Summary
यह एक सरल बैक्टीरियल आसंजन बैक्टीरियल कॉलोनी कि संवर्धित कोशिकाओं पर पालन कर रहे हैं इकाइयों के गठन की संख्या की गिनती में शामिल परख प्रोटोकॉल है. परख मजबूत है, adhesin के स्वतंत्र अध्ययन, और कई बदलाव ज्यादातर प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है बैक्टीरियल रोगजनन पर काम कर रहे है.
Abstract
संक्रमण पैदा करने के लिए, बैक्टीरिया अपने मेजबान उपनिवेश स्थापित करना चाहिए. बैक्टीरियल रोगज़नक़ों विभिन्न अणुओं या लगाव को बढ़ावा देने के लिए मेजबान 1 कोशिकाओं में सक्षम संरचनाओं व्यक्त करते हैं . इन adhesins मेजबान कोशिका की सतह रिसेप्टर्स या घुलनशील प्रोटीन बैक्टीरिया और मेजबान के बीच एक पुल के रूप में अभिनय के साथ बातचीत पर भरोसा करते हैं. आसंजन एक महत्वपूर्ण पहला आक्रमण और / या विषाक्त पदार्थों के स्राव के लिए पहले कदम है, इस प्रकार यह एक महत्वपूर्ण घटना है बैक्टीरियल रोगजनन में अध्ययन किया जा है. इसके अलावा, पालन बैक्टीरिया अक्सर exquisitely ठीक tuned सेलुलर प्रतिक्रियाओं, अध्ययन जिसमें से सेलुलर सूक्ष्म जीव विज्ञान '2 के क्षेत्र को जन्म दिया है प्रेरित . बैक्टीरियल आसंजन और मेजबान कोशिकाओं पर उनके आक्रमण के लिए मजबूत assays इसलिए बैक्टीरियल रोगजनन अध्ययनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और लंबे समय से कई अग्रणी 3,4 प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है. ये assays अब सबसे बैक्टीरियल रोगजनन पर काम प्रयोगशालाओं द्वारा अभ्यास कर रहे हैं.
यहाँ, हम एक मानक पालन एक विशिष्ट adhesin के योगदान illustrating परख का वर्णन करता है. हम Escherichia कोलाई तनाव 5 +२,७८७, एक मानव रोगजनक autotransporter विसरित पालन (AIDA) में शामिल Adhesin व्यक्त तनाव का उपयोग करें. किसी नियंत्रण के रूप में, हम एक उत्परिवर्ती तनाव का उपयोग AIDA जीन, 2787Δ Aida (एफ Berthiaume और एम. Mourez, अप्रकाशित) और ई. के एक वाणिज्यिक प्रयोगशाला तनाव की कमी कोलाई, C600 (न्यू इंग्लैंड Biolabs). बैक्टीरिया आमतौर पर इस्तेमाल किया Hep दो मानव उपकला कोशिका लाइन से कोशिकाओं का पालन करने के लिए छोड़ दिया जाता है. इस परख कम बड़े पैमाने पर 6 से पहले वर्णित किया गया है.
Protocol
1. प्रारंभिक: जीवाणु उपभेदों और उपकला कोशिकाओं.
कोशिकाओं और जीवाणुओं की जोड़तोड़ aseptically एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत, प्रदर्शन कर रहे हैं.
- हौसले ई. अलग कोलाई 2787 उपभेदों, 2787Δ AIDA C600 ग्लिसरॉल शेयरों से Lysogeny (पौंड) शोरबा अगर प्लेट (1% tryptone, 0.5% सोडियम क्लोराइड, 0.5% खमीर निकालने, 1.5% अगर) पर और 37 से बढ़ने की डिग्री सेल्सियस परख में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, यह हमेशा हौसले से मढ़वाया उपभेदों का उपयोग करें और से 4 डिग्री सेल्सियस सील पेट्री प्लेटों पर सप्ताह की एक जोड़ी के एक अधिकतम के लिए ही उपभेदों रखने की सलाह दी है.
