В этом протоколе описываются прямые цитоплазматические микроинъекции цитохрома<em> С</em> Белка в фибробласты и первичных симпатических нейронов. Эта техника позволяет введение цитохрома<em> С</em> Белков в цитоплазме клетки и имитирует выпуск цитохрома<em> С</em> Из митохондрий, которая происходит во время апоптоза.
Апоптоз, или запрограммированная смерть клетки, сохраняется и строго регулируется путь по которому клетки умирают 1. Апоптоз может быть вызван, когда клетки встречи широкий спектр цитотоксического напряжений. Эти оскорбления инициировать сигнальные каскады, которые в конечном итоге вызвать высвобождение цитохрома С из митохондриальных пространства межмембранного в цитоплазму 2. Освобождение цитохрома С из митохондрий является ключевым событием, которое вызывает быструю активацию каспаз, ключ сотовой протеазы, которые в конечном итоге выполнить гибели клеток 3-4.
Путь апоптоза регулируется в точках на входе и выходе системы цитохрома релиз с из митохондрий 5. С целью изучения пост-митохондриальной регуляции активации каспазы, многие исследователи обратились к прямым цитоплазматических микроинъекции holocytochrome с (гем-прилагается) белка в клетках 6-9. Цитохром с, как правило, локализованы в митохондриях, где крепление группы гема Необходимо включить его, чтобы активировать апоптоз 10-11. Поэтому, чтобы непосредственно активировать каспазы, необходимо вводить holocytochrome протеина С, а не его кДНК, потому что в то время как экспрессия цитохрома С из кДНК конструкций приведет к митохондриальной адресности и гема вложений, то это будет поглощенных от цитозольного каспазы. Таким образом, прямой цитозольного микроинъекции очищенной гема подключением белка цитохром с является полезным инструментом, чтобы имитировать митохондриальной цитохром-с-релиз и апоптоз без использования токсичных оскорбления, которые вызывают клеточного и митохондриального повреждения.
В этой статье мы опишем метод микроинъекции белка цитохрома С в клетках, используя мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) и первичных симпатических нейронов в качестве примеров. Хотя этот протокол фокусируется на введении цитохрома С для исследования апоптоза, методы показано здесь также может быть легко адаптирована для микроинъекции других белков, представляющих интерес.
Микроинъекции цитохром с непосредственно в цитоплазме клеток является уникальным и мощным инструментом, который позволяет для исследования после митохондриальной регуляции апоптоза. Важно отметить, что эта техника позволяет прямой активации апоптоза вниз по течению митохондр?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH грант NS042197 на MD. AJK была поддержана грантами T32GM008719 и F30NS068006.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |