Summary
In dit protocol beschrijven we de directe cytoplasmatische micro-injectie van cytochroom
Abstract
Apoptose of geprogrammeerde celdood, is een geconserveerd en sterk gereguleerd weg waardoor cellen sterven 1. Apoptose kan worden geactiveerd wanneer cellen geconfronteerd met een breed scala aan cytotoxische spanningen. Deze beledigingen starten signaleringscascades die uiteindelijk leiden tot het vrijkomen van cytochroom c van het mitochondriale intermembrane ruimte om het cytoplasma 2. Het vrijkomen van cytochroom C van mitochondriën is een belangrijke gebeurtenis dat de snelle activatie van caspases, de belangrijkste cellulaire proteasen die uiteindelijk uit te voeren celdood 3-4 triggers.
De route van apoptose is geregeld op punten stroomopwaarts en stroomafwaarts van cytochroom c vrijlating uit de mitochondriën 5. Om de post-mitochondriale regulering van caspase activatie studie, hebben veel onderzoekers zich tot de directe cytoplasmatische micro-injectie van holocytochrome c (heem-ingeschrevenen) eiwit in cellen 6-9. Cytochroom c is normaal gelokaliseerd in de mitochondriën, waar bevestiging van een heem groep is nodig om het te activeren apoptose 10-11. Daarom direct te activeren caspases, is het noodzakelijk om de holocytochrome c eiwit in plaats van de cDNA injecteren, want terwijl de expressie van cytochroom c van cDNA constructen zal resulteren in het mitochondriaal targeting en heem gehechtheid, het zal worden afgezonderd van de cytosolische caspases. Zo is de directe cytosolische micro-injectie van gezuiverd heem-aangesloten cytochroom c-eiwit is een nuttig hulpmiddel om mitochondriaal cytochroom c vrij te laten en apoptose na te bootsen, zonder het gebruik van giftige beledigingen welk cellulair en mitochondriale schade veroorzaken.
In dit artikel beschrijven we een methode voor de micro-injectie van cytochroom c eiwitten in de cellen, met behulp van muis embryonale fibroblasten (MEF) en primaire sympathische neuronen als voorbeelden. Terwijl dit protocol richt zich op de injectie van cytochroom c voor onderzoeken van apoptose, kan de technieken die hier getoond ook gemakkelijk worden aangepast voor micro-injectie van andere eiwitten van belang.
Protocol
1. De productie van micro-injectie naalden
- Geprefabriceerde microinjectie naalden zijn commercieel verkrijgbaar (bijv.. Femtotips van Eppendorf) en zijn handig als men niet het uitvoeren van een groot aantal micro-injecties. Echter, voor degenen die wensen op de lange termijn mogelijkheden vast te stellen voor microinjecting, een alternatief is om micro-injectie naalden te produceren in het lab met behulp van dunne wand borosilicaatglas haarvaatjes en een commerciële naald trekker. Hierdoor kan ook de vorm van naalden te variëren, wat nuttig kan zijn voor de verschillende celtypen.
- Met de Narishige PC-10 microinjectie Naald Puller, bevestigen alle vier de gewichten en gebruik maken van een een-staps trekken programma (Stap 1 instelling) met de relatieve warmte instelling op 58,0 (Nr.2 verwarming). Zorg ervoor dat u het verwarmingselement dus plaats in het midden van elk capillaire dat de twee resulterende naalden zijn een vergelijkbare lengte.
- Trek een aantal haarvaten (ongeveer 2 capillairen voor elk eiwit van interesse).
- Bewaar naalden in een container terwijl zeker niet om de naald beschadigen. Materialen zoals schuim of Blu-Tack kan worden gebruikt in containers naar micro-injectie naalden vast te houden.
2. De voorbereiding van eiwitmengsels voor Injectie
- Bereid een 10x micro-injectie een buffer met 1 M kaliumchloride en 0,1 M kaliumfosfaat (KPI) buffer (equimolair mengsel van K 2 HPO 4 en KH 2 PO 4) bij een pH van 7,4. Deze buffer kan worden opgeslagen op lange termijn bij kamertemperatuur.
- Te visualiseren van de injectie, een fluorescente kleurstof zoals rhodamine-dextran moet worden toegevoegd. Verdunnen the10x micro-injectie buffer in het water en los rhodamine-dextran poeder om een 5x microinjectie buffer oplossing die 20-40 mg / ml rhodamine dextran te maken.
- Bewaar deze oplossing in het donker bij 4 ° C. Het zou voldoende moeten zijn voor maximaal 100 individuele eiwitoplossing preparaten. Andere kleurstoffen, zoals fluoresceïne isothiocyanaat-dextran kan vervangen.
- Bereid cytochroom c voorraden door het oplossen van gezuiverd cytochroom c in water tot een concentratie van 20 mg / ml. Bewaar cytochroom c bij -80 ° C voor langdurige opslag en vermijd vries-dooi cycli door het opslaan van cytochroom c in kleine (~ 10 pi) porties.
- Bereid een 10 ul eiwitmengsel voor injectie door het combineren van 2 pl 5x micro-injectie een buffer met rhodamine-dextran met 3 pi water en 5 ul cytochroom c voor een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml cytochroom c in 1x buffer (100 mM KCl, 10 mM KP i, 4-8 mg / ml rhodamine dextran).
3. Cytoplasmatische micro-injectie van Cytochroom c
- Net voor micro-injectie, centrifuge het mengsel van cytochroom c en microinjectie buffer bij 16.000 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C naar elke deeltjes die zouden kunnen verstoppen en micro-injectie naalden te scheiden.
- Tijdens het centrifugeren, zet de microinjector zodat de luchtdruk op te bouwen.
- Plaats een schotel van cellen in het midden van de microscoop podium en zet de focus op de cellen. Het minimaliseren van de hoeveelheid tijd dat de cellen worden gehouden buiten de incubator worden de cellen meestal terug naar de incubator binnen 30 minuten.
- Pipetteer 0,5-1 pi van de bovenzijde van het eiwit mengsel in de stompe uiteinde van de capillair. Wees voorzichtig om niet pipetteren alle deeltjes die zijn gecentrifugeerd om de bodem van de buis. Binnen een minuut, zal het eiwit mengsel te distribueren naar de naald door middel van capillaire werking.
- Steek de naald op de capillaire houder van de micromanipulator en plaats de naald, zodat de punt passeert het doorgelaten licht van de microscoop op ongeveer een hoek van 45 °.
- Pas de positie van de naaldpunt, zodat deze direct is gelegen in het centrum van het gezichtsveld. Naar het centrum van de naald, gebruik dan de micromanipulator om de naald te verplaatsen terwijl u door de microscoop oculair. De naald schaduw zichtbaar moet zijn. Stel de naald zodat de schaduw is alleen te zien in een helft van het gezichtsveld, wat aangeeft dat de naald in het midden boven de cellen.
- Stel de microinjector om de continue stroom modus en stel de werkdruk tot 20 - 100 hPa. Elke naald kan een andere werkdruk, en de werkdruk zal waarschijnlijk moeten worden aangepast tijdens de micro-injectie procedure om een gestage stroom te behouden.
- Laat de naald met behulp van de grove knop naar een positie net boven de cellen. Om dit te doen, verhogen het brandvlak van de microscoop naar een positie net boven de cellen. Dan lager de naald naar de cellen met behulp van de grove knop tot de top van de naald in de focus.
- Opnieuw het centrum van de naald op het gebied van uitzicht en vergroten vergroting door het veranderen van de microscoop doelstelling.
- Langzaam de naald met behulp van de fijne manipulator knop until van de naald is net iets boven het brandvlak van de cellen.
- Controleer de stroom van het eiwitmengsel door te kijken naar de rode fluorescentie van de rhodamine. Het eiwit mengsel moet het verlaten van de naald als een dunne, constante stroom. Naalden moeten worden vervangen en opnieuw geladen als de naald wordt aangetast of als de stroom is veel te sterk. Soms is het topje van de glazen capillaire gesloten en er geen stroming wordt gezien van de naald. Als dit gebeurt, vervang de naald of voorzichtig laten zakken naar de bodem van de cultuur schotel voorzichtig scheuren de punt van de naald.
- Plaats de naald, zodat het naar een cel wijst op ongeveer een hoek van 45 °. Dan met een vloeiende beweging, hoe lager de naald tijdens het verplaatsen het naar de cel. Met een tweede vloeiende beweging meteen achteruit de richting van de naald om het te verwijderen uit de cel.
- Een succesvol geïnjecteerd cel zal vaak iets zwellen en kan worden bevestigd door het visualiseren van de rode fluorescerende rhodamine in de cel. Af en toe zal een cel per ongeluk worden geïnjecteerd in de kern, die zichtbaar zal zijn.
- Ga verder naar de cellen te injecteren door het aanpassen van de microscoop fase tot ongeveer 50-100 cellen zijn geïnjecteerd. Bij het verplaatsen van de microscoop stadium, moet u de micro-injectie naald omhoog te zetten, zodat deze wist de top van de cellen.
4. Representatieve resultaten:
De cytoplasmatische micro-injectie van cytochroom c bootst haar vrijlating uit de mitochondriën tijdens apoptose. Dus, zoals verwacht, fibroblasten snel ondergaan apoptose bij de cytosolische micro-injectie van runderen cytochroom c (Fig. 1A). Om ervoor te zorgen dat de injectie procedure niet alleen verantwoordelijk is voor celdood, injectie van gist cytochroom c fungeert als een belangrijke controle, omdat gist cytochroom c is niet in staat te activeren caspasen 12.
Interessant, post-mitotische sympathische neuronen zijn opmerkelijk goed bestand tegen cytosolische cytochroom c (Fig. 1B) 8,13. Ons laboratorium heeft vastgesteld dat de endogene caspaseremmer XIAP is een belangrijke remmer van caspase activatie in neuronen 14. Dus, voor neuronen te sterven na cytochroom c injectie, moet XIAP zich eerst geïnactiveerd. Bijvoorbeeld, micro-injectie van cytochroom c in xiap - / - sympathische neuronen is voldoende om caspase activering en apoptose in deze cellen (Fig. 2) mogelijk te maken.
Figuur 1. Cytoplasmatische micro-injectie van cytochroom c induceert een snelle dood in fibroblasten, maar niet neuronen. A) Wild-type MEFs of (B) postnatale dag 5 wild-type sympathische neuronen werden gemicroinjecteerd met bovine cytochroom c (10 mg / ml) samen met rhodamine-dextran aan geïnjecteerde cellen te markeren. Beelden tonen hetzelfde veld van de cellen onmiddellijk na de injectie (0 uur), of op de aangegeven tijden. Pijlen geven geïnjecteerde cellen. Schaalbalk, 20 urn.
Figuur 2. XIAP-deficiënte neuronen zijn gevoelig voor cytoplasmatisch cytochroom c micro-injectie. Postnatale dag 5 sympathische neuronen van XIAP knock-out muizen werden gemicroinjecteerd met bovine cytochroom c (10 mg / ml) samen met rhodamine-dextran aan geïnjecteerde cellen te markeren. Beelden tonen hetzelfde veld van de cellen onmiddellijk na de injectie (0 uur), of vijf uur na het cytochroom c micro-injectie (5 uur). Schaalbalk, 20 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De micro-injectie van cytochroom c direct in het cytoplasma van cellen is een unieke en krachtige tool die het mogelijk maakt voor studies van de post-mitochondriale regulatie van apoptose. Belangrijk is dat deze techniek maakt het mogelijk om directe activatie van apoptose stroomafwaarts van mitochondria, zonder het gebruik van middelen die cellulaire of mitochondriale schade veroorzaken.
Hoewel dit protocol is gericht op micro-injectie van cytochroom c voor studies over apoptose, kan de algemene beginselen van proteïne micro-injectie hier getoond ook worden gebruikt voor andere eiwitten van belang. Zo hebben sommige onderzoekers gebruikt micro-injectie van antilichamen die specifieke eiwitten, zoals cytochroom c of c-Jun in studies van apoptose 13,15 doel.
