Summary
Neste protocolo, descrevemos a microinjeção direta citoplasmática de citocromo
Abstract
Apoptose, ou morte celular programada, é uma via conservada e altamente regulado pelo qual as células morrem 1. Apoptose pode ser desencadeada quando as células encontrar uma ampla gama de tensões citotóxicos. Estes insultos iniciar cascatas de sinalização que acaba por causar a liberação de citocromo c do espaço intermembranar mitocondrial para o citoplasma 2. A liberação de citocromo c da mitocôndria é um evento-chave que desencadeia a rápida ativação das caspases, as proteases celular chave que acaba por executar a morte celular 3-4.
A via de apoptose é regulada em pontos a montante ea jusante da liberação do citocromo c da mitocôndria 5. A fim de estudar a regulação pós-mitocondrial de ativação da caspase, muitos pesquisadores se voltaram para a microinjeção citoplasmática direta de holocytochrome c (heme-anexo) de proteína em células 6-9. Citocromo c é normalmente localizada na mitocôndria onde o apego de um grupo heme é necessária para habilitá-lo para ativar a apoptose 10-11. Portanto, para ativar diretamente caspases, é necessário para injetar a proteína c holocytochrome em vez do seu cDNA, porque enquanto a expressão de citocromo c de construções de cDNA resultará em alvo mitocondrial e apego heme, será seqüestrado de caspases citosólica. Assim, a microinjeção direta citosólica purificada heme ligado à proteína do citocromo c é uma ferramenta útil para imitar mitocondrial citocromo c release e apoptose sem o uso de insultos tóxicos que causam dano celular e mitocondrial.
Neste artigo, descrevemos um método para a microinjeção de citocromo c de proteínas em células, usando fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) e primário neurônios simpáticos como exemplos. Embora este protocolo incide sobre a injeção de citocromo c para as investigações da apoptose, as técnicas mostradas aqui também pode ser facilmente adaptado para microinjeção de outras proteínas de interesse.
Protocol
1. Produção de agulhas microinjeção
- Agulhas pré-fabricados microinjeção estão disponíveis comercialmente (eg. Femtotips de Eppendorf) e são úteis se não se está realizando um grande número de microinjeções. No entanto, para aqueles que desejam estabelecer a longo prazo as capacidades para microinjecting, uma alternativa é produzir agulhas microinjeção no laboratório usando de parede fina de vidro de borosilicato capilares e um extrator de agulhas comerciais. Isso também permite que a forma de agulhas para ser variado, que pode ser útil para diferentes tipos de células.
- Com o Extrator Needle Narishige PC-10 microinjeção, anexar todos os quatro pesos e use um programa de uma etapa puxar (configuração Etapa 1) com a definição de calor em relação a 58,0 (aquecedor No.2). Certifique-se de colocar o elemento de aquecimento no centro de cada capilar para que as duas agulhas resultantes são um período similar.
- Puxe capilares várias (cerca de 2 capilares para cada proteína de interesse).
- Agulhas armazenar em um recipiente com a certeza de não danificar a ponta da agulha. Materiais como espuma ou Blu-Tack pode ser usado em recipientes para armazenar agulhas microinjeção.
2. Preparação de misturas de proteínas para Injeção
- Prepare um buffer de microinjeção 10x contendo 1 M de cloreto de potássio e fosfato de potássio 0,1 M (KPI) tampão (mistura equimolar de K 2 HPO 4 e KH 2 PO 4) para um pH de 7,4. Este buffer pode ser armazenado a longo prazo na temperatura ambiente.
- Para visualizar a injeção, um corante fluorescente rodamina-dextrano, como pode ser adicionada. Diluir tampão microinjeção the10x na água e dissolver rodamina-dextran em pó para fazer uma solução tampão 5x microinjeção contendo 20-40 mg / mL rodamina dextran.
- Conservar a solução no escuro a 4 ° C. Deve ser suficiente para até 100 preparações solução individual de proteínas. Outros corantes, como o isotiocianato de fluoresceína-dextran pode substituir.
- Prepare stocks citocromo c purificado pela dissolução do citocromo c em água a uma concentração de 20 mg / mL. Loja do citocromo c a -80 ° C para armazenamento de longo prazo e evitar os ciclos de congelamento e descongelamento, armazenando citocromo c em pequenas (~ mL 10) alíquotas.
- Prepare uma mistura de proteínas 10 mL para injeção através da combinação de buffer de 2 mL microinjeção 5x contendo rodamina-dextran com 3 mL de água e 5 mL do citocromo c para uma concentração final de 10 mg / mL do citocromo c em 1x tampão (100 mM KCl, 10 mM KP i, 4-8 mg / mL rodamina dextran).
3. Microinjeção citoplasmática de citocromo c
- Pouco antes de microinjeção, centrifugar a mistura do citocromo c e buffer microinjeção a 16.000 g por 10 minutos a 4 ° C para separar quaisquer partículas que podem entupir agulhas microinjeção.