- संस्कृति उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में Hep-2 कोशिकाओं (ATCC सीसीएल-23) 10% गर्मी निष्क्रिय गोजातीय सीरम (गर्मी निष्क्रियता 56 ° 30 मिनट के लिए सी में किया जाता है) के साथ पूरक है. दिनचर्या संस्कृति के दौरान हम भी 10 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन और 10 स्ट्रेप्टोमाइसिन / μg मिलीलीटर जोड़ने.
- 37 में Hep 2-कोशिकाओं को विकसित ° सी युक्त 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ एक सेल इनक्यूबेटर में . मानक सेल संस्कृति प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं है, जो 75 सेमी 2 बोतल और subcultured हर बार वे संगम तक पहुँचने में बड़े हो रहे हैं को बनाए रखने के लिए. हम हमारे संवर्धित कोशिकाओं का उपयोग, जब तक वे 30 से 40 अंश तक पहुँचने और फिर उन्हें त्यागने.
- एक परख तैयार जब एक 75 सेमी 2 फ्लास्क में Hep-2 कक्षों लगभग संगम तक पहुंच रहे हैं और इसलिए एक पालन परख के लिए तैयार हैं .
2. दिन 1: inoculum और उपकला कोशिकाओं की तैयारी
- कुप्पी में Hep 2-कोशिकाओं को एक बार धो के साथ गर्म है Dulbecco फॉस्फेट खारा buffered (DPBS: 8 / छ एल NaCl, 0.2 ग्राम / एल KCl, 0.2 छ / एल 2 के.एच. पीओ 4, 0.21 छ / एल 2 ना HPO 4: 7 2 हे)
- EDTA ताजा गर्म पूरा मध्यम जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए कोशिकाओं 0.05% trypsin के साथ incubated हैं. ताजा माध्यम के बाद जोड़ा जाता है, कोशिकाओं ऊपर और नीचे pipetting द्वारा resuspended हैं.
- 5 मिनट के लिए 2,000 rpm पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र और DPBS में छर्रों resuspend और फिर अपकेंद्रित्र.
- ताजा 10% के सीरम के साथ पूरक है, लेकिन 2x10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में कोई एंटीबायोटिक दवाओं, जिसमें मध्यम में कोशिकाओं Resuspend.
- बीज 24 अच्छी तरह से एक थाली के केंद्र में डुप्लिकेट कुओं (प्रत्येक तनाव के लिए) के तीन सेटों में एक सेल निलंबन की मिली लीटर और एक सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में रातोंरात थाली सेते हैं.
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि सीरम अच्छी तरह से और decomplemented हो सकता है कि एंटीबायोटिक दवाओं के इस स्तर के बाद छोड़े गए हैं. ऐसा करने में विफलता संक्रमण बैक्टीरिया मार सकता है. - लेग शोरबा 5 मिलीलीटर (1% tryptone, 0.5% सोडियम क्लोराइड, 0.5% खमीर निकालने) में प्रत्येक बैक्टीरियल तनाव के अलग कॉलोनी (२७८७, AIDA 2787Δ और C600) का टीका लगाना और 37 पर रात में बढ़ने ° सी जोरदार झटकों के साथ ( 180 आरपीएम ).
3. 2 दिवस: कोशिकाओं के संक्रमण
- पता लगाना है कि वे कम से कम 90% मिला हुआ है और दूषित नहीं कर रहे हैं एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत Hep-2 कोशिकाओं का निरीक्षण किया.
