Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em
Summary
Bu protokol, sitokrom doğrudan sitoplazmik mikroenjeksiyon<em> C</em> Fibroblastlar ve birincil sempatik nöronlar içine protein. Bu teknik, sitokrom giriş için izin verir<em> C</em> Hücreleri ve taklit sitokrom serbest sitoplazma içine protein<em> C</em> Mitokondri, apoptozis sırasında oluşur.
Abstract
Apoptozis veya programlanmış hücre ölümüne yardımcı hücreleri ölür 1 tarafından korunmuş ve oldukça düzenli bir yoludur . Hücrelerin sitotoksik gerilmeler geniş bir yelpazede karşılaştığınızda Apoptoz tetiklenebilir. Bu hakaretler, sonuçta, mitokondriyal arası boşlukta sitoplazma 2 sitokrom c salınımına neden sinyal kaskadlar başlatabilir. Mitokondri sitokrom c salınımı caspases, sonuçta 3-4 hücre ölümü yürütmek en önemli hücresel proteazlar hızlı aktivasyonunu tetikler kilit bir olay.
Apoptozis yol mitokondri 5 sitokrom c serbest memba ve mansap noktalarında düzenlenir. Kaspaz aktivasyonu sonrası mitokondriyal yönetmelik çalışması için, birçok araştırmacılar, holocytochrome c (heme bağlı) hücrelerin içine protein 6-9 sitoplazmik doğrudan mikroenjeksiyon çevirdiler . Sitokrom c normalde heme grubu eki, 10-11 apoptozis etkinleştirmek için sağlamak için gerekli olduğu mitokondri lokalize olur . Bu nedenle, doğrudan caspases etkinleştirmek için, sitokrom c cDNA yapıları ifade mitokondriyal hedefleme ve hem eki neden olurken, sitozolik caspases saklamış olacak çünkü holocytochrome c protein yerine cDNA enjekte etmek gereklidir. Böylece, saflaştırılmış heme bağlı sitokrom c protein doğrudan sitozolik mikroenjeksiyon, hücresel ve mitokondriyal hasara yol açan toksik hakaret kullanmadan mitokondrial sitokrom c salınımı ve apoptoz taklit etmek için yararlı bir araçtır.
Bu makalede, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) ve örnek olarak birincil sempatik nöronlar kullanarak, sitokrom c proteinin hücre içine mikroenjeksiyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol apopitoz araştırmalar için sitokrom c enjeksiyon odaklanırken, burada gösterilen teknikleri da kolayca diğer ilgi proteinlerin mikroenjeksiyon için adapte olabilir.
Protocol
Discussion
Sitokrom c, doğrudan hücre sitoplazma içine mikroenjeksiyon apopitoz sonrası mitokondriyal düzenleme çalışmaları için olanak sağlayan bir benzersiz ve güçlü bir araçtır. Önemlisi, bu teknik, hücresel veya mitokondriyal hasara yol açan ajanların kullanımı olmadan mitokondri apoptozis downstream doğrudan aktivasyonu için olanak sağlar.
Bu protokol, apoptozis çalışmaları için sitokrom c mikroenjeksiyon odaklanmış olsa da, genel ilkeleri Burada g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, MD, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe NS042197 tarafından desteklenen oldu. Ajk hibe T32GM008719 ve F30NS068006 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
References
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, 205-219 (2004).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).
- Hengartner, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 407, 770-776 (2000).
- Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem. J. 384, 201-232 (2004).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
- Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2. Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).
- Li, F. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release. J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).
- Deshmukh, M., Johnson, E. M. Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c. Neuron. 21, 695-705 (1998).
- Vaughn, A. E., Deshmukh, M. Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c. Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).
- Yang, J. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science. 275, 1129-1132 (1997).
- Gonzales, D. H., Neupert, W. Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes. J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).
- Ellerby, H. M. Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis – comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).
- Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis. J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).
- Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).
- Estus, S. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).