- Durante a centrifugação, ligue o microinjetor para permitir que a pressão do ar para construir.
- Coloque um prato de células no centro do palco microscópio e definir o foco sobre as células. Para minimizar a quantidade de tempo que as células são mantidas fora da incubadora, as células são normalmente retornados para a incubadora dentro de 30 min.
- Pipeta 0,5-1 mL da superfície superior da mistura de proteínas na extremidade sem corte do capilar. Tenha cuidado para não pipetar as partículas que foram centrifugados para o fundo do tubo. Dentro de um minuto, a mistura de proteína irá distribuir para a ponta da agulha através da ação capilar.
- Coloque a agulha firmemente ao titular capilar do micromanipulador e posicionar a agulha de modo que sua ponta passa através da luz transmitida do microscópio em aproximadamente um ângulo de 45 °.
- Ajustar a posição da ponta da agulha para que ele seja localizado, no centro do campo de visão. Para centralizar a agulha, use o micromanipulador para mover a agulha ao olhar através da ocular do microscópio. A sombra agulha deve ser visível. Ajuste a agulha de modo que sua sombra é visto apenas em uma metade do campo de visão, indicando que a ponta da agulha está centrada acima das células.
- Definir o microinjetor para o modo de fluxo contínuo e definir a pressão de trabalho de 20-100 hPa. Cada agulha pode exigir uma pressão de trabalho diferente, a pressão de trabalho e provavelmente vai precisar de ajustes durante o processo de microinjeção de manter um fluxo constante.
- Abaixe a agulha com o botão grossa para uma posição um pouco acima das células. Para fazer isso, elevar o plano focal do microscópio para uma posição um pouco acima das células. Depois abaixe a agulha em direção as células usando o botão grossa até a ponta da agulha está em foco.
- Re centro-ponta da agulha dentro do campo de visão e aumentar a ampliação, alterando a objetiva do microscópio.
- Abaixe lentamente a agulha usando o botão unti multa manipuladorl agulha é apenas ligeiramente acima do plano focal das células.
- Verificar o fluxo da mistura de proteínas, olhando para a fluorescência vermelha da rodamina. A mistura de proteínas deve ser sair a agulha como um fluxo fino e constante. As agulhas devem ser substituídos e re-loaded Se a agulha estiver comprometida ou se o fluxo é muito forte. Às vezes, a ponta do capilar de vidro está fechado e sem fluxo é visto a partir da agulha. Se isso ocorrer, substitua a agulha com cuidado ou abaixá-lo para o fundo do prato cultura gentilmente ruptura da ponta da agulha.
- Posição da ponta da agulha de forma que ele está apontando para uma célula em aproximadamente um ângulo de 45 °. Em seguida, com um movimento suave, abaixar a agulha enquanto movê-lo para o celular. Com um movimento suave segundo, imediatamente inverter a direção da agulha para removê-lo da cela.
- Uma célula injetou com sucesso, muitas vezes, ligeiramente inchar e pode ser confirmado através da visualização da rodamina vermelho fluorescente dentro da célula. Ocasionalmente, uma célula vai ser acidentalmente injetado no núcleo, que será visível.
- Continuar a injetar células, ajustando o estágio do microscópio até cerca de 50-100 células são injetadas. Ao mover o estágio do microscópio, certifique-se de levantar a agulha microinjeção de modo que ele limpa a parte superior das células.
4. Resultados representativos:
A microinjeção citoplasmática de citocromo c imita o seu lançamento a partir da mitocôndria durante a apoptose. Assim, como esperado, fibroblastos rapidamente sofrem apoptose após microinjeção citosólica de bovinos do citocromo c (Fig. 1A). Para garantir que o procedimento de injeção por si só não é responsável pela morte celular, a injeção de levedura citocromo c serve como um controle importante, já que o fermento do citocromo c é incapaz de ativar caspases 12.
Curiosamente, pós-mitóticas neurônios simpáticos são notavelmente resistentes à citosólica do citocromo c (Figura 1B) 8,13. Nosso laboratório identificou que o XIAP inibidor endógeno é um inibidor da caspase-chave de ativação do caspase em neurônios 14. Assim, para os neurônios à morte após a injeção do citocromo c, XIAP deve primeiro tornar-se desativado. Por exemplo, microinjeção de citocromo c em xiap - / - neurônios simpáticos é suficiente para permitir a ativação das caspases e apoptose nessas células (Fig. 2).
Figura 1. Microinjeção citoplasmática de citocromo c induz a morte rápida em fibroblastos, mas não os neurônios. A) do tipo selvagem MEFs ou (B) 5 dia pós-natal do tipo selvagem neurônios simpáticos receberam microinjeções bovina do citocromo c (10 mg / mL), juntamente com rodamina-dextran para marcar células injetadas. Imagens mostram o mesmo campo de células a injeção imediatamente a seguir (0 h), ou nos horários indicados. Setas indicam células injetadas. Barra de escala, 20 mM.
