Summary
Dieses Protokoll ist eine einfache bakterielle Adhäsion Assay aus der Zählung die Zahl der bakteriellen Kolonie bildende Einheiten, die auf kultivierten Zellen eingehalten werden. Der Test ist robust, studierte unabhängig von der Adhäsin und zahlreiche Variationen sind in den meisten Labors arbeiten bakterielle Pathogenese.
Abstract
Um Infektionen verursachen, müssen Bakterien besiedeln die Gastgeber. Bakterielle Krankheitserreger Ausdruck verschiedener Moleküle oder Strukturen in der Lage, um die Befestigung zu fördern, um Zellen 1 Host. Diese Adhäsine setzen auf Interaktion mit dem Host Rezeptoren auf der Zelloberfläche oder lösliche Proteine, die als eine Brücke zwischen Bakterien und Wirt. Die Haftung ist ein entscheidender erster Schritt vor der Invasion und / oder Sekretion von Toxinen, daher ist es eine der wichtigsten Veranstaltungen in bakterielle Pathogenese untersucht werden. Darüber hinaus haften Bakterien oft exquisit induzieren Feinabstimmung zellulären Reaktionen, die Studien, die entbunden haben auf dem Gebiet der "zellulären Mikrobiologie '2. Robust-Assays für die bakterielle Adhäsion an Wirtszellen und ihre Invasion spielen daher eine Schlüsselrolle in bakterielle Pathogenese Studien und seit langem in vielen Labors Pionier 3,4 verwendet worden. Diese Assays sind mittlerweile von den meisten Labors arbeiten bakterielle Pathogenese praktiziert.
Hier beschreiben wir eine Standard-Einhaltung Assay illustrieren den Beitrag eines spezifischen Adhäsin. Wir nutzen die Escherichia coli-Stamm 2787 5, eine humanpathogene Stamm, der Autotransporter Adhesin in Diffuse Adherence (AIDA) beteiligt. Zur Kontrolle verwenden wir eine Mutante fehlt die Aida-Gen, 2787Δ Aida (F. Berthiaume und M. Mourez, unveröffentlicht), und ein kommerzielles Labor-Stamm von E. coli, C600 (New England Biolabs). Die Bakterien werden nach links, um die Zellen aus dem häufig verwendeten HEp-2 menschlichen epithelialen Zell-Linie zu halten. Dieser Assay wurde weniger intensiv vor 6 beschrieben.
Protocol
1. Vorbemerkung: Bakterienstämme und Epithelzellen.
Manipulationen von Zellen und Bakterien werden aseptisch unter einer Sterilbank durchgeführt.
- Frisch isolieren E. coli-Stämme 2787, 2787Δ Aida und C600 aus Glycerin Aktien auf PBS-Broth (LB)-Agar-Platten (1% Trypton, 0,5% Natriumchlorid, 0,5% Hefeextrakt, 1,5% Agar) und wachsen bei 37 ° C. Um die Variabilität zu minimieren in dem Test, ist es ratsam, immer frisch vergoldet Stämme und die Stämme bei 4 ° C zu halten auf versiegelten Petrischalen nur für maximal ein paar Wochen.
- Kultur HEp-2-Zellen (ATCC CCL-23) in Modified Eagle hohen Glucose-Dulbecco Medium (DMEM) mit 10% hitzeinaktiviertem Rinderserumalbumin (Hitzeinaktivierung bei 56 ° C für 30 min durchgeführt) ergänzt. Während der routinemäßigen Kultur, die wir auch hinzufügen, 10 U / ml Penicillin und 10 ug / ml Streptomycin.
- Wachsen Hep-2 Zellen bei 37 ° C in einer Zelle Inkubator mit einer Atmosphäre mit 5% CO 2. Verwenden Sie Standard-Zellkultur Verfahren, um die Zellen, die in 75 cm 2-Kolben-und Subkultur jeder Zeit erreichen sie Konfluenz gezüchtet werden aufrecht zu erhalten. Wir nutzen unsere kultivierten Zellen, bis sie 30 bis 40 Passagen zu erreichen und dann verwerfen.
- Bereiten Sie einen Test, wenn die HEp-2 Zellen in einer 75 cm 2-Kolben fast erreichen Zusammenfluss und sind daher für ein Festhalten Test bereit.
