Summary
In questo protocollo, si descrive la microiniezione diretta citoplasmatico del citocromo
Abstract
L'apoptosi, o morte cellulare programmata, è un percorso conservato e altamente regolato con cui le cellule muoiono 1. L'apoptosi può essere attivata quando le cellule incontrano una vasta gamma di sollecitazioni citotossici. Questi insulti avviare cascate di segnalazione che alla fine causano il rilascio del citocromo c dallo spazio intermembrana mitocondriale al citoplasma 2. Il rilascio di citocromo c dai mitocondri è un evento chiave che innesca la rapida attivazione delle caspasi, le proteasi cellulari chiave che alla fine eseguire la morte delle cellule 3-4.
Il percorso di apoptosi è regolata a punti a monte ea valle del rilascio del citocromo c dai mitocondri 5. Per studiare la regolazione post-mitocondriale di attivazione delle caspasi, molti ricercatori si sono rivolti a microiniezione diretta citoplasmatica di holocytochrome c (eme-allegato) delle proteine nelle cellule 6-9. Citocromo c è normalmente localizzato nei mitocondri, dove l'attaccamento di un gruppo eme è necessaria per poter attivare l'apoptosi 10-11. Pertanto, per attivare direttamente caspasi, è necessario iniettare la proteina c holocytochrome invece del suo cDNA, perché mentre l'espressione del citocromo c dai costrutti cDNA si tradurrà in targeting mitocondriale e attaccamento eme, sarà sequestrato dalla caspasi citosolico. Così, la microiniezione diretta citosolica purificata di eme-attached proteina citocromo c è un utile strumento per simulare rilascio del citocromo c mitocondriale e l'apoptosi senza l'uso di insulti tossici che provocano danni cellulari e mitocondriali.
In questo articolo, si descrive un metodo per la microiniezione di proteine citocromo c nelle cellule, usando il mouse fibroblasti embrionali (MEF) e primario neuroni simpatici come esempi. Anche se questo protocollo si concentra sulla iniezione di citocromo c per le indagini di apoptosi, le tecniche qui riportate può anche essere facilmente adattato per microiniezione di proteine di interesse.
Protocol
1. Produzione di aghi Microiniezione
- Prefabbricati aghi microiniezione Sono disponibili in commercio (ad es. Femtotips da Eppendorf) e sono utili se non si sta eseguendo un gran numero di microiniezioni. Tuttavia, per coloro che desiderano stabilirsi a lungo termine le capacità per microinjecting, un'alternativa è quella di produrre aghi microiniezione in laboratorio utilizzando sottile parete in vetro borosilicato capillari e un estrattore ago commerciale. Questo permette anche la forma degli aghi per essere variato, che può essere utile per diversi tipi di cellule.
- Con il PC-10 Microiniezione Puller Ago Narishige, allegare tutti e quattro i pesi e utilizzare un one-step programma tirando (Fase 1 impostazione) con l'impostazione di calore rispetto a 58,0 (riscaldamento n.2). Assicurarsi di posizionare l'elemento riscaldante al centro di ogni capillare in modo che i due aghi che costituiscano una lunghezza simile.
- Tirare diversi capillari (circa 2 capillari per ogni proteina di interesse).
- Aghi Conservare in un contenitore pur essendo sicuri di non danneggiare la punta dell'ago. Materiali come schiuma o Blu-Tack può essere utilizzato in contenitori per contenere aghi microiniezione.
2. Preparazione di miscele di proteine per iniezione
- Preparare un buffer 10x microiniezione contenente 1 M di cloruro di potassio e fosfato di potassio 0,1 M (KPI) buffer (miscela equimolare di K 2 HPO 4 e KH 2 PO 4) ad un pH di 7,4. Questo buffer può essere conservato a lungo termine a temperatura ambiente.
