Summary
Un método de transferencia génica para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca isquémica se describe usando un modelo porcino de infarto de miocardio. Nuestro método simple y reproducible que nos permite evaluar fácilmente la eficacia de la transferencia de genes diferentes con una forma muy sencilla y reproducible.
Abstract
Varias tecnologías emergentes se están desarrollando para los pacientes con insuficiencia cardíaca. Bien establecidas las evaluaciones preclínicas son necesarios para determinar su eficacia y seguridad.
La terapia génica con vectores virales es uno de los enfoques más prometedores para el tratamiento de las enfermedades cardíacas. Entrega viral de varios genes diferentes, cambiando el portador del gen tiene un potencial terapéutico incalculable.
En este video, el proceso completo de un modelo animal de la creación de la insuficiencia cardíaca seguida de la transferencia de genes se presenta con un modelo porcino. En primer lugar, el infarto de miocardio es creado por la oclusión de la descendente anterior izquierda proximal arterias coronarias. Resultados corazón de remodelación en la insuficiencia cardíaca crónica. Único en nuestro modelo es una cicatriz bastante grande que refleje verdaderamente los pacientes con insuficiencia cardíaca grave que requieren una terapia agresiva para lograr resultados positivos. Después de la creación de miocardio infarto y el desarrollo de tejido cicatricial, una inyección intracoronaria de virus se demuestra con la infusión de nitroglicerina simultánea. Nuestro método de inyección proporciona una transferencia de gen simple y eficiente con una mayor expresión de los genes. Esta combinación de un infarto de miocardio modelo de cerdos con el virus de la entrega intracoronaria ha demostrado ser una metodología consistente y reproducible, lo que ayuda no sólo para probar el efecto de los genes individuales, sino también comparar la eficacia de muchos genes como candidatos terapéuticos.
Protocol
1. La creación de infarto de miocardio
- Mujer cerdos Yorkshire (20 kg) de animales industrias de biotecnología (Doylestown, Pensilvania) se pre-medicado con Telazol (tiletamina / zolazepam) (8,0 mg / kg) y buprenorfina (0,6 mg).
- Los animales son intubados y ventilados con oxígeno al 100%. La anestesia general se mantiene con Propofol (5-8mg/kg/hr) durante todo el procedimiento.
- El sitio femoral se prepara con 70% de alcohol isopropílico seguido de povidona yodada. La punción percutánea permite el acceso a la arteria y la colocación de la vaina. Después de la inserción de la vaina, 3000-5000 UI de heparina se administra IV para mantener un tiempo de coagulación activado de 250-300 segundos.
- Un bolo de amiodarona (75 mg) se administra por vía intramuscular. La inyección intravenosa de una bolsa de 1000 ml de solución salina con amiodarona (75 mg), atropina (2 mg) y acetato de potasio (20 mEq) se inicia y se mantiene con una tasa de 150 ml / h durante todo el procedimiento.
- A 7 P. palo de hockey catéter (Cordis, Miami, FL) se avanza a la arteria coronaria izquierda y una angiografía coronaria se realiza. Una guía de 0,014 pulgadas (Abbott, Park, IL) se introduce en la arteria descendente anterior coronaria (LAD). Un niño de 8 mm de largo, 4.0 mm VOYAGER sobre el alambre-balón (Abbott, Park, IL) se avanza y se ubica en la DA proximal, y el globo se infla para coronaria 3 atm. La oclusión de la DA es confirmada por angiografía.
- Con electrocardiograma continuo y el control hemodinámico, la oclusión se mantiene durante 90 minutos. Arritmias ventriculares malignas en ocasiones puede ocurrir dentro de los primeros 40 minutos, en cuyo caso la entrega inmediata de los impactos directos de corriente de 200 J a 300 J se administran. Por lo general, hay dos marcos de tiempo máximo de arritmia, entre un 2 y 10 minutos y el otro entre 25 y 35 minutos después del inflado del balón. Observación minuciosa y la desfibrilación inmediata son la clave para la creación de infarto de miocardio con éxito, ya que hay más de un 95% de incidencia de entrar en la fibrilación ventricular dentro de los plazos indicados. Si la desfibrilación inmediata y adecuada se lleva a cabo, la tasa de supervivencia es muy alta. Si la presión arterial cae por debajo de 80 mmHg, el volumen de carga se realiza con una rápida infusión de solución salina por vía intravenosa.
- El globo se desinfla y todos los dispositivos se eliminan.
- La remoción de la vaina de la arteria femoral, la anestesia es retenido, y el animal se controla durante la recuperación. Solución salina por vía intravenosa con amiodarona, atropina y la infusión de acetato de potasio, se reduce a 50 ml / hr y se da durante la noche. Una inyección intramuscular de Nitroglycerline y Furoscemide se administra. Entonces el animal se le permite recuperar y cuidado de la monitorización del ECG se mantiene durante al menos 3 horas.
- La aspirina (200 mg) PO se administra durante cinco días.
Las complicaciones más frecuentes durante y después del procedimiento de infarto de miocardio son la creación de disección coronaria, hematoma sitio de la punción, arritmia e insuficiencia cardiaca. A perfeccionar la técnica y la supervisión minuciosa es necesaria para prevenir y tratar estas complicaciones.
2. Virus de la inyección
- Los animales se preparan como se indica en la creación de miocardio infarto steps1-3. La misma dosis de heparina se debe dar para prevenir la trombosis durante la inyección del virus.
- Un catéter 5Fr palo de hockey (Cordis, Miami, FL) se avanza a la arteria coronaria izquierda. Después de la angiografía, dos de los cables de guía de 0,014 pulgadas están avanzadas, una en la LAD y uno en la arteria coronaria circunfleja (LCX) para fijar la posición del catéter.