2. TAG 1: Vorbereiten des Inokulums und die Epithelzellen
- Waschen Sie die HEp-2-Zellen in den Kolben einmal mit warmen Dulbeccos Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS: 8 g / L NaCl, 0,2 g / L KCl, 0,2 g / L KH 2 PO 4, 0,21 g / L Na 2 HPO 4: 7H 2 O)
- EDTA für 5 min vor der Zugabe von frischem warmem Vollmedium - Die Zellen werden mit 0,05% Trypsin inkubiert. Nach frischem Medium hinzugefügt wird, werden die Zellen durch Auf-und Abpipettieren resuspendiert.
- Centrifuge die Zellsuspension bei 2.000 rpm für 5 min und Resuspendieren der Pellets in DPBS und Zentrifuge wieder.
- Resuspendieren der Zellen in frischem Medium ergänzt mit 10% Serum enthält aber keine Antibiotika, bei einer Konzentration von 2x10 5 Zellen / ml.
- Seed einem Milliliter der Zellsuspension in drei Sätzen von Doppelbestimmungen (eine für jeden Stamm) in der Mitte einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem Zellkulturbrutschrank.
Hinweis: Es ist wichtig, dass das Serum sorgfältig decomplemented werden und dass Antibiotika sind nach diesem Zeitpunkt verzichtet. Andernfalls könnte töten die Bakterien infizieren. - Impfen eine isolierte Kolonie von jedem Bakterienstamm (2787, 2787Δ Aida und C600) in 5 ml LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Natriumchlorid, 0,5% Hefeextrakt) und wachsen über Nacht bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln (180 rpm ).
3. TAG 2: Infektion von Zellen
- Überprüfen Sie die HEp-2 Zellen unter einem inversen Mikroskop, um festzustellen, dass sie mindestens 90% konfluent und nicht kontaminiert sind.
- Washed die Zellen mit warmem DPBS und in jede Vertiefung, 1 ml frisches Medium mit 10% Serum ergänzt, jedoch keine Antibiotika. Fügen Sie auch frisches Medium zu drei Brunnen ohne Zellen. Dies wird verwendet, um die Gesamtzahl der Bakterien im Inokulum für jeden Stamm zu bestimmen.
- Messen der optischen Dichte bei 600 nm (OD 0,600 nm) der Bakterienkulturen. Fügen Sie ein Aliquot jeder Bakterienkultur zu einem Satz von Doppelbestimmungen mit Hep-2 Zellen und einem gut nicht enthaltenden Zellen. Normalerweise verwenden wir ein Volumen von Übernacht-Kultur entsprechend 10 6 Kolonie bildenden Einheiten (KBE). Dies entspricht einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5:1 (Bakterien: Zellen). Obwohl wir direkt an unsere Nacht-Kulturen, ist es manchmal ratsam, die Bakterien zentrifugiert und resuspendiert sie in DPBS zu schädlichen Auswirkungen von sezernierten Moleküle in den Nacht-Kulturen zu vermeiden (wie z. B. Zellgifte, zum Beispiel)
Hinweis: Die MOI zwischen 100:1 und 1:10 schwanken. Höhere MOI ergibt höhere Variabilität und Hintergrund und Bakterien dazu neigen, auf den Kunststoff der Platte kleben. Lower MOI ergibt sich auch eine hohe Variabilität. Nach einer MOI gewählt wird, ist es unerlässlich, konsequent zu sein und bewahren Sie diese MOI. - Inkubieren Sie die infizierten Zellen in der Zellkultur-Inkubator für 3 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2.
Hinweis: Es ist auch möglich, kurz zentrifugieren Sie die Platte bei niedriger Geschwindigkeit (z. B. 1.000 xg für 1-2 min), um alle Bakterien direkt in Kontakt mit den Zellen zu bringen. Dies hat den zusätzlichen Nutzen der Synchronisierung der Infektion und ermöglicht kürzere Inkubationszeiten (so wenig wie 15-30 min). - Entfernen Sie das Medium aus den infizierten Zellen und die Zellen 3 mal mit warmem DPBS. In diesem Schritt können anhaftende Bakterien in der Regel mit einem Standard-Mikroskop gesehen werden, und wir routinemäßig dieses Kontrollkästchen.
- Um die Zellen zu lysieren und lösen Sie die eingehalten bacterien, 100 ul 1% Triton X-100 in jede Vertiefung, welche die Zellen. Andere Reinigungsmittel können verwendet werden (z. B. Saponin zum Beispiel) werden.
- Inkubieren Sie die Zellen für 10 min bei Raumtemperatur und fügen Sie dann 900 ul LB-Medium.
- Gently homogenisieren den Suspensionen von up-and-down Pipettieren wiederholt. Der Brunnen ohne Zellen, die das Inokulum sind ähnlich vorsichtig homogenisiert.
Hinweis: Einige Bakterien könnte zu empfindlich, um das Waschmittel, in diesem Fall werden wir lösen die Epithelzellen durch Inkubation mit 0,05% Trypsin - EDTA für 20 min bei 37 ° C. Cells gemeinsam mit eingehalten Bakterien können auch aus den Vertiefungen mit einer Pipettenspitze abgeschabt werden. - Bereiten Sie serielle 10-fache Verdünnungen der Suspensionen eingehalten Bakterien und Inokulum mit LB-Medium und die Platte 100 ul von 3 Verdünnungen (in der Regel 1:1.000, 1:10.000 und 1:100.000 Verdünnungen) auf LB-Agar und Inkubation über Nacht bei 37 ° C .
4. TAG 3: cfu Zähl-und Daten-Präsentation.
- Zählen Sie die Kolonien auf den Platten und berechnen Sie die Anzahl der KBE eingehalten Bakterien und des Inokulums durch Mittelung jeder Serie von Verdünnungen. Nur Platten mit zwischen 10-300 Kolonien gezählt werden sollten.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Die folgende Tabelle zeigt typische Ergebnisse der Zählung der KBE eingehalten Bakterien und Inokulum aus 3 Versuchen an verschiedenen Tagen durchgeführt:
Die Ergebnisse können berichtet direkt als cfu eingehalten werden, wie in Abbildung 1A dargestellt. Da das Inokulum Größen zwischen Stämmen wegen der Unterschiede in den Wachstumsraten oder Pipettierfehler variieren kann, ist es oft ratsam, die Ergebnisse als Prozentsatz eingehalten Bakterien Bericht. Der Anteil der Einhaltung Bakterien können, indem die Anzahl der KBE eingehalten Bakterien durch die Anzahl der KBE des Inokulums berechnet werden, wie in Abbildung 1B gezeigt. Durch die Durchführung einer wiederholten Messung ANOVA und Bonferroni post-Prüfungen, um alle Spalten der Abbildung 1B vergleichen, können wir sehen, dass es signifikante Unterschiede (p <0,05) zwischen 2787 und 2787Δ aida, sowie zwischen 2787 und C600, aber keinen signifikanten Unterschied zwischen 2787Δ Aida und C600.
Abbildung 1. Darstellung der Ergebnisse als KBE eingehalten Bakterien (A) oder in Prozent vom eingehalten Bakterien (B)
Der Anteil der Einhaltung beobachtet ist oft sehr abhängig von der Versuchsanordnung (und in geringerem Umfang, auf dem Experimentator). Besonders wichtig sind die MOI und die Anzahl der Wäschen, so der prozentuale Anteil sollte nicht wörtlich verstanden werden.
Die Bakterien im Inokulum kann manchmal viel schneller wachsen als die Bakterien in Gegenwart von Zellen, Neigen der Größe des Inokulums durch Vergleich mit der realen Anzahl der Bakterien in den Vertiefungen mit Zellen. Zur Linderung dieses Problems ist es, entweder empfohlen: (i) Vertiefungen mit Zellen des Inokulums bestimmen: HEp-2-Zellen werden in einem weiteren gut ausgesät und infiziert. Am Ende des Tests, statt der Überstand verworfen und das Waschen, 100 ul 10% Triton X-100 ist es, die gut aufgenommen. Die Zellen werden lysiert und das Lysat mit eingehalten und nicht eingehalten Bakterien wird sanft durch wiederholtes Auf-und Ab-Pipettieren homogenisiert;. Oder (ii) sammeln die Überstände von infizierten Zellen am Ende des Tests, sowie die Überstände aus die DPBS wäscht und bestimmt die Anzahl der KBE in den vereinigten Überständen. Daraus ergibt sich eine Anzahl der KBE nicht eingehalten Bakterien. Der Anteil der Einhaltung Bakterien können dann durch Division der Anzahl der KBE eingehalten Bakterien durch die Zugabe von der Anzahl der KBE eingehalten und nicht eingehalten Bakterien berechnet werden.
Zur Veranschaulichung der Robustheit des Tests können wir dieses Protokoll mit dem Assay mit S4074 durchgeführt, ein Klebstoff Schweine pathogenen Stamm von Actinobacillus pleuropneumoniae 7, mit Zellen aus einer kürzlich gegründeten tracheale Ferkel-Zelllinie, nptr 8 inkubiert vergleichen. Abgesehen von Unterschieden in den Medien für das Wachstum der Bakterien und den Zellen erforderlich, ist der einzige Unterschied, dass die Bakterien zur Infektion verwendet aus einer exponentiell wachsenden Kultur sind, und nicht von einer stationären Phase Übernacht-Kultur. Mit A. pleuropneumoniae es ist auch sehr wichtig, eine MOI von 10:1 zu respektieren und nicht mehr als 3 Stunden nach der Infektion, da sonst die Sekretion von Toxinen wird Zelltod und Bias der Ergebnisse führen. Darüber hinaus dieser Sorte von A. pleuropneumoniae können ohne weiteres auf Kunststoff haften so ist es wichtig, konfluenten Zellen verwenden, und überprüfen Sie visuell, dass die Zellen nicht Abstossung.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Standard-bakteriellen Adhärenz-Assay, modifiziert Invasion Studie (zB mit Gentamicin Protection Assay 3) werden kann. Die Zählung der koloniebildenden Einheiten ermöglicht die Quantifizierung durch Vergleich mit Ansätzen unter Berufung auf Standard-Visualisierungs-Techniken unter einem Mikroskop, wie Giemsa. Letztere gibt nur einen qualitativen Blick Haftung wird aber oft eine sinnvolle Ergänzung, da es verschiedene Muster der Haftung kann differenzieren und geben mechanistische Einblicke 9. Zum Beispiel eine Giemsa mit einem Inokulum von 10 7 cfu von 2787 durchgeführt Fleck ist in Abbildung 2 dargestellt und zeigt eine diffuse Haftung auf die gesamte Zelloberfläche, die charakteristisch für das diffus Einhaltung Escherichia coli 10.
Trotz der quantitative Aspekt dieses Protokoll sollte betont werden, dass die Ergebnisse sind in der Regel variable sein. Es ist eine ziemlich konstante Differenz zwischen positiven und negativen Kontrollen, mit Negativ-Kontrolle in der Regel mit zwischen 10 - und 100-fach geringere Haftung als positive Kontrollen. Aber von Tag zu Tag, kann der Anteil der Haftung variieren bis zu 2-fach. Deshalb ist es oft ratsam, zwei vor drei replizieren pro Experiment nutzen, planen verschiedene Experimente und statistische Analysen mit Messwiederholungen oder gepaarte Tests (entweder ANOVA oder Student t-Test).
Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Waschungen nach Anhaften von Bakterien. Es ist darauf zu achten, dass die Epithelzellen zu lösen sein. Wenn die Zellen abzustreifen dann wird es weniger eingehalten Bakterien werden in so gut. Mehr oder weniger Waschgänge verwendet werden können und die Anzahl der Bakterien eingehalten ist sehr zufrieden mit der Anzahl der Wäschen (in der Regel zwischen 2 und 4) korreliert und hängt stark ab, wie der Experimentator führt die Waschungen. Die minimale Anzahl der Wäschen, die einen niedrigen Hintergrund ermöglicht verwendet werden sollte. Egal, wie viele Wäschen sind so gewählt, ist es von größter Bedeutung, um die gleiche Anzahl von Wäschen für alle Brunnen zu beschäftigen und zu wiederholen, die gleichen Gesten jedes Mal eine Wäsche durchgeführt wird.
Abbildung 2. Giemsa-Färbung von Bakterien aus E. coli-Stamm 2787 bis HEp-2-Zellen eingehalten werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Arbeit in den Laboratorien der Autoren wird durch Zuschüsse aus dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, der kanadischen Institutes of Health Research, und die Canada Research Chairs-Programm unterstützt. JL wird durch ein Stipendium der Groupe d'Etude des protéines Membranaires (GEPROM) durch Mittel aus dem Fonds de Recherche en Santé du Québec unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-054 | |
| DDPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-148 | |
| 24 well plates | Corning | 3337 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
References
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