- Per visualizzare l'iniezione, un colorante fluorescente come rodamina-destrano deve essere aggiunto. Diluire il tampone the10x microiniezione in acqua e sciogliere rodamina-destrano in polvere per fare una soluzione tampone 5x microiniezione contenente 20-40 mg / mL rodamina destrano.
- Conservare questa soluzione al buio a 4 ° C. Dovrebbe essere sufficiente per un massimo di 100 preparazioni individuali soluzione proteica. Altri coloranti, come la fluoresceina isotiocianato-destrano può sostituire.
- Preparare citocromo c scorte sciogliendo purificato citocromo c in acqua ad una concentrazione di 20 mg / mL. Conservare citocromo c a -80 ° C per conservazione a lungo termine ed evitare cicli gelo-disgelo, memorizzando citocromo c in piccole (~ 10 mL) aliquote.
- Preparare una miscela di 10 microlitri di proteine per l'iniezione, combinando 2 il buffer microlitri microiniezione 5x contenente rodamina-destrano con 3 microlitri di acqua e 5 microlitri citocromo c per una concentrazione finale di 10 mg / ml citocromo c in 1x tampone (100 mM KCl, 10 mM KP i, 4-8 mg / mL rodamina destrano).
3. Microiniezione citoplasmatica della citocromo c
- Appena prima di microiniezione, centrifuga la miscela di citocromo c ed tampone microiniezione a 16.000 g per 10 minuti a 4 ° C per separare le particelle che potrebbero intasare gli aghi microiniezione.
- Durante la centrifugazione, accendere il microinjector per consentire la pressione dell'aria a costruire.
- Posizionare un piatto di cellule al centro del palco microscopio e impostare lo stato attivo sulle cellule. Per ridurre al minimo la quantità di tempo che sono conservate le cellule al di fuori dell'incubatore, le cellule sono di solito restituiti al incubatore entro 30 min.
- Pipettare 0,5-1 microlitri dalla superficie superiore della miscela proteica nelle estremità piatta del capillare. Fare attenzione a non pipetta le particelle che sono stati centrifugati al fondo della provetta. Nel giro di un minuto, la miscela proteica distribuirà alla punta dell'ago attraverso l'azione capillare.
- Applicare l'ago saldamente al titolare capillare del micromanipolatore e la posizione della lancetta in modo che la punta passa attraverso la luce trasmessa del microscopio a circa 45 °.
- Regolare la posizione della punta dell'ago in modo che si trova nel centro del campo visivo. Per centrare l'ago, utilizzare il micromanipolatore per spostare l'ago mentre guardando attraverso l'oculare microscopio. L'ombra ago deve essere visibile. Regolare l'ago in modo che la sua ombra è visto solo in una metà del campo visivo, indicando che la punta dell'ago è centrata sopra le cellule.
- Impostare il microinjector alla modalità a flusso continuo e regolare la pressione di lavoro a 20 - 100 hPa. Ogni ago può richiedere una diversa pressione di lavoro, e la pressione di lavoro sarà probabilmente necessario aggiustamento durante la procedura di microiniezione per mantenere un flusso costante.
- Abbassare l'ago con la manopola grossolana a una posizione appena sopra le cellule. Per fare questo, aumentare il piano focale del microscopio di una posizione appena sopra le cellule. Quindi abbassare l'ago verso le cellule usando la manopola grossolana fino a quando la punta dell'ago è a fuoco.
- Ricentrare la punta dell'ago all'interno del campo visivo e aumentare l'ingrandimento cambiando l'obiettivo microscopio.
- Abbassare lentamente l'ago con la multa unti manopola manipolatorel l'ago è leggermente al di sopra del piano focale delle cellule.
- Controllare il flusso della miscela proteica guardando la fluorescenza rossa della rodamina. La miscela di proteine dovrebbe essere uscire l'ago come un sottile flusso costante. Gli aghi devono essere sostituiti e ri-caricato se l'ago è compromessa o se il flusso è troppo forte. A volte, la punta di un capillare di vetro è chiuso e nessun flusso è visto dall'ago. In questo caso, sostituire l'ago o accuratamente inferiore al fondo del piatto cultura di rottura con delicatezza la punta dell'ago.
- Posizionare la punta dell'ago in modo che sia rivolta verso una cella di circa 45 °. Poi con un movimento fluido, abbassare l'ago durante lo spostamento verso la cella. Con una seconda mozione liscio, immediatamente invertire la direzione dell'ago per rimuoverlo dalla cellula.
- Una cellula con successo iniettato spesso un po 'gonfia e può essere confermata dalla visualizzazione della rodamina rosso fluorescente all'interno della cellula. Occasionalmente, una cella sarà accidentalmente iniettato nel nucleo, che sarà visibile.
- Continuano a iniettare le cellule regolando la fase microscopio fino a circa 50-100 cellule vengono iniettate. Quando si sposta la fase di microscopio, assicurarsi di sollevare l'ago microiniezione in modo che cancella la parte superiore delle cellule.
4. Rappresentante dei risultati:
La microiniezione citoplasmatico del citocromo c imita il suo rilascio dai mitocondri durante l'apoptosi. Così, come previsto, i fibroblasti rapidamente apoptosi su microiniezione citosolico di bovini citocromo c (Fig. 1A). Per garantire che la procedura di iniezione da sola non è responsabile per la morte cellulare, l'iniezione di lievito citocromo c serve come un controllo importante, dal momento lievito citocromo c è in grado di attivare caspasi 12.
È interessante notare che post-mitotico neuroni simpatici sono molto resistenti a citosolico citocromo c (Fig. 1B) 8,13. Il nostro laboratorio ha identificato che la XIAP inibitore endogeno della caspasi è un inibitore chiave di attivazione delle caspasi nei neuroni 14. Così, per i neuroni a morire dopo l'iniezione del citocromo c, XIAP deve prima diventare inattivato. Per esempio, la microiniezione di citocromo c in XIAP - / - neuroni simpatici è sufficiente per consentire l'attivazione delle caspasi e apoptosi in queste cellule (Fig. 2).
Figura 1. Microiniezione citoplasmatico del citocromo c induce la morte rapida nei fibroblasti, ma non i neuroni. A) wild-type o MEF (B) giorno dopo la nascita 5 neuroni simpatici wild-type sono state microiniettati bovina con citocromo c (10 mg / mL) insieme con rodamina-destrano per marcare le cellule iniettate. Le immagini mostrano lo stesso campo di cellule immediatamente dopo l'iniezione (0 ore), oppure secondo gli orari indicati. Le frecce indicano le cellule iniettate. Scala grafica, 20 micron.
Figura 2. XIAP deficit di neuroni sono suscettibili di citoplasma del citocromo c microiniezione. Postnatale giorno 5 neuroni simpatici da topi knockout XIAP erano microiniettati con bovina citocromo c (10 mg / mL) insieme con rodamina-destrano per marcare le cellule iniettate. Le immagini mostrano lo stesso campo di cellule immediatamente dopo l'iniezione (0 ore), o 5 ore dopo la microiniezione del citocromo c (5 ore). Scala grafica, 20 micron.
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Discussion
La microiniezione del citocromo c direttamente nel citoplasma delle cellule è uno strumento unico e potente che permette di studi di post-regolazione dell'apoptosi mitocondriale. È importante sottolineare che questa tecnica permette l'attivazione diretta di valle apoptosi dei mitocondri, senza l'uso di agenti che causano il danno cellulare o mitocondriale.
Anche se questo protocollo si è concentrata sulla microiniezione di citocromo c per gli studi sulla apoptosi, i principi generali di microiniezione di proteine mostrato qui può essere utilizzato anche per altre proteine di interesse. Per esempio, alcuni ricercatori hanno usato microiniezione di anticorpi che colpiscono proteine specifiche, come il citocromo c o c-Jun negli studi di apoptosi 13,15.
La difficoltà più comune durante la microiniezione è l'ostruzione di aghi microiniezione durante la procedura. Se l'ago si ostruisce, si può usare la funzione "clean" sul microinjector che invia un impulso forte pressione attraverso l'ago di espellere particelle bloccando l'apertura dell'ago. Spesso, la pulizia l'ago è sufficiente a sbloccare l'ago. Tuttavia, se colorante è visto uscire l'ago nel corso di una "pulita" ma si ferma subito ancora una volta, questo indica che la pressione di esercizio sul microinjector potrebbe essere troppo basso. In questo caso, aumentare la pressione di esercizio fino a un flusso continuo da l'ago è più visto. Pulizia l'ago non sempre ripristinare il flusso, nel qual caso le esigenze ago più probabilità di essere sostituito. Una tecnica che può essere utilizzata come alternativa, soprattutto se il materiale di iniezione è di per sé prezioso, coinvolge con delicatezza rompendo la punta dell'ago microiniezione contro il fondo del piatto coltura di tessuti. Se fatto con attenzione, questo può allargare l'apertura dell'ago e ripristinare il flusso. Tuttavia, una grande crepa in apertura dell'ago causerà un massiccio rilascio di colorante nel piatto cultura, oscurando la vista delle cellule.
Purtroppo, non tutti i tipi cellulari sono in grado di essere microiniettati. Alcune cellule (ad esempio i neuroni dei granuli cerebellari) sono troppo piccoli per microiniezione. Altre cellule (ad esempio cardiomiociti adulti), mentre abbastanza grande, non può resistere alla procedura di iniezione e morire anche con iniezioni di controllo. Come descritto in precedenza, la microiniezione di lievito citocromo c serve come un controllo utile dal lievito del citocromo c è in grado di attivare la caspasi. Cellule di lievito microiniettati con citocromo c non attiverà apoptosi meno che non sia in base al metodo microiniezione stessa. Infine, alcune cellule (fibroblasti ad esempio) in grado di sopportare microiniezione, ma può essere difficile da iniettare a causa della loro morfologia pianeggiante. Come risultato, c'è il rischio che l'ago microiniezione si romperà contro il fondo del piatto coltura tissutale con ogni cellula che viene iniettato.
Micromanipolatori automatico o manuale può essere usato per microiniezione di proteine, con ogni sistema con vantaggi e svantaggi. Micromanipolatori automatizzati sono convenienti perché si può impostare un asse z livello a cui l'ago microiniezione si abbassa automaticamente per le cellule per via parenterale. Ciò è particolarmente utile quando l'iniezione di cellule la cui altezza è simile in un monostrato di coltura cellulare. Tuttavia, per il quale le cellule vengono coltivate su piatti rivestiti, (ad esempio i neuroni placcato sul collagene rivestita piatti), la natura tridimensionale di queste culture permette di configurare uno specifico asse z livello noioso. Per queste culture, micromanipolatori manuale sono vantaggiosi in quanto l'ago può essere rapidamente adattato alle specifiche altezza di ogni cella.
Microiniezione può essere una tecnica difficile da padroneggiare e richiede pratica. Inoltre, la tecnica di microiniezione presenta alcune limitazioni. Per esempio, solo una piccola percentuale di cellule in un piatto di coltura può essere iniettato. Così, i preparativi biochimiche in cui sono raccolti tutta la cultura (lisati cellulari ad esempio per Western Blot) non sono una rappresentazione accurata delle cellule iniettate solo. Invece, la maggior parte gli esperimenti devono essere completate a livello di singola cellula. Tuttavia, una volta che le tecniche di base qui presentate sono padronanza, si può eseguire un insieme unico di esperimenti per verificare le ipotesi che non si può rispondere con altri metodi.
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Disclosures
Tutte le procedure sperimentali su animali sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso l'Università del North Carolina.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere NS042197 a MD. AJK è stato supportato da sovvenzioni T32GM008719 e F30NS068006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica Microsystems | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige International | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige International | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
References
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