Summary
Этот протокол является простым бактериальной адгезии анализ состоящей в подсчете числа бактериальных колониеобразующих единиц, которые будут соблюдаться на культуре клеток. Анализа является надежной, независимой от адгезина изучены, и многочисленные вариации используются в большинстве лабораторий, работающих на бактериальную патогенез.
Abstract
Чтобы вызвать инфекции, бактерии должны колонизировать хозяина. Бактериальные возбудители выражения различных молекул или структур, способных содействовать привязанности к клеткам хозяина 1. Эти адгезины опираться на взаимодействие с клеткой-хозяином поверхностных рецепторов или растворимые белки, выступая в качестве моста между бактериями и хозяином. Адгезия является важнейшим первым шагом до вторжения и / или секрецию токсины, таким образом, он является ключевым событием для изучения в бактериальных патогенез. Кроме того, придерживался бактерии часто вызывают изысканно тонкой настройки клеточных реакций, исследования, которые родили области 2 'сотовой микробиологии. Надежные анализы для бактериальной адгезии на клетках хозяина и их вторжения, следовательно, играют ключевую роль в патогенезе бактериального исследования и уже давно используется во многих лабораториях пионером 3,4. Эти анализы в настоящее время практикуется большинством лабораторий, работающих на бактериальную патогенез.
Здесь мы описываем стандартном анализе соблюдения иллюстрирующие вклад конкретного адгезина. Мы используем штаммом кишечной палочки 2787 5, человека штамма патогенного выражения Автовоз Adhesin Участие в диффузных сцепления (AIDA). В качестве контроля мы используем мутантного штамма отсутствует ген Аида, 2787Δ Аида (Ф. и М. Бертиом Mourez, не опубликовано), а также коммерческие лаборатории штамма Е. палочка, C600 (Новая Англия Биолабс). Бактерии остаются придерживаться клетки обычно используются НЕр-2 человека эпителиальной клеточной линии. Этот анализ был менее подробно описана до 6.
Protocol
1. Предварительное: бактериальные штаммы и эпителиальных клеток.
Манипуляции клеток и бактерий осуществляется асептически, под капотом ламинарного потока.
- Недавно изолировать Е. штаммов 2787, 2787Δ Аида, и C600 с глицерином акции на лизогении Отвар (LB) агаром (1% триптон, 0,5% натрия хлорида, 0,5% дрожжевого экстракта, 1,5% агара) и растут при температуре 37 ° C. Чтобы свести к минимуму различия в анализе, рекомендуется всегда использовать свежие штаммы покрытием и держать штаммы при 4 ° С на опечатанных чашках Петри только максимум пару недель.
- Культура НЕр-2 клетки (АТСС CCL-23) в модифицированной Eagle высокий уровень глюкозы в Дульбеко Средняя (DMEM) с добавлением 10% тепла инактивированной телячьей сыворотки (тепловой инактивации осуществляется при 56 ° С в течение 30 мин). Во время процедуры культуры мы также добавить 10 ед / мл пенициллина и 10 мкг / мл стрептомицина.
- Расти Нер-2 клетки при 37 ° С в камере инкубатора атмосфере, содержащей 5% СО 2. Использование стандартных процедур клеточной культуры для поддержания клеток, которые выращиваются в 75 см 2 колбы и субкультивировали каждый раз, когда они достигают слияния. Мы используем наши культуре клеток, пока они не достигают от 30 до 40 места, а затем отменить их.
- Подготовка анализа, когда НЕр-2 клеток в 75 см 2 колбы почти достигают слияния и поэтому готовы к присоединению анализа.
2. ДЕНЬ 1: Подготовка посевного и эпителиальные клетки
- Вымойте НЕр-2 клеток в колбе раз с фосфатом теплой Дульбеко буферного раствора (DPBS: 8 г / л NaCl, 0,2 г / л KCl, 0,2 г / л KH 2 PO 4, 0,21 г / л Na 2 HPO 4: 7H 2 O)
- Клетки инкубировали с 0,05% трипсина - ЭДТА в течение 5 минут перед добавлением свежей теплой полной среде. После свежую среду добавляют клетки ресуспендировали с помощью пипетки вверх и вниз.
- Центрифуга клеточной суспензии при 2000 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендируют гранул в DPBS и центрифуга снова.
- Ресуспендируют клеток в свежую среду с добавлением 10% сыворотки, но не содержащих антибиотики, в концентрации 2х10 5 клеток / мл.
- Семенной один миллилитр суспензии клеток в трех сетах дубликатов скважин (по одной для каждого штамма) в центре 24-луночного планшета и инкубировать пластину на ночь в культуре клеток инкубатора.