- गर्म DPBS एक अच्छी तरह से और के साथ कोशिकाओं को धोया, ताजा माध्यम के 10% के सीरम के साथ पूरक एक मिलीलीटर जोड़ सकते हैं लेकिन कोई एंटीबायोटिक दवाओं से युक्त. इसके अलावा, कोशिकाओं के बिना तीन कुओं ताजा मध्यम जोड़ें. यह प्रत्येक तनाव के लिए inoculum में बैक्टीरिया की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- बैक्टीरियल संस्कृतियों के 600 एनएम (आयुध डिपो .600 एनएम) ऑप्टिकल घनत्व उपाय. डुप्लिकेट Hep दो कोशिकाओं से युक्त कुओं का एक सेट और एक युक्त नहीं ही कोशिकाओं को प्रत्येक जीवाणु संस्कृति का एक विभाज्य जोड़ें. आमतौर पर, हम रातोंरात संस्कृति का एक 10 6 कॉलोनी बनाने इकाइयों (cfu) के लिए इसी मात्रा का उपयोग करें . (: कोशिकाओं बैक्टीरिया) इस संक्रमण के 05:01 के (MOI) बहुलता का प्रतिनिधित्व करता है. हालांकि हम सीधे हमारे रातोंरात संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए, यह कभी कभी उचित है बैक्टीरिया अपकेंद्रित्र और उन्हें DPBS में resuspend secreted रातोंरात संस्कृतियों में मौजूद अणुओं के हानिकारक प्रभावों से बचने के (जैसे cytotoxins के रूप में, उदाहरण के लिए)
नोट: MOI 100:1 और 1:10 के बीच भिन्न हो सकते हैं . उच्च MOI उच्च परिवर्तनशीलता और पृष्ठभूमि पैदावार और बैक्टीरिया प्लेट के प्लास्टिक के लिए छड़ी करते हैं जाएगा. MOI लोअर भी उच्च परिवर्तनशीलता पैदावार. एक बार एक MOI चुना है, यह जरूरी है के अनुरूप होना चाहिए और MOI इस रखने. - 37 पर 3 घंटे के लिए सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में संक्रमित कोशिकाओं को सेते हैं 5% के साथ डिग्री सेल्सियस सीओ 2.
नोट: संक्षेप में कम गति पर थाली (जैसे 1-2 मिनट के लिए 1,000 XG) अपकेंद्रित्र, सभी बैक्टीरिया कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क में लाने के क्रम में यह भी संभव है. यह संक्रमण तुल्यकालन का जोड़ा लाभ है, और कम ऊष्मायन बार (के रूप में छोटा रूप में 15-30 मिनट) की अनुमति है. - संक्रमित कोशिकाओं और कोशिकाओं को गर्म DPBS के साथ 3 बार धोने से मध्यम निकालें. इस चरण में, पक्षपाती जीवाणु आमतौर पर एक मानक खुर्दबीन के साथ देखा जा सकता है और हम नियमित रूप से इस चेक प्रदर्शन.
- कोशिकाओं lyse और पालन बीएसी अलगteria, ट्राइटन X-100 प्रत्येक के लिए 1% की 100 μl जोड़ने ही कोशिकाओं से युक्त. अन्य डिटर्जेंट (जैसे उदाहरण के लिए saponin के रूप में) इस्तेमाल किया जा सकता है.
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और तब लेग माध्यम के 900 μl जोड़ने.
- धीरे ऊपर और नीचे दोहराया pipetting द्वारा निलंबन homogenize. inoculum युक्त कोशिकाओं के बिना कुओं इसी तरह धीरे homogenized हैं.
नोट: कुछ बैक्टीरिया भी डिटर्जेंट के प्रति संवेदनशील हो सकता है, उस मामले में हो सकता है हम उपकला कोशिकाओं ऊष्मायन द्वारा 0.05% trypsin के साथ अलग - 37 EDTA 20 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस पालन बैक्टीरिया के साथ मिलकर कोशिकाओं को भी एक विंदुक टिप के साथ कुओं से scraped जा सकता है. - पालन बैक्टीरिया और inoculum अगर लेग पर 3 dilutions (आमतौर पर 1:10,000 1:1,000, और 1:100,000 dilutions) से लेग शोरबा और प्लेट μl 100 का उपयोग कर के निलंबन के धारावाहिक 10 गुना dilutions की तैयारी और 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस .
4. 3 दिवस: cfu गिनती और डेटा प्रस्तुति.
- प्लेटों पर कालोनियों की गणना और dilutions की प्रत्येक श्रृंखला के औसत से पालन जीवाणुओं की और inoculum के cfu की संख्या की गणना. 10-300 कालोनियों के बीच केवल प्लेटों के साथ गिना जाना चाहिए.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
निम्न तालिका पालन बैक्टीरिया और 3 अलग अलग दिनों पर प्रदर्शन प्रयोगों से inoculum की गिनती cfu के विशिष्ट परिणाम से पता चलता है:
परिणाम की सूचना सीधे रूप cfu पालन कर सकते हैं, के रूप में चित्र 1A में दिखाया गया है. चूंकि inoculum आकार की वजह से विकास दर में अंतर या pipetting त्रुटियों उपभेदों के बीच भिन्न हो सकते हैं, यह अक्सर पालन बैक्टीरिया के प्रतिशत के रूप में परिणाम की रिपोर्ट करने के लिए सलाह दी जाती है. पालन बैक्टीरिया का प्रतिशत पालन बैक्टीरिया के cfu की संख्या inoculum cfu की संख्या से विभाजित करके गणना की जा सकती है, के रूप में चित्रा 1 बी में दिखाया गया है. एक बार उपाय एनोवा और Bonferroni पद परीक्षण प्रदर्शन चित्रा 1B के सभी स्तंभों की तुलना करके, हम है कि वहाँ 2787 और Aida 2787Δ के बीच महत्वपूर्ण मतभेद, (पी <0.05) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 2787 और C600 के बीच देखते हैं, लेकिन कोई महत्वपूर्ण अंतर कर सकते हैं 2787Δ AIDA और C600 के बीच .
चित्रा 1 पालन बैक्टीरिया के cfu (एक) या पालन बैक्टीरिया का प्रतिशत (बी) के रूप में परिणाम का प्रतिनिधित्व.
मनाया पालन का प्रतिशत अक्सर सेट अप (और, एक हद तक कम करने के लिए experimenter पर) बहुत प्रयोगात्मक पर निर्भर विशेष रूप से महत्वपूर्ण MOI और washes की संख्या है, तो प्रतिशत सचमुच नहीं किया जा व्याख्या करना चाहिए.
inoculum में बैक्टीरिया कभी कभी कोशिकाओं की उपस्थिति में बैक्टीरिया की तुलना में ज्यादा तेजी से बढ़ने कर सकते हैं असली कोशिकाओं के साथ कुओं में बैक्टीरिया की कुल संख्या के साथ तुलना से inoculum के आकार skewing. इस मुद्दे को कम करने के लिए, या तो सिफारिश की है: (i) कोशिकाओं के साथ कुओं का उपयोग करने के लिए निर्धारित inoculum: Hep-2 कोशिकाओं एक अतिरिक्त अच्छी तरह से में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और संक्रमित है. सतह पर तैरनेवाला और कपड़े धोने, 10% ट्राइटन के 100 μl परख की discarding के बजाय, अंत में एक्स-100 अच्छी तरह से जोड़ा जाता है. कोशिकाओं lyse और पालन और गैर - पालन बैक्टीरिया युक्त lysate धीरे दोहराया ऊपर और नीचे pipetting द्वारा homogenized है, या (ii) परख के अंत में संक्रमित कोशिकाओं की supernatants एकत्र, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से supernatants से DPBS washes और उन में जमा supernatants cfu की संख्या निर्धारित है. यह गैर - पालन बैक्टीरिया के cfu की संख्या निकलेगा. पालन बैक्टीरिया का प्रतिशत तो cfu के पालन और गैर - पालन जीवाणुओं की संख्या के अलावा से पालन बैक्टीरिया के cfu की संख्या को विभाजित करके गणना की जा सकता है.
परख की मजबूती वर्णन करने के लिए, हम S4074 के साथ प्रदर्शन परख, Actinobacillus pleuropneumoniae 7 के एक चिपकने वाला सुअर रोगजनक तनाव, एक हाल ही में स्थापित tracheal घेंटा सेल लाइन, NPTr 8 से कोशिकाओं के साथ incubated के साथ इस प्रोटोकॉल की तुलना कर सकते हैं. बैक्टीरिया और कोशिकाओं के विकास के लिए आवश्यक मीडिया में मतभेद के अलावा, फर्क सिर्फ इतना है कि संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया बैक्टीरिया एक तेजी से बढ़ रही संस्कृति से हैं, और एक स्थिर चरण रात संस्कृति से नहीं. ए के साथ यह pleuropneumoniae भी बहुत महत्वपूर्ण है है 10:01 के MOI सम्मान और संक्रमण के 3 घंटे से अधिक नहीं है, अन्यथा विषाक्त पदार्थों के स्राव कोशिका मृत्यु और परिणाम पूर्वाग्रह के कारण होगा. इसके अलावा, ए के इस तनाव pleuropneumoniae आसानी से प्लास्टिक का पालन इसलिए यह महत्वपूर्ण है मिला हुआ कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए और नेत्रहीन सत्यापित करें कि कोशिकाओं से नहीं sloughing हैं कर सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यह एक मानक है कि आक्रमण अध्ययन (gentamicin संरक्षण परख 3 का उपयोग उदाहरण के लिए) करने के लिए संशोधित किया जा सकता जीवाणु पालन परख प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. कॉलोनी बनाने इकाइयों की गिनती मात्रा का ठहराव एक खुर्दबीन के नीचे मानक दृश्य तकनीकों पर निर्भर Giemsa धुंधला के रूप में दृष्टिकोण, के साथ तुलना द्वारा की अनुमति देता है. बाद केवल आसंजन के एक गुणात्मक दृश्य देता है, लेकिन अक्सर एक उपयोगी पूरक है क्योंकि यह आसंजन के विभिन्न पैटर्न के अंतर कर सकते हैं और mechanistical अंतर्दृष्टि दे 9. उदाहरण के लिए एक Giemsa 10 7 2787 के cfu inoculum के साथ प्रदर्शन दाग चित्रा 2 में दिखाया गया है और पूरे कोशिका की सतह पर एक फैलाना आसंजन, diffusely पालन Escherichia कोलाई 10 की विशेषता को इंगित करता है.
इस प्रोटोकॉल के मात्रात्मक पहलू के बावजूद, इस बात पर बल दिया जा सकता है कि परिणाम आम तौर पर चर रहे हैं चाहिए. और सकारात्मक नियंत्रण से 100 गुना आसंजन के निचले स्तर - सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के बीच एक काफी लगातार नकारात्मक नियंत्रण आमतौर पर 10 के बीच होने के साथ, अंतर है. लेकिन दिन से दिन में, आसंजन का प्रतिशत 2 गुना से भिन्न हो सकते हैं. इसलिए यह अक्सर के प्रयोग के प्रति दो से तीन को दोहराने के का उपयोग करने के लिए कई प्रयोगों की योजना है और दोहराया उपायों या बनती परीक्षण (या तो एनोवा या छात्र टी परीक्षण) का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन के लिए सलाह दी जाती है.
एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु बैक्टीरिया के आसंजन के बाद washes है. देखभाल नहीं उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए लिया जाना चाहिए. यदि कोशिकाओं को दूर स्लाव तो वहाँ कम पालन बैक्टीरिया है कि अच्छी तरह से किया जाएगा. अधिक या कम washes और इस्तेमाल किया जा सकता है पालन जीवाणुओं की संख्या बहुत washes (आमतौर पर 2 और 4 के बीच) की संख्या के साथ सहसंबद्ध है और कैसे experimenter washes के प्रदर्शन पर काफी निर्भर करता है है. washes की न्यूनतम संख्या है कि एक कम पृष्ठभूमि की अनुमति देता है प्रयोग किया जाना चाहिए. कोई फर्क नहीं पड़ता कि कितने washes चुना जाता है, यह अत्यंत महत्व के सभी कुओं के लिए washes के एक ही संख्या में रोजगार और एक ही इशारों को हर बार धोने प्रदर्शन दोहराने है.
चित्रा 2. ई. से बैक्टीरिया के Giemsa धुंधला कोलाई 2787 तनाव Hep दो कोशिकाओं का पालन.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों की प्रयोगशालाओं में कार्य प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद, कनाडा के कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान, और कनाडा अनुसंधान अध्यक्षों कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित है. जीएल Fonds डे Recherche SANTE डु क्यूबेक एन से धन के माध्यम से ग्रुप डी तसवीर का ख़ाका डेस Protéines Membranaires (GEPROM) से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-054 | |
| DDPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-148 | |
| 24 well plates | Corning | 3337 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
References
- Kline, K. A. Bacterial adhesins in host-microbe interactions. Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. Cellular microbiology emerging. Science. 271, 315-315 (1996).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).
- Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 161-161 (2002).
- Srivastava, A., Isberg, R. R. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 179-179 (2002).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
- Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
- Jacques, M., Paradis, S. E. Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae. FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).
- Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
- Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
- Nataro, J. P., Kaper, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).
- Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).
