Summary
Een methode van gen-overdracht voor de behandeling van ischemisch hartfalen wordt beschreven met behulp van een varkens-model van een myocardinfarct. Onze eenvoudige en reproduceerbare methode stelt ons in staat om de effectiviteit van verschillende gen-overdracht gemakkelijk te evalueren met een zeer eenvoudige en reproduceerbare manier.
Abstract
Diverse nieuwe technologieën worden ontwikkeld voor patiënten met hartfalen. Gevestigde preklinische evaluaties zijn nodig om hun werkzaamheid en veiligheid vast te stellen.
Gentherapie met behulp van virale vectoren is een van de meest veelbelovende benaderingen voor de behandeling van hartziekten. Virale levering van verschillende genen door het veranderen van de vervoerder-gen heeft onmetelijke therapeutisch potentieel.
In deze video, is het volledige proces van een diermodel van hartfalen creatie, gevolgd door overdracht van genen gepresenteerd met behulp van een varkens-model. Eerst wordt myocardinfarct gecreëerd door occlusie van de proximale left anterior descending kransslagader. Hart remodeling resulteert in chronisch hartfalen. Uniek aan ons model is een vrij groot litteken dat werkelijk weerspiegelt patiënten met ernstig hartfalen die behoefte hebben aan agressieve therapie voor positieve resultaten. Na het myocard infarct oprichting en ontwikkeling van littekenweefsel, is een intracoronaire injectie van het virus aangetoond met simultane nitroglycerine infusie. Onze injectie methode biedt een eenvoudige en efficiënte genoverdracht met verbeterde genexpressie. Deze combinatie van een hartinfarct varkens model met een intracoronaire virus levering heeft bewezen een consistente en reproduceerbare methode, die helpt niet alleen om te testen het effect van individuele genen, maar ook vergelijken met de werkzaamheid van vele genen als therapeutische kandidaten.
Protocol
1. Myocardinfarct creatie
- Vrouwelijke Yorkshire varkens (20 kg) van Animal Biotech Industries (Doylestown, PA) zijn pre-medicatie met behulp van Telazol (tiletamine / zolazepam) (8,0 mg / kg) en Buprenorfine (0,6 mg).
- Dieren zijn geïntubeerd en vervolgens geventileerd met 100% zuurstof. Algemene anesthesie wordt onderhouden met Propofol (5-8mg/kg/hr) tijdens de gehele procedure.
- De femorale site is bereid met 70% isopropyl alcohol, gevolgd door povidon jodium. Een percutane punctie biedt toegang tot de slagader en de schede plaatsing. Na de schede inbrengen, is 3000-5000 IE heparine toegediend IV om een geactiveerde stollingstijd van 250-300 seconden te handhaven.
- Een bolus dosis amiodaron (75 mg) wordt intramusculair toegediend. Intraveneuze injectie van een 1000 ml zoutoplossing zak met amiodaron (75 mg), Atropine (2 mg), en kaliumacetaat (20 mEq) is gestart en onderhouden met een snelheid van 150 ml / uur gedurende de procedure.
- Een 7 Fr hockey-stick katheter (Cordis, Miami, FL) is gevorderd dat de linker kransslagader en een coronaire angiografie wordt uitgevoerd. Een 0.014-inch voerdraad (Abbott, Park, IL) is gevorderd in de linker anterior dalende kransslagader (LAD). Een 8-mm-lang, 4,0-mm VOYAGER over-the-wire ballon (Abbott, Park, IL) is geavanceerd en gepositioneerd op de proximale LAD, en de coronaire ballon wordt opgeblazen tot 3 atm. Occlusie van de LAD wordt bevestigd door angiogram.