Примечание: Важно, чтобы сыворотка тщательно decomplemented и что антибиотики опущены после этой стадии. Невыполнение этого требования может убить заражение бактериями. - Привить одну изолированную колонию каждого штамма бактерий (2787, 2787Δ Аида и C600) в 5 мл LB бульоне (1% триптон, 0,5% натрия хлорида, 0,5% дрожжевого экстракта) и растут в течение ночи при 37 ° С при энергичном встряхивании (180 оборотов в минуту ).
3. ДЕНЬ 2: Заражение клетки
- Осмотрите НЕр-2 клеток под инвертированным микроскопом чтобы удостовериться, что они по крайней мере 90% сливной и не загрязнены.
- Промытые клетки с теплой DPBS и, в каждую лунку, добавить 1 мл свежей среды с добавлением 10% сыворотки, но не содержащих антибиотики. Кроме того, добавить свежую среду до трех скважин без клеток. Это будет использовано для определения общего количества бактерий в инокулята для каждого штамма.
- Измерьте оптическую плотность при 600 нм (ОП 0,600 нм) бактериальных культур. Добавить аликвоту каждой бактериальной культуры к одному набору дубликатов скважин содержащих Нер-2 клетки и одной скважины, не содержащие клеток. Как правило, мы используем объема ночной культуры соответствующее 10 6 колониеобразующих единиц (КОЕ). Это означает множественность заражения (МВД) 5:1 (бактерии: клетки). Хотя мы непосредственно использовать нашу ночь культур, иногда бывает целесообразно центрифуги бактерий и ресуспендирования их в DPBS, чтобы избежать вредного воздействия выделяемых молекул, присутствующих в ночь культур (таких как цитотоксины, например)
Примечание: МВД может колебаться в пределах 100:1 и 1:10. Высшее МВД приводит к повышению изменчивости и фона и бактерии, как правило, придерживаются пластиковые пластины. Нижняя МВД также дает высокую изменчивость. После того, как МВД будет выбран, крайне важно быть последовательным и держать эту МВД. - Инкубируйте инфицированных клеток в культуре клеток инкубаторе в течение 3 часов при 37 ° C с 5% CO 2.
Примечание: Также можно центрифуги кратко пластины на низкой скорости (например, 1000 мкг в течение 1-2 мин), для того, чтобы привести все бактерии в непосредственном контакте с клетками. Это дополнительные преимущества синхронизации инфекции, а также позволив короткий инкубационный раз (всего за 15-30 мин). - Удаление среды из инфицированных клеток и промыть клетки 3 раза теплой DPBS. На данном этапе, приверженцем бактерий обычно можно увидеть со стандартным микроскоп и мы регулярно выполнять эту проверку.
- Лизировать клетки и отделить придерживался бактеteria, добавьте 100 мкл 1% Тритон Х-100 в каждую лунку содержащих клеток. Другие моющие средства могут быть использованы (например, сапонины, например).
- Инкубируйте клетки в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем добавить 900 мкл LB среде.
- Аккуратно гомогенизации суспензий повторными вверх-вниз пипетки. Скважин без клеток, содержащих посевной аналогичным мягко гомогенизации.
Примечание: Некоторые бактерии могут быть слишком чувствительны к моющим средством, в этом случае мы отделить эпителиальных клеток при инкубации с 0,05% трипсина - ЭДТА в течение 20 мин при 37 ° C. Клетки вместе с наклеенными бактерий также могут быть Царапины от скважин с кончика пипетки. - Подготовка серийного 10-кратного разведения суспензии бактерий и придерживался посевной использованием бульона LB и пластины 100 мкл от 3 разведения (как правило, 1:1000, 1:10000 и 1:100000 разведения) на LB агар и инкубируют в течение ночи при 37 ° C .
4. ДЕНЬ 3: КОЕ подсчета и представления данных.
- Граф колонии на пластинах и подсчитать количество КОЕ придерживался бактерий и посевного материала путем усреднения каждой серии разведений. Только между пластинами с 10-300 колоний следует.
5. Представитель результаты:
В следующей таблице приведены типичные результаты подсчета КОЕ придерживался бактерий и прививочный материал от 3 эксперименты в разные дни:
Результаты могут быть представлены непосредственно в качестве придерживался КОЕ, как показано на Рисунке 1A. С посевной размеры могут варьироваться от штаммов из-за различий в темпах роста или пипетки ошибки, часто бывает целесообразно, чтобы сообщить о результатах в процентах от придерживался бактерий. Процент придерживался бактерии могут быть рассчитаны путем деления числа КОЕ придерживался бактерий на число КОЕ в посевной, как показано на Рисунке 1B. Выполняя повторных измерений ANOVA и Бонферрони пост-тестов, чтобы сравнить все столбцы рис 1B, мы видим, что Существуют значительные различия (р <0,05) между 2787 и 2787Δ Аида, а также между 2787 и C600, но никакого существенного различия между 2787Δ Аида и C600.
Рисунок 1. Представление результатов в виде КОЕ придерживался бактерий () или процент придерживался бактерий (Б)
Процент приверженности наблюдается часто сильно зависит от экспериментальной установки (и, в меньшей степени, от экспериментатора). Особенно важными являются МВД и число моет, так что процент не следует буквально толковать.
Бактерий в посевной иногда может расти гораздо быстрее, чем бактерии в присутствии клеток, перекос размер посевной по сравнению с реальным общее число бактерий в скважинах с клетками. Чтобы смягчить эту проблему, рекомендуется либо: (я) используют колодцы с ячейками для определения посевного: НЕр-2 клетки высевают в дополнительных хорошо и инфицированных. В конце теста, вместо того, чтобы отбросить супернатант и мытье, 100 мкл 10% Triton X-100 добавлен к колодцу. Лизировать клетки и лизат содержащая придерживался и не придерживался бактерий осторожно перемешать путем повторяющихся вверх-вниз пипетирования;. ИЛИ (II) собирают супернатанты инфицированных клеток в конце анализа, а также из супернатантов DPBS моет и определить число КОЕ в эти объединенные супернатанты. Это даст число КОЕ не-придерживался бактерий. Процент придерживался бактерии могут быть затем рассчитывается путем деления числа КОЕ придерживался бактерий путем добавления число КОЕ в придерживалась и не придерживается бактерий.
Чтобы проиллюстрировать надежность анализа, мы можем сравнить это с протоколом анализа осуществляется с S4074, клей патогенный штамм свиного из Actinobacillus pleuropneumoniae 7, инкубировали с клетками из недавно созданного трахеи клеточной линии поросенок, НПТР 8. Помимо различий в средствах массовой информации, необходимых для роста бактерий и клеток, с той лишь разницей, что бактерии используются для инфекции с экспоненциально растущей культурой, а не от стационарной фазы ночной культуры. С А. pleuropneumoniae это тоже очень важно уважать МВД 10:1 и не более 3 часов инфекции, в противном случае выделение токсинов будет вызывать гибель клеток и исказить результаты. Кроме того, этот штамм A. pleuropneumoniae легко придерживаться пластик, поэтому важно использовать сливной клеток и проверить визуально, что клетки не шелушение прочь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает стандартные бактериального анализа соблюдения, которые могут быть модифицированы для изучения инвазии (например, с использованием гентамицина защиты анализа 3). Подсчет колониеобразующих единиц позволяет количественного определения, по сравнению с подходами, опираясь на стандартные методы визуализации под микроскопом, такие, как окрашивание Гимза. Последний дает только качественная зрения адгезии, но часто полезным дополнением, поскольку она может дифференцировать различные модели адгезии и дать mechanistical понимание 9. Например Гимза выступал с инокулятом 10 7 КОЕ в 2787 показан на рисунке 2 и указывает диффузной адгезии по всей поверхности клетки, характерные для диффузно Придерживаясь кишечной палочки 10.
Несмотря на количественную сторону этого протокола, следует подчеркнуть, что результаты, как правило, переменной. Существует довольно постоянная разница между положительными и отрицательными управления, с отрицательным контролем обычно имеющие между 10 - и 100-кратное более низкие уровни сцепления, чем положительного контроля. Но изо дня в день, процент сцепления может изменяться до 2 раз. Поэтому часто рекомендуется использовать 2:58 повторить в эксперименте, план несколько экспериментов и выполнить статистический анализ с использованием повторных измерений или парные тесты (либо ANOVA или Т-критерий Стьюдента).
Еще одним ключевым моментом является моет после адгезии бактерий. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не отделить эпителиальных клеток. Если клетки шелушиться, то у вас будет меньше придерживался бактерии в том, что хорошо. Более или менее моющие средства могут быть использованы и количество бактерий придерживался очень коррелирует с числом моет (обычно между 2 и 4) и сильно зависит от того, как экспериментатор выполняет стирок. Минимальное количество моет, который позволяет низкий фон должен быть использован. Не важно, сколько моет выбраны, это крайне важно использовать столько же моет для всех скважин и повторить те же жесты каждый раз мыть не выполняется.
Рисунок 2. Гимза окрашивания бактерий E. палочки штамма 2787 придерживался НЕр-2 клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа в лаборатории авторов поддерживается грантами от естествознания и техники Научно-исследовательский совет Канады, Канада института исследований в области здравоохранения и Канаде исследований кафедр программы. JL поддерживает общение с Groupe d'Этюд де Белки Membranaires (GEPROM) через финансирование из Fonds по исследованиям ан Sante Квебека.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-054 | |
| DDPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-148 | |
| 24 well plates | Corning | 3337 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
References
- Kline, K. A.
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R.
- Elsinghorst, E. A.
- Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 161-161 (2002).
- Srivastava, A., Isberg, R. R. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 179-179 (2002).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
- Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
- Jacques, M., Paradis, S. E.
- Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
- Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
- Nataro, J. P., Kaper, J. B.
- Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).
