シトクロムの細胞質マイクロインジェクションによるアポトーシスの活性化 C</em
Summary
このプロトコルでは、我々は、シトクロムの直接細胞質マイクロインジェクションを説明します<em> C</em線維芽細胞と一次交感神経ニューロンへ>タンパク質。このテクニックは、シトクロムの導入が可能<em> C</em細胞とミミックシトクロムの放出の細胞質へ>タンパク質<em> C</em>ミトコンドリアから、これは、アポトーシス中に発生します。
Abstract
アポトーシス、またはプログラムされた細胞死は、細胞が1を死滅することによって保存し、高度に制御された経路である。細胞は細胞傷害性ストレスの広い範囲に到達したときにアポトーシスを引き起こすことができます。これらの侮辱は、最終的にミトコンドリアの膜間腔から細胞質2〜 シトクロム cの放出を引き起こすシグナル伝達カスケードを開始する。ミトコンドリアからのシトクロム cの放出は、カスパーゼ、最終的に3〜4細胞死を実行する主要な細胞内プロテアーゼの急速な活性化をトリガーするキーイベントです。
アポトーシスの経路はミトコンドリア5からのシトクロム c の放出の上流と下流のポイントで規制されている。カスパーゼ活性化の後のミトコンドリア調節を研究するためには、多くの研究者は細胞6月9日にholocytochrome C（ヘムに接続された）タンパク質の細胞質マイクロインジェクションを指示することになっている。 シトクロム c は、通常、ヘムグループの添付ファイルはそれが10月11日アポトーシス活性化できるようにするために必要であるミトコンドリアに局在している。したがって、直接カスパーゼを活性化するために、それはcDNA構築物からシトクロム cの発現がミトコンドリアターゲティングとヘムの添付ファイルにつながる一方、それは細胞質カスパーゼから隔離されるため、holocytochrome Cタンパク質の代わりに、そのcDNAを注入する必要があります。このように、精製したヘムに接続されたシトクロム c 蛋白質の直接細胞質マイクロインジェクションは、細胞とミトコンドリアの損傷を引き起こす有毒な侮辱を使用せずに、ミトコンドリアのシトクロム c の放出とアポトーシスを模倣するために有用なツールです。
この記事では、我々はマウス胚性繊維芽細胞（MEF）と例のような主要な交感神経ニューロンを用いて、細胞内へのシトクロム c 蛋白質のマイクロインジェクションのための方法を説明します。このプロトコルは、アポトーシスの調査のためのシトクロム cの注入に焦点を当てているが、ここに示されている技術も容易に関心のある他のタンパク質のマイクロインジェクションのために適応させることができる。
Protocol
Discussion
直接細胞の細胞質へのシトクロム cのマイクロインジェクションは、アポトーシスの後のミトコンドリア調節の研究を可能にするユニークで強力なツールです。重要なのは、この手法は、細胞やミトコンドリアの損傷を引き起こす薬剤を使用せずに、ミトコンドリアのアポトーシスの下流の直接活性化することができます。
このプロトコルは、アポトーシスの研究…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、MDにNIHの助成金NS042197によってサポートされていました。 AJKは、助成金T32GM008719とF30NS068006によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
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