- Sangre arterial (-20 ml) se extrae de la sonda. Para evitar la isquemia durante la infusión, la mitad de la sangre diluida se utiliza para la solución. El virus se mezcla con la sangre de 10 ml y se diluyó a 20 ml de solución salina. Los restantes 10 ml también se diluye a 20 ml y se utiliza entregar virus residual en la luz del catéter.
- Nitroglicerina por vía intravenosa (20 mg / min) se inicia a través de la vena de la oreja.
- La punta del catéter se coloca en la porción proximal de las vías principales a la izquierda. La presión a través del catéter se controla para asegurar que el catéter no se acuña.
- La sangre del virus mixtos (15 ml) se inyecta a través del catéter de más de 15 minutos usando una bomba de infusión en la arteria coronaria izquierda. Después de 15 minutos, la jeringa se cambia a color, y la infusión se continuó durante 10 minutos.
- Un alambre y un catéter se fija a la arteria coronaria derecha del mismo modo que la arteria coronaria izquierda.
- El restante 5 ml de sangre mezclada con el virus se inyecta en la arteria coronaria derecha durante 5 minutos seguido de 10 minutos de descarga.
3. Representante de casos
La figura 1 muestra la ventriculografía izquierda en un mes después de la creación del infarto de miocardio. El movimiento de la pared ventricular izquierda es significativamente afectada con una fracción de eyección (FE) de laEl 31%. La figura 2 muestra las secciones transversales del ventrículo izquierdo en un mes. Una gran cicatriz desde la base hasta el vértice de la pared anterior se ve. El EF promedio de 1 mes después de infarto de miocardio en este modelo es del 36% y el volumen diastólico final promedio es de 83 ml, mientras que el promedio de las de los animales del mismo tamaño, sin un infarto de miocardio es del 68% y 42 ml, respectivamente. La Figura 3 muestra la expresión de beta-gal en el área de la zona del ventrículo izquierdo borde de 1 mes después de la inyección de virus adeno-asociado (2 x 10 12 partículas de DNAsa Resistente rAAV1 CMV Lac-Z). Una mayor expresión se encuentra en la zona de la inyección del virus.
Fracción de la figura 1. Eyección de ventriculografía izquierda un mes después de la creación de miocardio infarto. Ventrículo izquierdo se dilata a 92,5 ml y movimiento de la pared anterior se ve afectada de manera significativa.
Figura 2. Las secciones transversales del ventrículo izquierdo, 1 mes después del infarto de miocardio creación, manchado por el cloruro de trifenil tetrazolio para delinear la zona de la cicatriz. Una gran cicatriz desde la base hasta el vértice de la pared anterior se ve.
Figura 3. Beta-gal expresión inducida por virus adeno-asociado (2 x 10 12 partículas DNAsa resistentes de rAAV1 CMV Lac-Z). Una mayor expresión se encuentra en el área de la zona fronteriza entre el infarto y el tejido normal, un mes después de la inyección intracoronaria de virus. Imagen inferior derecha muestra el control negativo, donde se inyectó una solución salina normal sólo en las arterias coronarias con el mismo protocolo.
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Discussion
Entre las diversas causas de la insuficiencia cardíaca, isquemia es por mucho el más frecuente en la etiología. Para superar esta grave enfermedad, diversos enfoques terapéuticos se están desarrollando. Cuidadosas evaluaciones de los tratamientos se requieren antes de que estas terapias prometedoras se puede aplicar a las clínicas. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo de insuficiencia cardíaca isquémica, que representa las condiciones clínicas de los pacientes es fundamental para el desarrollo de las terapias de insuficiencia cardíaca. Nuestro modelo de infarto de miocardio porcino cumple con los requisitos de traducción.
Para inducir insuficiencia cardíaca mediante la creación de un infarto de miocardio, el área de infarto tiene que ser grande. Nuestro modelo tiene una cicatriz grande en comparación con los estudios anteriores, que también se utiliza un modelo de infarto de miocardio endovascular 1. Hemos encontrado que la administración de amiodarona y el mantenimiento de la presión arterial de más de 80 mmHg durante la oclusión coronaria es esencial para aumentar tanto la tasa de supervivencia y de la zona infartada. Mientras que el isoflurano es un anestésico eficaz para este procedimiento 1.2, encontramos que con propofol, una mayor presión sanguínea puede ser mantenido. Además, isoflurano se informó que más de cardio-protección frente a los efectos de propofol 3, y esto podría conducir a una disminución del tamaño del infarto.
La terapia génica cardíaco es uno de los enfoques más prometedores para las fallas del corazón, y hay variedad de estrategias para la transferencia del gen. Por encima de todo, la inyección intracoronaria de vectores virales portadores de un gen, es una técnica sencilla y menos invasiva. Varios intentos se hacen para aumentar la expresión génica. Nuestro laboratorio ha encontrado que la infusión de nitroglicerina durante la inyección del virus aumenta la expresión génica (I. Karakikes, inédito).
La transferencia de genes de SERCA2a con adeno-asociado vector viral se ha traducido en resultados positivos en humanos 4. Nuevas mejoras en la terapia de genes cardiacos se espera que con los genes de transporte adicionales, así como mejoras vector. Nuestro método de entrega proporciona una transferencia de gen simple y eficiente con una mayor expresión de los genes, y puede ser fácilmente traducido a la clínica.
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Disclosures
Todos los autores no tienen asociaciones comerciales que pudieran representar un conflicto de intereses en relación con el manuscrito.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por la Fundación Leducq través de la red Caerus (RJH), por el NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 y P20HL100396 (RJH). DL recibió el apoyo de la Fundación Alemana de Investigación. Nos gustaría dar las gracias a Lauren Leonardson por su asistencia técnica en este proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
