (복부의 출구에 대장의 시작의 세그먼트)과 내림차순 콜론 (항문에서 끝나는 주로 형성 대변이 들어있는 소장의 세그먼트)에 계속, 장내를 제거합니다.
  3. 100 ML 배양 접시에있는 장소 내장. 해부 보드에 euthanized 동물과 장소에서이게 맹장과 십이지장의 일부를 수집합니다. 점막을 폭로 세로 각 장의 세그먼트를 절개.
  4. 가위를 사용하여 작은 부분으로 남아있는 장내를 잘라. 간신히 잠수함 수집한 조직을 위해 요리에 충분한 수돗물을 추가합니다.
  5. 35-40 ° C에서 10 분 최소 실험실 오븐이나 인큐베이터에서 샘플 혼합물을 품어. 이것은 해방과 luminal helminths를 노출합니다. 샘플 잠복기지만, 다음 단계를 수행합니다.
  6. 두 개 창자 세그먼트 (십이지장과 맹장)에서 시료의 준비 있도록 단일 레이블 슬라이드에서 나란히 0.9 % 생리 측면의 두 방울.
  7. 소독 열과 inoculating 루프 또는 이와 동등한 진정해.
  8. 십이지장의 점막을 다쳤고, 그리고 슬라이드 (프로스트의 가장자리에 가장 가까운 쪽)의 왼쪽에있는 부스러기를 놓습니다.
  9. 이게 맹장의 점막을 긁어와 슬라이드의 오른쪽부터 부스러기를 놓습니다.
  10. 커버 전표와 부스러기를 위로. 위상 대비 현미경 40x 목표를 사용하여 준비 슬라이드를) 검사, 식별을위한 필요에 따라 증가 확대. 기생충이 발견하는 경우, 형태학을 기반으로 식별합니다.
  11. 요리 내용이 시점에서 시험을 준비합니다. 해부 현미경 접시 내용을 검사합니다. 철저한 검사를 완료 접시 안에 내용을 이동하는 필요에 따라 프로브 또는 작은 주걱 스틱을 사용합니다. pinworms가 존재하는 경우 그들은 작은, 백색, 머리와 같은 벌레로 나타납니다. 촌충이있는 경우, 그들은 세그먼트, 평면 웜 (스레드와 같은 pinworms보다 큰)로 표시됩니다.
  12. helminths이 감지하거나 의심하는 경우, 포셉의 작은 쌍을 사용하여 표본을 수집합니다.
  13. 파라핀이나 미네랄 오일 한 방울의 표시, 깨끗한 유리 슬라이드 표본을 탑재하고 시편 위에 커버 전표를 놓습니다. 가벼운 현미경에 10X와 40x 목표를 사용하여 슬라이드를 검사합니다.

2. Ectoparasite 시험 (표 3)

5. 모피는 ectoparasites 시험 (테이프 테스트)를 뽑다

  1. 디스펜서에서 맑은 길이 아니 프로스트, 셀로판 테이프를 제거합니다. 테이프의 중간 (약 5cm)을 만지하지 않고 한쪽으로 충분히 처리할 수 있어야합니다. 그것은 깨끗한 작업 표면의 가장자리에 부착하고 필요에 따라 사용하여 한 번에 여러 개의 길이를 분배하는 것이 더 쉽습 수 있습니다.
  2. 꼬리하여 잡고 케이지 뚜껑에 미치는 케이지 장소에서 마우 스나 쥐가 들어 봐요. 층류 흐름 캐비닛이나 동물의 건강 상태가 그것을 요​​구하는 경우 biosafety 캐비닛에서이 작업을 수행합니다.
  3. 마우스 또는 쥐을 억제. hemostats와 모피를 파악하고 부드럽게 마우스의 견갑골 구역, 복부 자궁 지역, 겨드랑 지역, 사타구니 주변, 그리고 지느러미 엉덩이에서 모피를​​ 뽑다. 테이프에 모피를 놓습니다. 머리를 성공적으로 고려하는 분석을위한 테이프에 자기편으로 볼 수 있습니다. 그 새장에 마우스 또는 쥐를 다시 넣으십시오.
  4. 표시 깨끗한 유리 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울을 플레이스, 미네랄 오일의 다른 드롭 후, 테이프를 적용합니다. 유리 커버 전표로 커버.
  5. 가벼운 현미경 10X와 40x 목표를 사용하여 현미경 슬라이드를 참조하십시오.
  6. 이 시험은 Radfordia, MyobiaMyocoptes 같은 모피 진드기 검출에 가장 적합합니다.

6. 스킨 다쳤어요

  1. 다음 자료 소집해 : 동물 테스트로, 미네랄 오일, 현미경 슬라이드, 커버 슬립, 메스와 가위. 이 테스트는 살아있는 동물에서 수행되어야하는 경우, 그들은 시작하기 전에 anesthetized해야합니다.
  2. 꼬리와 머리의 관자놀이의 기본 근처 dorsum를 드셔보세요. 또한, 피부 병변 및 / 또는 기타 사이트 까진 수 있습니다.
  3. 깊이 표피를 침식하는, 헤어 성장의 반대 방향으로 메스 칼날로 피부를 다쳤어요. 근근이 살아가고하기 전에 헤어 코트를 트리밍하면에 시각적 방해 (초과 머리)를 줄임으로써 심사의 감도를 향상시킬 수 있습니다슬라이드.
  4. 슬라이드에 기름 한 방울을 넣으십시오. 슬라이드의 표면에 날개를 (샘플 첨부)를 닦는하여 오일 드롭 샘플을 적용합니다. 필요한 경우 슬라이드와 커버 슬립과 함께 가기에 추가 기름을 추가합니다.
  5. 가벼운 현미경 10X와 40x 목표를 사용하여 현미경 슬라이드를 참조하십시오.
  6. 피부 다쳤어요는 일반적으로 Demodex (및 dermatophytic 곰팡이) 감지하는 데 사용됩니다.

7. 털가죽의 직접 검사

  1. 해부 현미경의 무대에 euthanized 마우스 또는 쥐를 놓습니다.
  2. 일부 머리를 작은 주걱 스틱 또는 유사한 악기를 사용하여 약 10X에 펠트의 머리카락을 검사하고 머리 축의 기반을 관찰합니다.
  3. 눈과 pinnae, pinnae 사이 scapulae 사이의 턱 아래, 그리고 사타구니와 겨드랑 지역 사이의 두개골 영역을 검사합니다. 또는, 전체 시체는 검사 수 있습니다.
  4. 모든 ectoparasites 또는 포셉의 작은 쌍을 사용하여 본 의심스러운 자료를 수집합니다. Ectoparasites은 종종 비듬이나 머리카락 샤프트의 기본 또는 직접 피부에 노란 밀랍 상승 것처럼 보일 수 있습니다.
  5. 파라핀이나 미네랄 오일 드롭 깨끗한 유리 슬라이드 표본을 탑재하고 시편 위에 커버 전표를 놓습니다. 가벼운 현미경 10X와 40x 목표를 사용하여 슬라이드를 검사합니다.

3. 대표 결과 :

다음과 같은 기생충을 식별 첨부 파일을 참조하십시오 (참고 : 다음 절차는 대변이나 피부와 모피에있는 모든 계란, 기생충, 또는 낭종 선물을 감지, 이들 중 몇은 다음과 같습니다)

Endoparasites :

Syphacia muris (계란, 웜) Chilomastix bettencourti
Syphacia obvelata (계란, 웜) Hexamastix muris
Aspiculuris tetraptera (계란, 웜) Retortamonas SP.
Rodentolepis 나나 (계란, 웜) Giardia 종.
Tritrichomonas muris Spironucleus muris
Entamoeba muris

Ectoparasites :

Myocoptes musculinis Radfordia affinis
Myocoptes musculinis Radforida ensifera
Myobia musculi
  테이프 테스트 방패 선법 FCC 직접 시험 1 PCR
원생 동물문 - + + + + + + + + + / NA 2
Metazoa
Pinworm + / - 3 + / - 4 + 4 + + + + + +
촌충 5 - + + + + + + NA
기타 roundworms 5 - + + + + + + + NA

1.이 방법은 동물의 안락사가 필요합니다.
2. 모든 protozoan 현재 사용할 수 PCR 검출 방법이 없습니다.
3.이 방법은 Syphacia 종을 감지에 가장 적합합니다.
4.이 방법은 Aspiculuris을 감지 가능성이 더 높습 수 있으며, Syphacia를 탐지 가능성이 적습니다.
5. 촌충과 pinworms 이외 roundworms 현대 실험실 마우스 및 쥐에서 매우 드문 있습니다.

endoparasite 적절한 검색 방법 표 1. 클래스. 어떤 방법은 동물의 안락사가 필요합니다. NA는 방법이 현재이 기생충에 사용할 수 없습니다 표시 + 문제의 기생충 검출하는 방법의 적합성을 나타냅니다하고, -. 메서드가 해당 기생충 권장되지 않았음을 나타냅니다.

용액 비중 1L H 2 O 당 성분
나트륨 염화물 1.20 311g의 나트륨 염화물
나트륨 질산 1.20 338g 나트륨 질산
나트륨 질산 1.30 616g 나트륨 질산
설탕 1.20 1,170그램의 자당 1
쉐더의 설탕 1.27-1.30 1천5백63그램의 자당 1
황산 아연 1.18 493g의 황산 아연

1. 이러한 솔루션은 냉장이나 방부제로 페놀 9 ML의 추가를 필요로합니다.

표 2. 방패 부양 솔루션 (스미스 외에서.)

털이 뽑다 (테이프 테스트) 스킨 다쳤어요 1 직접 시험 1 PCR
이가 - - + + NA
진드기 + + + + + + + + / NA 3
벼룩 - - + NA
진드기 4 - - + + NA

그것이 살아있는 동물에서 수행하는 경우 1.이 방법은 마취가 필요합니다.
2.이 방법은 동물의 안락사가 필요합니다.
3. 진드기의 모든 종족에 대한 현재 PCR 검출 방법이 없습니다.
4. 벼룩과 진드기 현대 실험 동물 시설 극히 드문 있습니다.

ectoparasite 적절한 검색 방법 표 3. 클래스. 어떤 방법은 동물의 안락사가 필요하며, 다른 방법은 마취가 살아있는 동물에서 그들을 수행할 수 있어야합니다. NA는 방법이 현재이 기생충에 사용할 수 없습니다 나타냅니다. NA는 방법이 현재이 기생충에 사용할 수 없습니다 표시 + 문제의 기생충 검출하는 방법의 적합성을 나타냅니다하고, -. 메서드가 해당 기생충 권장되지 않았음을 나타냅니다.

Discussion

연구실에 근무하는 경우, 안전은 항상 염려해야합니다. 동물과 작업할 때 적합한 보호 장비를 착용하고 전후에 살균제와 워크 스테이션을 청소하는 것을 잊지 말아주세요. 이 방법은 주로 위치에 실험실 설치류 동물의 기생충을 찾을 수 있도록 설계하는 것은, 검사 즉, 그들은 매우 드문 기생충뿐만 아니라보다 일반적인 pinworms 및 모피 진드기를 검색하거나 이국 수 있습니다. 그들이 다른 수종에 동일하게 적용되지만, 야생 설치류는 상기 방법에 의해 평가되지, 그러한 간, subcutis 및 뇌 같은 위치에 추가 기생충이있을 수 있습니다.

Disclosures

저자는 찰스 리버, 위에서 설명한 검사를 포함한 진단 테스트와 시약의 공급 업체의 모든 직원들이 있습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cutting board Thermo Fisher Scientific, Inc. Cat #36114
Small scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5910, G204 23mm blades, 3.5” length, straight
Medium scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6808, G207 5”
Forceps-Curved Roboz Surgical Instruments Co. RS-8254 (M1/21004) 4.5”, serrated, slight curve
Forceps-Microdissecting Roboz Surgical Instruments Co. RS-5238 Hudson-(EWALD)
Forceps-Tissue Forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-8160 Rat tooth
Metal probe VWR international Cat#25778-000
Hemostats Vantage V97-48
Applicator sticks Puritan 6in Applicators, Ref#807
Dissecting microscope Olympus Corporation SZ51, Schott, ACE1
Petri dish VWR international 100mm, Cat#3401PDNL
Cover slips VWR international Micro cover glass, Cat#48366-067
Slides VWR international VistaVision microscope slides Cat#16004-368
Inoculating loop VWR international Cat#50815-040
Light microscope Olympus Corporation Model#BX41TF
Laboratory oven Quincy Lab Inc. Model 10 Lab Oven
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X-12R
Vortexer VWR international Mini-Vortexer
Test tube Kimble Chase 15 ml disposable centrifuge tube, Cat#73790-15
Cover slips VWR international Plastic microscope cover slips, 22mm, Cat#48376-049
White caps VWR international Cat#60869-089
Iodine Rowley biochemical institute Cat#SO-364
Zinc sulfate Sigma-Aldrich Cat#1000917519, Z4750-500G
Sucrose Mallinckrodt Baker Inc. Cat#8360-06
Phenol EMD Millipore Cat#PX0510-1
Cellophane tape Staples Invisible tape, Cat#504712
Mineral oil Mallinckrodt Baker Inc. Cat#6358

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, D. G. Chapter 23. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).
  2. Baker, D. G. Chapter 11. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. Blackwell. 303-398 (2007).
  3. Owen, D. G. Parasites of Laboratory Animals. 12, Royal Society of Medicine. (1992).
  4. Pritchett, K. R. Chapter 22. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).
  5. Smith, P. H., Wiles, S. E., Malone, J. B., Monahan, C. M. Chapter 1. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. Blackwell. 1-13 (2007).
  6. Wasson, K. Chapter 21. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Vol. 2, Academic Press. 517-550 (2007).
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Cite this Article

Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice. J. Vis. Exp. (55), e2767, doi:10.3791/2767 (2011).More

Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice. J. Vis. Exp. (55), e2767, doi:10.3791/2767 (2011).

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