- Met de continue electrocardiogram en hemodynamische monitoring, wordt de occlusie gedurende 90 minuten. Kwaadaardige ventriculaire aritmieën kan soms optreden binnen de eerste 40 minuten, in welk geval onmiddellijke levering van gelijkstroom schokken van 200 J tot 300 J worden toegediend. Meestal zijn er twee piek termijnen van aritmie, een tussen de 2 en 10 minuten en de andere tussen de 25 en 35 minuten na de ballon inflatie. Diligent monitoring en onmiddellijke defibrillatie zijn de sleutel tot de succesvolle hartinfarct maken, want er zijn meer dan 95% incidentie van het invoeren van ventriculaire fibrillatie binnen de termijnen aangegeven. Als de onmiddellijke en juiste defibrillatie wordt uitgevoerd, overleven is zeer hoog. Als de bloeddruk daalt onder 80 mm Hg, is het volume belasting bereikt met snelle intraveneuze infusie zoutoplossing.
- De ballon is leeggelopen en alle apparaten worden verwijderd.
- De schede is verwijderd uit de femorale slagader, is anesthesie ingehouden, en het dier wordt bewaakt tijdens het herstel. Intraveneuze zoutoplossing met Amiodaron, atropine en kaliumacetaat infusie is gedaald op 50 ml / uur en is 's nachts gegeven. Een intramusculaire injecties van Nitroglycerline en Furoscemide wordt toegediend. Dan het dier is toegestaan om te herstellen en zorgvuldige ECG monitoring is nog minstens 3 uur.
- Aspirine (200 mg) PO zal worden gegeven voor vijf dagen.
Voorkomende complicaties tijdens en na het hartinfarct creatie procedure zijn coronaire dissectie, prikplaats hematoom, aritmie en hartfalen. Een techniek te verfijnen en grondige controle is vereist ter voorkoming en beheersing van deze complicaties.
2. Virusinjectie
- De dieren zijn bereid zoals hierboven in het hartinfarct creatie steps1-3 is aangegeven. Dezelfde dosis van heparine moet worden gegeven aan trombose te voorkomen tijdens het virus injectie.
- Een 5Fr hockeystick katheter (Cordis, Miami, FL) is gevorderd dat de linker kransslagader. Na het angiogram, twee van 0,014 inch geleidingsdraden zijn geavanceerde, een in de LAD en een in de linker circumflex kransslagader (LCX) om de positie van de katheter op te lossen.
- Arteriële bloed (-20 ml) is afkomstig uit de katheter. Om te voorkomen dat de ischemie tijdens de infusie, is half verdund bloed wordt gebruikt voor oplossing. Het virus wordt gemengd met 10 ml bloed en verdund tot 20 ml met een zoutoplossing. De overige 10 ml is ook verdund tot 20 ml en gebruikt te leveren resterende virus binnen de katheter lumen.
- Intraveneus nitroglycerine (20 ug / min) is gestart via het oor ader.
- De katheter tip is geplaatst op de proximale linker main-darmkanaal. De druk door de katheter wordt gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de catheter niet is vast komen te zitten.
- Het virus gemengd bloed (15 ml) wordt ingespoten door de katheter gedurende 15 minuten met behulp van een infusiepomp in de linker kransslagader. Na 15 minuten, is de spuit uitgewisseld om de flush, en infusie wordt voortgezet gedurende 10 minuten.
- Een draad en een katheter zijn vast naar rechts kransslagader op dezelfde manier als linker kransslagader.
- De overige 5 ml bloed vermengd met virus wordt geïnjecteerd in de juiste kransslagader gedurende 5 minuten gevolgd door 10 minuten spoelen.
3. Vertegenwoordiger van de zaak
Figuur 1 toont de linker ventriculografie op 1 maand na het myocard infarct schepping. De linker ventrikel wandbeweging is significant slechter dan bij een ejectiefractie (EF) van31%. Figuur 2 toont de doorsnede van de linker ventrikel op 1 maand. Een groot litteken van de basis naar de top van de voorste muur wordt gezien. De gemiddelde EF op 1 maand na een myocardinfarct in dit model is 36% en de gemiddelde eind diastolische volume is 83 ml, terwijl het gemiddelde van die in de dezelfde grootte dier zonder een hartinfarct is 68% en 42 ml. Figuur 3 toont de expressie van beta-gal in de linker ventriculaire grens zone gebied een maand na de injectie van adeno-geassocieerd virus (2 x 10 12 DNAse Degelijke deeltjes van rAAV1 CMV Lac-Z). Een verbeterde expressie werd gevonden in het virus geïnjecteerde gebied.
