Summary
Dit protocol is een eenvoudige bacteriële hechting test die bestaat in het tellen van de aantallen van bacteriële kolonievormende eenheden die in acht worden genomen op gekweekte cellen. De test is robuust, onafhankelijk van de adhesine bestudeerd en er zijn ontelbare variaties gebruikt in de meeste laboratoria werken aan bacteriële pathogenese.
Abstract
Te veroorzaken infecties, moeten bacteriën koloniseren hun gastheer. Bacteriële pathogenen uitdrukkelijke verschillende moleculen of structuren in staat om gehechtheid te bevorderen cellen 1 host. Deze adhesinen vertrouwen op interacties met de gastheercel receptoren aan de oppervlakte of oplosbare eiwitten fungeren als een brug tussen bacteriën en gastheer. Hechting is een belangrijke eerste stap voorafgaand aan de invasie en / of de secretie van toxines, het is dus een belangrijke gebeurtenis te worden bestudeerd in bacteriële pathogenese. Bovendien gehandeld bacteriën vaak prachtig veroorzaken verfijnd cellulaire reacties, de studies van die bevallen op het gebied van 2 'cellulaire microbiologie'. Robuuste analyses voor bacteriële hechting op gastheercellen en hun invasie daarom een belangrijke rol spelen in bacteriële pathogenese studies en zijn al lange tijd gebruikt in veel laboratoria pionier 3,4. Deze testen worden nu beoefend door de meeste laboratoria die werken op bacteriële pathogenese.
We beschrijven hier een standaard naleving test illustreert de bijdrage van een specifieke adhesine. We gebruiken de Escherichia coli stam 2787 5, een humaan pathogene stam de uiting van de autotransporter Adhesin Betrokken bij Diffuse Adherence (AIDA). Als een controle, gebruiken we een mutant stam ontbreekt de Aida-gen, 2787Δ Aida (F. Berthiaume en M. Mourez, niet gepubliceerd), en een commercieel laboratorium stam van E. coli, C600 (New England Biolabs). De bacteriën worden overgelaten aan zich te houden aan de cellen van de veelgebruikte HEp-2 menselijke epitheel cellijn. Deze test is minder uitgebreid beschreven voor 6.
Protocol
1. Opmerking vooraf: Bacteriestammen en epitheelcellen.
Manipulaties van cellen en bacteriën worden aseptisch uitgevoerd, onder een laminar flow kap.
- Vers isoleren de E. coli-stammen 2787, 2787Δ Aida, en de C600 uit glycerol voorraden op Lysogeny bouillon (LB) agar platen (1% trypton, 0,5% natriumchloride, 0,5% gistextract, 1,5% agar) en groeien bij 37 ° C. Om variabiliteit te minimaliseren in de test, wordt geadviseerd om altijd vers vergulde stammen en de stammen te houden bij 4 ° C op verzegelde Petri platen slechts voor een maximum van een paar weken.
- Cultuur HEp-2-cellen (ATCC CCL-23) in Modified Eagle hoge glucose Dulbecco's Medium (DMEM) aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd bovine serum (warmte-inactivatie wordt uitgevoerd bij 56 ° C gedurende 30 min). Tijdens de routine cultuur die we ook toevoegen 10 U / ml penicilline en 10 ug / ml streptomycine.
- Grow Hep-2-cellen bij 37 ° C in een cel incubator met een atmosfeer die 5% CO 2. Gebruik standaard celcultuur procedures om de cellen, die worden gekweekt in 75 cm 2 flessen en subcultuur elke keer als ze bij samenvloeiing te houden. We maken gebruik van onze gekweekte cellen tot het bereiken van 30 tot 40 passages en gooi ze weg.
- Bereid een test als de HEp-2-cellen in een 75 cm 2 kolf bijna tot samenloop en dus zijn klaar voor een hechting test.
2. DAG 1: Voorbereiding van het inoculum en de epitheelcellen
- Was de HEp-2-cellen in de kolf een keer met warm Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS: 8 g / L NaCl, 0,2 g / L KCl, 0,2 g / L KH 2 PO 4, 0,21 g / L Na 2 HPO 4: 7H 2 O)
- De cellen worden geïncubeerd met 0,05% trypsine - EDTA gedurende 5 minuten voor het toevoegen van verse warme compleet medium. Na vers medium wordt toegevoegd, worden de cellen geresuspendeerd door en neer te pipetteren.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 2.000 tpm gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellets in DPBS en centrifuge opnieuw.
- Resuspendeer de cellen in vers medium aangevuld met 10% serum, maar bevat geen antibiotica, met een concentratie van 2x10 5 cellen / ml.
- Zaad een milliliter van de celsuspensie in drie sets van de duplo (een voor elke stam) in het centrum van een 24-wells plaat en incubeer de plaat 's nachts in een celkweek incubator.
Opmerking: Het is belangrijk dat het serum grondig decomplemented en dat antibiotica worden weggelaten na deze fase. Doet u dit niet zou kunnen doden de bacteriën infecteren. - Inoculeren een geïsoleerde kolonie van elke bacteriestam (2787, 2787Δ Aida en C600) in 5 ml LB-bouillon (1% trypton, 0,5% natriumchloride, 0,5% gistextract) en groeien 's nachts bij 37 ° C met heftig schudden (180 rpm ).
3. DAG 2: Infectie van cellen
- Inspecteer de HEp-2 cellen onder een omgekeerde microscoop om na te gaan dat ze minstens 90% confluent en niet verontreinigd.
- De cellen gewassen met warm DPBS, en aan elk putje, voeg 1 ml vers medium aangevuld met 10% serum, maar bevat geen antibiotica. Voeg ook vers medium om drie putten zonder cellen. Deze zal worden gebruikt om het totaal aantal bacteriën in het inoculum vast te stellen voor elke stam.
- Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD 0,600 nm) van de bacteriële culturen. Voeg een hoeveelheid van elke bacteriecultuur om een set van duplo met Hep-2 cellen en tot een goed zonder cellen. Meestal maken we gebruik van een volume van 's nachts cultuur die overeenkomt met 10 6 kolonievormende eenheden (kve). Dit vertegenwoordigt een multipliciteit van infectie (MOI) van 05u01 (bacteriën: cellen). Hoewel we direct gebruik maken van onze culturen 's nachts, is het soms raadzaam om de bacteriën centrifuge en ze resuspendeer in DPBS schadelijke effecten van de afgescheiden moleculen aanwezig zijn in de nacht culturen te vermijden (zoals cytotoxinen, bijvoorbeeld)
Opmerking: De MOI kan variëren tussen 100:1 en 01:10. Een hogere MOI opbrengst hogere variabiliteit en achtergrond en bacteriën de neiging vast te houden aan het plastic van de plaat. Lagere MOI levert ook hoge variabiliteit. Zodra een MOI is gekozen, is het noodzakelijk om consistent te zijn en dit MOI te houden. - Incubeer de geïnfecteerde cellen in de celkweek incubator gedurende 3 uur bij 37 ° C met 5% CO 2.
Opmerking: Het is ook mogelijk om kort centrifuge de plaat bij een lage snelheid (bijv. 1000 xg voor 1-2 min), zodat alle bacteriën te brengen in direct contact met de cellen. Dit heeft de extra voordelen van het synchroniseren van de infectie, en waardoor een kortere incubatietijd (zo weinig als 15-30 minuten). - Verwijder het medium van de geïnfecteerde cellen en was de cellen drie keer met warm DPBS. Bij deze stap kan aanhanger bacteriën meestal gezien worden met een standaard microscoop en we routinematig uitvoeren van deze controle.
- Om de cellen te lyseren en maak de aangehouden bacteria, voeg 100 ul van 1% Triton X-100 aan elk putje met de cellen. Andere reinigingsmiddelen kunnen worden gebruikt (zoals saponine bijvoorbeeld).
- Incubeer de cellen gedurende 10 min bij kamertemperatuur en voeg dan 900 ul van de LB-medium.
- Voorzichtig homogeniseren van de suspensies door up-en-down herhaald pipetteren. De putten zonder cellen met het inoculum worden op dezelfde voorzichtig gehomogeniseerd.
Opmerking: Sommige bacteriën misschien te gevoelig zijn voor het wasmiddel, in dat geval kunnen wij de epitheelcellen los door incubatie met 0,05% trypsine - EDTA gedurende 20 min bij 37 ° C. Cellen samen met de aangehouden bacterie kan ook worden geschraapt uit de putten met een pipet tip. - Bereid serial 10-voudige verdunningen van de suspensies van bacteriën en gehandeld inoculum met behulp van LB bouillon en de plaat 100 pi uit drie verdunningen (meestal de 1:1.000, 1:10.000 en 1:100.000 verdunningen) op LB-agar en incubeer overnacht bij 37 ° C .
4. DAG 3: cfu tellen en presentatie van gegevens.
- Tel de kolonies op de platen en bereken het aantal cfu gehandeld bacteriën en van het inoculum door het gemiddelde elke serie van verdunningen. Alleen platen met tussen de 10-300 kolonies moet worden geteld.
5. Representatieve resultaten:
De volgende tabel laat de typische resultaten van cfu tellen van bacteriën en gehandeld inoculum uit drie experimenten uitgevoerd op verschillende dagen:
De resultaten kunnen worden gerapporteerd direct als CFU gehandeld, zoals weergegeven in figuur 1A. Aangezien het inoculum grootte kan variëren tussen stammen als gevolg van verschillen in de groeicijfers of pipetteren fouten, is het vaak raadzaam om de resultaten als percentage van de aangehouden bacteriën. Het percentage van de aangehouden bacteriën kan worden berekend door het aantal cfu gehandeld bacteriën door het aantal KVE van het inoculum, zoals weergegeven in figuur 1B. Door het uitvoeren van een herhaalde meting ANOVA en Bonferroni post-tests om alle kolommen van figuur 1B vergelijken, zien we dat er significante verschillen (p <0,05) tussen 2787 en 2787Δ Aida, alsook tussen 2787 en C600, maar geen significant verschil tussen 2787Δ Aida en C600.
Figuur 1. Vertegenwoordiging van de resultaten als cfu gehandeld bacteriën (A) of percentage van de aangehouden bacteriën (B)
Het percentage van de waargenomen naleving is vaak erg afhankelijk van de experimentele set-up (en, in mindere mate, op de experimentator). Van bijzonder belang zijn de MOI en het aantal wasbeurten, dus het percentage moet niet letterlijk worden geïnterpreteerd.
De bacteriën in het inoculum kan soms veel sneller groeien dan de bacteriën in de aanwezigheid van cellen, vertekening van de grootte van het inoculum in vergelijking met het werkelijke totaal aantal bacteriën in putten met cellen. Om dit probleem te verlichten, is het raadzaam om ofwel: (i) bronnen te gebruiken met cellen om het inoculum vast te stellen: HEp-2-cellen worden gezaaid in een extra goed en geïnfecteerd. Aan het einde van de test, in plaats van het teruggooien de supernatant en wassen, 100 pl van 10% Triton X-100 wordt toegevoegd aan het goed. De cellen zullen lyseren en het lysaat met gehandeld en niet-nageleefd bacteriën wordt voorzichtig gehomogeniseerd door herhaalde up-and-down pipetteren,. Of (ii) de supernatanten van geïnfecteerde cellen te verzamelen aan het einde van de test, evenals de supernatanten van de DPBS wast en bepalen van het aantal CFU in die samengevoegde supernatants. Dit levert het aantal cfu van niet-naleving bacteriën. Het percentage van de aangehouden bacteriën kan dan worden berekend door het aantal cfu gehandeld bacteriën door de toevoeging van het aantal cfu gehandeld en niet-naleving bacteriën.
Ter illustratie van de robuustheid van de test, we kunnen dit protocol te vergelijken met de test uitgevoerd met S4074, een zelfklevende varkens pathogene stam van Actinobacillus pleuropneumoniae 7, geïncubeerd met cellen van een recent opgericht tracheale big cellijn, NPTr 8. Afgezien van verschillen in de media die nodig zijn voor de groei van de bacteriën en de cellen, het enige verschil is dat de bacteriën wordt gebruikt voor infectie zijn van een exponentieel groeiende cultuur, en niet van een stationaire-fase 's nachts cultuur. Met A. pleuropneumoniae is het ook zeer belangrijk om een MOI van 10:01 te respecteren en niet meer dan drie uur van de infectie, anders wordt de secretie van toxines zal leiden tot celdood en vooringenomenheid van de resultaten. Daarnaast is deze stam van A. pleuropneumoniae kunnen gemakkelijk voldoen aan plastic dus het is belangrijk om confluente cellen gebruiken en visueel te controleren of de cellen niet afstoten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een standaard bacteriële hechting test die kan worden aangepast om invasie onderzoek (bijv. met gentamicine protectie-analyse, 3). Het tellen van het aantal kolonievormende eenheden kan kwantificering, in vergelijking met de aanpak vertrouwen op standaard visualisatie technieken onder een microscoop, zoals Giemsa kleuring. De laatste geeft slechts een kwalitatieve weergave van hechting, maar is vaak een nuttige aanvulling, omdat het kan differentiëren verschillende patronen van hechting en geven mechanistical inzichten 9. Bijvoorbeeld een Giemsa vlek uitgevoerd met een inoculum van 10 7 cfu van 2787 is weergegeven in figuur 2 en geeft een diffuus hechting op het hele celoppervlak, kenmerkend voor de diffuus deelnemende Escherichia coli 10.
Ondanks het kwantitatieve aspect van dit protocol, moet worden benadrukt dat de resultaten meestal variabel zijn. Er is een vrij constant verschil tussen positieve en negatieve controles, met een negatieve controle gewoonlijk met tussen de 10 - en 100-voudig lagere niveaus van de hechting dan positieve controles. Maar van dag tot dag, kan het percentage van de hechting oplopen tot 2-voudig. Daarom is het vaak raadzaam twee tot drie gelijke per experiment te gebruiken, verschillende experimenten te plannen en statistische analyses met behulp van herhaalde metingen of gepaarde tests (of ANOVA of een Student's t test) uit te voeren.
Een ander belangrijk punt is de wast na de hechting van bacteriën. Zorg moet worden genomen niet aan de epitheliale cellen los te maken. Als de cellen moeras uit dan zal er minder gehandeld bacteriën in dat goed. Meer of minder wast kan worden gebruikt en het aantal aangehouden bacteriën is erg gecorreleerd met het aantal wasbeurten (meestal tussen 2 en 4) en is sterk afhankelijk van de manier waarop de onderzoeker voert de wasbeurten. Het minimum aantal wasbeurten met een lage achtergrond kan worden gebruikt. Maakt niet uit hoe vele wasbeurten worden gekozen, is het van het grootste belang om hetzelfde aantal wasbeurten voor alle putten in dienst nemen en te herhalen dezelfde gebaren elke keer een wasbeurt wordt uitgevoerd.
Figuur 2. Giemsa kleuring van bacteriën van E. coli-stam 2787 gehandeld op grond van HEp-2-cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Werken in de laboratoria van de auteurs wordt ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada, de Canadese Institutes of Health Research, en de Canada Research Chairs programma. JL wordt ondersteund door een beurs van de Groupe d'Etude des proteïnen Membranaires (GEPROM) met middelen van het Fonds de Recherche en Sante du Quebec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-054 | |
| DDPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-148 | |
| 24 well plates | Corning | 3337 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
References
- Kline, K. A.
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R.
- Elsinghorst, E. A.
- Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 161-161 (2002).
- Srivastava, A., Isberg, R. R. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 179-179 (2002).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
- Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
- Jacques, M., Paradis, S. E.
- Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
- Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
- Nataro, J. P., Kaper, J. B.
- Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).
