Summary
Um modelo de camundongo experimental de metástase óssea foi estabelecido após a entrega intracardíaca da luciferase expressando células tumorais mamárias. Desenvolvimento do tumor e resultou lesão osteolítica foram monitorados longitudinalmente, com a bioluminescência e CT micro imagem.
Abstract
Entrega intracardíaca seguintes MDA-MB-231-luc-D3H2LN células para Nu / Nu camundongos, metástases sistêmicas desenvolveram nos animais injetados. Imagem de bioluminescência usando Spectrum IVIS foi empregado para monitorar a distribuição e desenvolvimento das células tumorais após o procedimento de entrega, incluindo a reconstrução DLIT para medir o sinal de tumor e sua localização.
Desenvolvimento de lesões metastáticas para os tecidos ósseos desencadeia a atividade osteolítica e lesões à tíbia e fêmur foram avaliados longitudinalmente usando micro CT. De imagem foi realizado utilizando um sistema de micro Quantum FX CT com imagens rápidas e dose de raios-X de baixa. A baixa dose de radiação permite múltiplas sessões de imagem a ser realizada com uma dosagem de raios-X cumulativo muito abaixo LD50. Um rato dispositivo de transporte de imagens foi usado para seqüencialmente imagem os ratos com ambos IVIS Spectrum e FX Quantum alcançar o posicionamento exato de animais em ambos os bioluminescência e imagens de TC. O óptico e define CT dados foram co-registradas em 3-dimentions usando a imagem viva 4,1 software. Esta abordagem multi-modo permite acompanhar de perto o crescimento do tumor e do desenvolvimento simultâneo com a atividade osteolítica.
Protocol
Imagem longitudinal é usada em estudos pré-clínicos para acompanhar o progresso de uma doença ou medir o efeito de uma terapêutica. Em oncologia, métodos ópticos fornecem ferramentas rigorosa para monitorar o crescimento do tumor e entregar quantificação precisa do crescimento celular ou a expressão de genes em cada momento em tal estudo. Alterações anatômicas pode ser medida utilizando uma técnica de alta resolução, como microCT, mas para imagens longitudinal uma dose de raios-X de baixa deve ser usado para evitar artefatos biológicos. Imagens ópticas e microCT pode ser co-registrados para fornecer uma combinação de dados anatômicos e funcionais garantir que o máximo de informação é extraída do modelo animal.
1. Preparação celular
- Caliper fornece uma gama de luciferase linhas expressando câncer de células para pesquisa pré-clínica em modelos de mouse.
- MDA-MB-231-luc-D2H2LN é uma linha de células mamárias humanas tumor expressando o gene da luciferase, que pode ser usado como um indicador óptico de tumorgenesis in vivo. Esta linhagem celular é criado a partir de uma metástase ganglionar espontânea que se originou a partir de um tumor mamário pad D3H1 gordura e é conhecido de forma agressiva formar metástases.
- As células são fornecidos como uma cultura isentos de agentes patogénicos congelados que prontamente cresce em mídia padrão sem a necessidade de marcadores de seleção.
- Para verificar a atividade luciferase antes da injeção no animal um frasco de 90% confluentes é colhido por tripsinização. Atividade de luciferase é medido por dispensar 50.000 células em uma placa de microtitulação e execução de diluição serial.
2. Intracardíaca injeção de células em animais
- Antes da injeção, os animais são anestesiados com isoflurano 3%.
- 1-3000000 células são injetadas no volume 50uL para o ventrículo esquerdo. Suspensão de células contém 150ug/ml D-Luciferina para validar a técnica de injecção.
- Para confirmar uma injeção de ratos correta intracardíacas são gravadas no sistema IVIS. Ratos que mostram sinal de BLI por todo o corpo ter sido injetado corretamente. Se o sinal está localizada as células não foram injetados corretamente no coração.
3. BLI imagem para monitorar metástases
- O shuttle imaging suporta o mouse para captura de dados em ambos os Spectrum IVIS eo QuantumFX sistema microCT.
- O ônibus ajuda a manter o animal na mesma posição para imagens e incorpora sinais fiducial para ajudar na automática co-registro. A câmara é ligada ao vaporizador isofluorance para manter a anestesia.
- Assistente de imagem no software Image Vivendo 4.1 pode ser usado para selecionar automaticamente o tempo de exposição, f-stop e binning e garantir a coleta de dados quantitativos.
- Várias imagens podem ser adquiridos e comparados em estudos longitudinais que cobrem segundos ou meses, dependendo da natureza do experimento.
- Dia pós-injeção de células 6, BLI imagem com IVIS Spectrum mostra metástases para o osso em sete dos nove camundongos.
4. Acompanhamento longitudinal de lesões osteolíticas usando micro CT
- Os ratos que mostraram metástases ósseas claro e visível usando BLI foram fotografadas no micro FX Quantum sistema de CT.
- O Quantum FX micro sistema de CT fornece imagens de alta qualidade a uma dose de raios-X de baixa o suficiente para permitir verdadeira longitudinal micro CT em estudos pré-clínicos.
- Degradação óssea em ambas as pernas podem ser monitorados longitudinalmente usando este sistema em menos de um minuto.
- Os ratos são anestesiados com isoflurano 3% e podem ser transferidos diretamente do sistema Spectrum IVIS.
- Duas imagens de 60 milímetros são costuradas juntas para capturar o ponto de vista animal inteiro.
- A FOV 30mm é ideal para imagens de joelho em alta resolução.
- A única digitalização com resolução alta o suficiente para medir e quantificar metástases ósseas leva apenas 18 segundos e oferece uma dose de apenas 13mGy.
- Camundongos foram fotografadas até 8 vezes em 36 dias com o sistema de CT micro, sem afetar o crescimento do tumor ou a saúde do animal.
- O micro tomografia computadorizada mostrou que leisions óssea foram visíveis no dia 10 e progrediu muito rapidamente, o que corresponde ao aumento do sinal de BLI.
5. 3D co-registro e análise de BLI e UCT
- Uma vez que as imagens foram capturadas em ambos o espectro IVIS e FX Quantum micro dados CT sistema pode ser co-registrados em uma reconstrução 3D.
- MicroCT imagens são exportadas como arquivos DICOM e carregado na ferramenta imagem viva modalidade 4,1 3D Multi.
- No Software imagem viva executar o programa DLIT a três dimensões reconstruir o sinal óptico.
- A ferramenta de referência no software é usado para co-registrar o sinal de BLI óptica para a imagem CT micro.
- Conjuntos de co-registrados os dados podem ser analisados quantitativamente para monitorar vários parâmetros durante a progressão da doença aqui estamos acompanhando o crescimento do tumor metastático juntamente com o desenvolvimento da lesão osteolítica no osso. </ Ol>
Discussion
Imagem de pequenos animais com microCT tem sido aplicada ao monitoramento lesões osteolíticas em condições patológicas, como o desenvolvimento do tumor (Cowey et al 2007;.. Labrinidis et al, 2009). Como imagem de bioluminescência de luciferase tumores marcada tem sido amplamente adotado pré-clínica, co-registro de imagens bioluminescência e microCT proporcionou uma melhor definição da localização anatômica dos sinais de bioluminescência (Kaijzel et al. 2007). Estudo anterior com um rótulo de linha de mama luciferase das células tumorais MDA-MB-231-luc-D3H2LN mostrou metástases para osso e desenvolvimento de lesões osteolíticas seguintes injeção intra-cardíaca (Jenkins et al 2005;. Minn et al, 2005). Neste estudo, exploramos um estudo longitudinal de metástases do tumor e atividade osteolítica com combinatória óptica e baixa dose de radiação de imagens microCT com o modelo de metástase sistêmica MDA-MB-231-luc-D3H2LN. Realizamos imagem seqüencial com IVIS Spectrum e FX Quantum microCT sistemas e bioluminescência alcançados e CT co-registro com a nossa imagem viva recentemente desenvolvido 4,1 software (Heng et al., 2010). Imagem de bioluminescência com IVIS fornece não-invasivo de detecção das células tumorais com alta sensibilidade, permitindo que os tumores para ser detectado em fase inicial. Imagem com Quantum FX permite a reconstrução 3D preciso das lesões ósseas e informações anatômicas detalhadas. Quantum FX sistema oferece imagem baixa dose de radiação, que permite o monitoramento longitudinal da progressão da doença. Correlação de lesões ósseas e metástases tumorais foi representado na imagem co-registrados, ea vantagem de rastreamento multimodalidade de desenvolvimento da lesão longitudinal foi claramente demonstrado.
Disclosures
Os autores são funcionários da Caliper Life Sciences que fazem o instrumento apresentado neste artigo.
References
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