Figuur 1. Ejectiefractie gemeten van links ventriculografie 1 maand na myocard infarct schepping. Linker ventrikel is verwijd tot 92,5 ml en de voorste wand beweging is aanzienlijk verminderd.
Figuur 2. De doorsnede van de linker ventrikel op 1 maand na hartinfarct maken, gekleurd door trifenyltetrazoliumchloride om het litteken gebied af te bakenen. Een groot litteken van de basis naar de top van de voorste muur wordt gezien.
Figuur 3. Beta-gal expressie geïnduceerd door adeno-geassocieerd virus (2 x 10 12 DNAse resistent deeltjes van rAAV1 CMV Lac-Z). Een verhoogde expressie is te vinden op de grens zone gebied tussen het infarct en de normale weefsels, 1 maand na de intracoronaire virus injectie. Rechts onder foto toont de negatieve controle, waar alleen een fysiologische zoutoplossing werd geïnjecteerd in de kransslagaders met hetzelfde protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onder de verschillende oorzaken van hartfalen, ischemie is veruit de meest voorkomende in de etiologie. Om dit ernstige ziekte, zijn verschillende therapeutische benaderingen ontwikkeld. Een zorgvuldige evaluatie van therapieën nodig zijn voordat deze veelbelovende therapieën kunnen worden toegepast op de klinieken. Daarom is vestiging van een ischemisch hartfalen model dat de klinische toestand van patiënten vertegenwoordigt, is cruciaal voor de ontwikkeling van therapieën voor hartfalen. Onze varkens myocard infarct model voldoet aan deze eisen translationeel.
Voor het induceren van hartfalen door het creëren van een hartinfarct, het infarct gebied moet worden groot. Ons model heeft een groter litteken ten opzichte van de eerdere onderzoeken, die ook een endovasculaire myocard infarct model 1. We hebben ontdekt dat het toedienen van Amiodaron en onderhouden van de bloeddruk van meer dan 80 mmHg tijdens de coronaire occlusie is essentieel voor zowel de overleving en het infarct gebied te verhogen. Terwijl Isofluraan is een effectieve verdoving voor deze procedure 1-2, vonden we dat met propofol, een hogere bloeddruk kan worden gehandhaafd. Daarnaast is isofluraan gemeld aan meer cardio-beschermende effecten in vergelijking met Propofol 3 hebben, en dit kan leiden tot een verminderde omvang van het infarct.
Cardiale gentherapie is nu een van de meest veelbelovende benaderingen van hartfalen, en er zijn verschillende strategieën om de genoverdracht. Boven alles, intracoronaire injectie van virale vectoren die een gen, is een eenvoudige en minder invasieve techniek. Diverse pogingen zijn gedaan om genexpressie te verhogen. Ons laboratorium heeft uitgewezen dat infusie van nitroglycerine tijdens het virus injecteren van de gen-expressie (I. Karakikes, ongepubliceerd) toeneemt.
Gen-overdracht van SERCA2a met behulp van adeno-geassocieerde virale vector heeft geresulteerd in positieve resultaten bij de mens 4. Verdere verbetering van cardiale gentherapie wordt verwacht dat met extra carrier genen als vector verfijningen. Ons leveringsprogramma methode biedt een eenvoudige en efficiënte genoverdracht met verbeterde genexpressie, en kan gemakkelijk worden vertaald in de kliniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben geen commerciële verenigingen die net zo een belangenconflict vormen in verband met het manuscript.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door Stichting Leducq via het Caerus netwerk (RJH), door NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156, en P20HL100396 (RJH). DL werd gesteund door de Duitse Research Foundation. We willen graag Lauren Leonardson bedanken voor haar technische bijstand op dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