De meest voorkomende problemen tijdens micro-injectie is het verstoppen van micro-injectie naalden tijdens de procedure. Als de naald verstopt raakt, kan men gebruik maken van de "schone" functie op de microinjector die een sterke druk puls stuurt door de naald te verdrijven deeltjes blokkeren van de naald opening. Vaak, het reinigen van de naald is voldoende om de naald ontstoppen. Echter, als kleurstof wordt gezien het verlaten van de naald tijdens een "clean", maar meteen weer stopt, geeft dit aan dat de werkdruk op de microinjector kan te laag zijn. In dit geval, verhoging van de werkdruk tot een continue stroom van de naald wordt weer gezien. Het reinigen van de naald niet altijd hersteld stroom, in welk geval de naald waarschijnlijk moet worden vervangen. Een techniek die gebruikt kan worden als een alternatief, vooral als de injectie materiaal zelf kostbaar is, gaat voorzichtig het breken van de top van de micro-injectie naald tegen de onderkant van de weefselkweek schotel. Indien zorgvuldig gebeurt, kan dit uitbreiden van de opening van de naald en zal herstellen stromen. Zal echter een grote scheur in de naald opening veroorzaken een enorme versie van de kleurstof in de cultuur schotel, het zicht op cellen.
Helaas zijn niet alle celtypen kunnen worden gemicroinjecteerd. Sommige cellen (bijv. cerebellaire granule neuronen) zijn te klein voor micro-injectie. Andere cellen (bijv. volwassen cardiomyocyten), terwijl groot genoeg is, kan niet tegen de injectie procedure en zelfs met de controle injecties sterven. Zoals hierboven beschreven, de micro-injectie van gist cytochroom c fungeert als een nuttige controle, omdat gist cytochroom c is niet in staat om caspases te activeren. Cellen gemicroinjecteerd met gist cytochroom c wordt niet geactiveerd apoptose, tenzij het is te wijten aan de micro-injectie procedure zelf. Ten slotte kunnen sommige cellen (bv. fibroblasten) tegen micro-injectie, maar kan moeilijk zijn om te injecteren vanwege hun platte morfologie. Als een gevolg daarvan is er een risico dat de micro-injectie naald tegen de onderkant van de weefselkweek schotel breken met elke cel die wordt geïnjecteerd.
Automatische of handmatige micromanipulators kan worden gebruikt voor proteïne micro-injectie, waarbij elk systeem heeft voor-en nadelen. Geautomatiseerde micromanipulators zijn handig, omdat er ook een z-as wordt vastgesteld waarop de micro-injectie naald automatisch wordt verlaagd voor het inspuiten van cellen in te stellen. Dit is vooral handig bij het injecteren cellen waarvan de hoogte is vergelijkbaar tussen een celcultuur monolaag. Echter, voor cellen die zijn gekweekt op gecoat gerechten (bv. neuronen plated op de collageen-gecoate gerechten), de drie-dimensionale karakter van deze culturen maakt het instellen van een specifieke z-as wordt vastgesteld saai. Voor deze culturen, handleiding micromanipulators zijn gunstig, omdat de naald kan snel worden aangepast aan de specifieke hoogte van elke cel.
Micro-injectie kan een moeilijke techniek onder de knie en zal de praktijk worden. Daarnaast is de techniek van micro-injectie heeft een aantal beperkingen. Bijvoorbeeld, kan slechts een klein deel van de cellen in een weefselkweek schotel worden geïnjecteerd. Zo, biochemische preparaten waarin de hele cultuur is verzameld (bijv. cellysaten voor Western Blot) niet een nauwkeurige weergave van de geïnjecteerde cellen alleen. In plaats daarvan, de meeste experimenten moeten worden voltooid op de single-cell niveau. Echter, zodra de basistechnieken hier gepresenteerde worden beheerst, kan men het uitvoeren van een unieke set van experimenten om hypotheses die niet beantwoord kunnen worden met behulp van andere methoden te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle experimentele procedures op dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de Universiteit van North Carolina.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie NS042197 aan MD. AJK werd ondersteund door subsidies T32GM008719 en F30NS068006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica Microsystems | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige International | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige International | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
References
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, 205-219 (2004).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).
- Hengartner, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 407, 770-776 (2000).
- Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem. J. 384, 201-232 (2004).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
- Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2. Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).
- Li, F. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release. J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).
- Deshmukh, M., Johnson, E. M. Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c. Neuron. 21, 695-705 (1998).
- Vaughn, A. E., Deshmukh, M. Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c. Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).
- Yang, J. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science. 275, 1129-1132 (1997).
- Gonzales, D. H., Neupert, W. Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes. J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).
- Ellerby, H. M. Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis - comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).
- Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis. J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).
- Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).
- Estus, S. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).