Figura 2. XIAP deficiente neurônios são suscetíveis a microinjeção c citoplasmática citocromo. 5 º dia pós-natal neurônios simpáticos de camundongos knockout XIAP receberam microinjeções bovina do citocromo c (10 mg / mL), juntamente com rodamina-dextran para marcar células injetadas. Imagens mostram o mesmo campo de células a injeção imediatamente a seguir (0 h), ou 5 horas depois do citocromo c microinjeção (5 h). Barra de escala, 20 mM.
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Discussion
A microinjeção de citocromo c diretamente no citoplasma das células é uma ferramenta original e poderosa que permite estudos de regulação pós-mitocondrial da apoptose. Importante, esta técnica permite a ativação direta da apoptose a jusante da mitocôndria sem o uso de agentes que causam dano celular ou mitocondrial.
Embora este protocolo tem se concentrado em microinjeção de citocromo c para estudos sobre apoptose, os princípios gerais da microinjeção de proteínas mostrado aqui também pode ser usado para outras proteínas de interesse. Por exemplo, alguns pesquisadores têm utilizado microinjeção de anticorpos que alvejam proteínas específicas, como o citocromo c ou c-jun em estudos de apoptose 13,15.
A dificuldade mais comum durante a microinjeção é o entupimento de agulhas microinjeção durante o procedimento. Se a agulha se torna obstruído, pode-se usar a função "clean" no microinjetor que envia um pulso forte pressão através da agulha para expelir partículas bloqueando a abertura da agulha. Muitas vezes, a limpeza da agulha é suficiente para desobstruir a agulha. No entanto, se corante é visto saindo da agulha durante uma "limpa", mas imediatamente pára novamente, isso indica que a pressão de trabalho sobre o microinjetor pode ser muito baixa. Neste caso, aumentar a pressão de trabalho até que um fluxo contínuo da agulha é visto novamente. Lavagem a agulha nem sempre restaurar o fluxo, caso em que as necessidades agulha mais provável de ser substituído. Uma técnica que pode ser usado como uma alternativa, especialmente se o material de injecção em si é precioso, envolve delicadamente quebrando a ponta da agulha microinjeção contra o fundo do prato de cultura de tecidos. Se feito com cuidado, isso pode ampliar a abertura da agulha e restaurar o fluxo. No entanto, uma grande fenda na abertura agulha irá causar uma liberação maciça de corante na placa de cultura, obscurecendo a visão de células.
Infelizmente, nem todos os tipos de células são capazes de ser microinjeção. Algumas células (por exemplo, neurônios granulares do cerebelo) são muito pequenos para microinjeção. Outras células (cardiomiócitos adultos, por exemplo), enquanto grande o suficiente, não pode suportar o procedimento de injeção e morrer, mesmo com injeções de controle. Como descrito acima, a microinjeção de levedura citocromo c serve como um controle útil, já que o fermento do citocromo c é incapaz de ativar caspases. Células de levedura microinjeções citocromo c não irá ativar a apoptose a menos que seja devido ao procedimento de microinjeção em si. Finalmente, algumas células (fibroblastos, por exemplo) pode suportar microinjeção mas pode ser difícil para injetar devido à sua morfologia plana. Como resultado, há um risco de que a agulha microinjeção vai quebrar contra o fundo do prato de cultura de tecidos com cada célula que é injetado.
Micromanipuladores automatizado ou manual pode ser usado para microinjeção de proteínas, com cada sistema tem vantagens e desvantagens. Micromanipuladores automatizados são convenientes porque se pode definir um nível z-eixo para que a agulha microinjeção é automaticamente reduzida para células injetáveis. Isso é particularmente útil ao injetar células cuja altura é semelhante em uma monocamada de cultura de células. No entanto, para que as células são cultivadas em placas de revestimento, (por exemplo, neurônios semeadas em colágeno revestido pratos), a natureza tridimensional dessas culturas torna a configuração de um nível z-eixo específico tedioso. Para essas culturas, micromanipuladores manual são vantajosas uma vez que a agulha pode ser rapidamente ajustada à altura específica de cada célula.
Microinjeção pode ser uma técnica difícil de dominar e exigirá prática. Além disso, a técnica da microinjeção tem algumas limitações. Por exemplo, apenas uma pequena proporção de células em um prato de cultura de tecidos pode ser injetado. Assim, as preparações bioquímicas em que toda a cultura é coletado (lisados celulares por exemplo, Western blot) não são uma representação precisa das células injetadas sozinho. Em vez disso, a maioria dos experimentos precisam ser concluídas no nível de uma única célula. No entanto, uma vez que as técnicas básicas aqui apresentadas são dominados, pode-se realizar um conjunto único de experiências para testar hipóteses que não podem ser respondidas utilizando outros métodos.
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Disclosures
Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Universidade da Carolina do Norte.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder NS042197 a MD. AJK foi suportada por concessões T32GM008719 e F30NS068006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica Microsystems | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige International | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige International | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
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