이 프로토콜에서는, 우리는 시토크롬의 직접적인 세포질 microinjection을 설명<em> C</em섬유아 세포 및 기본 교감 신경으로> 단백질. 이 기술은 시토크롬의 도입을 허용<em> C</em세포 및 일일 시토크롬의 릴리스의 세포질에> 단백질<em> C</em> mitochondria에서, 이것은 apoptosis 동안 발생합니다.
Apoptosis 또는 프로그램된 세포 죽음은 세포가 1 죽게하는 보존과 높은 규제 경로입니다. 세포가 세포 독성 스트레스의 다양한 발생하는 경우 Apoptosis가 발생하실 수 있습니다. 이러한 모욕 궁극적으로 mitochondrial intermembrane 공간에서 세포질 2 시토크롬 C의 릴리스의 원인이 신호 폭포를 시작합니다. mitochondria에서 시토크롬 C의 릴리스는 caspases, 궁극적으로 3-4 세포 죽음을 실행할 핵심 세포 프로 테아제의 급속한 활성화를 유발하는 핵심 이벤트입니다.
apoptosis의 경로는 mitochondria 5 시토크롬 C 릴리스의 상류와 하류 지점에 규제입니다. caspase 활성화의 포스트 mitochondrial 규제를 공부하기 위해 많은 조사가 holocytochrome C (헴 연결된) 전지 6-9로 단백질의 직접적인 세포질 microinjection로 설정되어 있습니다. 시토크롬 C는 일반적으로 헴 그룹의 첨부 파일은 10-11 apoptosis 활성화하도록하는 데 필요한 어디 mitochondria에 언어입니다. 따라서 직접 caspases를 활성화하기 위해서는 cDNA 구조에서 시토크롬 C의 표현이 mitochondrial 타겟팅 및 헴 첨부집니다 동안 그것 cytosolic caspases에서 분리된 것입니다 때문에 holocytochrome C 단백질 대신 자사의 cDNA를 삽입하는 것이 필요합니다. 따라서 정화 헴 연결된 시토크롬 C 단백질의 직접 cytosolic microinjection은 셀룰러 및 mitochondrial 손상을 독성이 모욕을 사용하지 않고 mitochondrial 시토크롬 C 자료 및 apoptosis를 모방하는 유용한 도구입니다.
이 문서에서는, 우리는 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEFs)와 예에서 볼 수 있듯이 기본 교감 신경을 사용하여 세포로 시토크롬 C 단백질의 microinjection을위한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 apoptosis의 수사 시토크롬 C의 주입에 초점을 맞춘 반면, 여기에 나와있는 기술도 쉽게 관심을 다른 단백질의 microinjection에 대해 적용할 수 있습니다.
직접 세포의 세포질에 시토크롬 C의 microinjection은 apoptosis의 포스트 mitochondrial 규제 연구 수있는 독특하고 강력한 도구입니다. 중요한 것은,이 기술은 셀룰러 또는 mitochondrial 손상을 에이전트를 사용하지 않고 mitochondria의 apoptosis 하류의 직접적인 활성화를 위해 수 있습니다.
이 프로토콜은 apoptosis에 대한 연구 시토크롬 C의 microinjection에 초점을 맞춘 반면, 여기?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 MD에 NIH 부여 NS042197에 의해 지원되었다. AJK는 보조금 T32GM008719와 F30NS068006 지원했다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
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DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |