Summary
Bu protokol, kültür hücreleri üzerine yapıştırılır birimler oluşturan bakteri kolonisi sayısının sayma oluşan basit bir bakteriyel yapışma testtir. Testin sağlam, adhesin bağımsız olarak okudu ve çeşitli varyasyonlar bakteriyel patogenezi üzerinde çalışan çoğu laboratuvarlarda kullanılır.
Abstract
Enfeksiyonlara neden, bakteri, ev sahibi kolonize gerekir. Bakteriyel patojenler, hücreleri 1 barındırmak için ek teşvik etmek için mümkün olan çeşitli moleküller veya yapıları ifade eder. Bu adhezinleri konak hücre yüzey reseptörleri veya bakteri ve ev sahibi arasında bir köprü olarak hareket çözünür proteinler ile etkileşim güveniyor. Yapışma işgali ve / veya toksin salgılanması önce kritik bir ilk adım, bu nedenle bakteriyel patogenezi incelenmesi gereken önemli bir olay. Ayrıca, uyulması bakteri genellikle zarif ince ayar hücresel yanıtları, 'cep mikrobiyoloji' 2 alanına doğum yapmış olan çalışmalar neden. Bakteriyel konak hücrelerine yapışma ve istila için sağlam testler, bu nedenle bakteriyel patogenezi çalışmalarda kilit rol oynayan ve uzun birçok öncü laboratuarlar 3,4 kullanılmıştır . Bu testler bakteriyel patogenezi üzerinde çalışan laboratuvarlar tarafından uygulanmaktadır.
Burada, belirli bir adhesin katkıları gösteren standart bir bağlılık tahlil açıklar. Biz, Escherichia coli suşu 2787 5, Diffüz bağlılık (AIDA) ile ilgilendim Autotransporter Adhesin ifade eden bir insan patojenik kullanın . Kontrol olarak, Aida gen, 2787Δ aida (F. Berthiaume ve M. Mourez, yayınlanmamış), ve E. ticari bir laboratuvar suşu yoksun bir mutant suşu coli, C600 (New England Biolabs). Bakteriler yaygın olarak kullanılan HEp-2 insan epitel hücre hattı hücrelerinde uymak bırakılır. Bu testte, 6 önce, daha az yoğun tarif edilmiştir .
Protocol
1. Ön: Bakteriyel suşlar ve epitel hücreleri.
Hücre ve bakteri manipülasyonlar laminer akış kaputu altında aseptik yapılmaktadır.
- Taze E. izole coli suşlarının 2787, 2787Δ aida C600 gliserol stokları Lysogeny Broth (LB) agar plakları (% 1 Tripton,% 0.5 sodyum klorür,% 0.5 maya özü,% 1.5 agar) ve 37 büyümeye ° C Tayininde değişkenliği en aza indirmek için, taze kaplama suşlar her zaman kullanmak ve sadece birkaç hafta maksimum 4 ° C kapalı Petri kapları suşları tutmak için tavsiye edilir.
- Yüksek glukoz Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta (DMEM) Kültür HEp-2 hücreleri (ATCC CCL-23)% 10 ısı inaktive sığır serum (ısı inaktivasyonu 56 ° C de 30 dakika süreyle yapılır) ile desteklenmiştir. Rutin kültür sırasında biz de 10 U / ml penisilin ve 10 mg / ml streptomisin ekleyin.
- 37 Hep-2 hücreleri büyütün ° C% 5 CO 2 içeren bir atmosfere sahip bir hücre inkübatör. 75 cm 2 matara ve izdiham ulaşmak pasajlandı her zaman yetiştirilen hücreler, korumak için standart hücre kültürü yöntemleri kullanın. Biz kültür hücreleri 30 ila 40 pasajlar ulaşana kadar kullanın ve daha sonra atın.
- 75 cm 2 balonuna HEp-2 hücreleri neredeyse izdiham ulaşan ve bu nedenle bir bağlılık testi için hazır olduğunuzda bir test hazırlayın.
2. 1. GÜN: inokulum hazırlanması ve epitel hücreleri
- 8 g / L NaCl, 0,2 g / L KCl, 0.2 g / L KH 2 PO 4, 0.21 g / L Na 2 HPO 4:: 7H sıcak Dulbecco'nun Kullanıcı fosfat (DPBS tuzlu tamponlu ile bir kez balondaki HEp-2 hücreleri yıkayın 2 O)
- Taze sıcak tam orta eklemeden önce 5 dakika boyunca EDTA hücrelerin% 0.05 tripsin ile inkübe edilir. Taze orta eklendikten sonra, hücreler yukarı ve aşağı pipetleme tarafından yeniden süspanse.
- 2.000 rpm'de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu Santrifüj ve DPBS pelet tekrar süspansiyon haline getirin ve tekrar santrifüj.
- % 10 serum ile desteklenebilir ama 2x10 5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon, antibiyotik içeren taze orta hücreleri yeniden süspanse edin.
- Tohum 24 plaka merkezi yinelenen kuyuları (her zorlanma biri) üç set hücre süspansiyonu mililitre ve geceleme bir hücre kültürü inkübatörde plaka kuluçkaya yatmaktadır.
Not: serum iyice decomplemented ve bu antibiyotikler bu aşamadan sonra ihmal edildiği önemlidir. Bunu yapmazsanız, enfeksiyona yol açan bakterileri öldürür. - 5 ml (% 1 Tripton,% 0.5 sodyum klorür,% 0.5 maya özü) LB suyu her bakteri suşu izole koloni (2787, 2787Δ aida ve C600) İnokülasyon ve 37 o gecede büyümek ° C (180 rpm iyice sallanarak .)
3. 2. GÜN: hücrelerin Enfeksiyon
- Ters bir mikroskop altında en az% 90 konfluent ve kontamine olduğunu tespit etmek için HEp-2 hücreleri kontrol edin.
- Her iyi sıcak DPBS ve hücreler yıkanmış, 1 ml% 10 serum ile desteklenmiş taze orta fakat antibiyotik içeren. Taze orta hücreleri olmaksızın üç kuyu da ekleyebilirsiniz. Bu her bir suş için inokulum toplam bakteri sayısını belirlemek için kullanılır.
- Bakteri kültürleri, 600 nm (OD 0,600 nm) optik yoğunluk ölçülür. Hep-2 hücreleri içeren yinelenen kuyuların bir dizi ve bir de içeren hücrelerin her bakteri kültürü bir kısım ekleyin. Genellikle, biz 10 6 koloni oluşturan birim (kob) karşılık gelen bir gecede kültür hacmi kullanın. (: Hücrelerinin bakteriler) Bu bir enfeksiyon 05:01 çokluğu (İçişleri Bakanlığı) temsil eder. Biz doğrudan bir gecede kültürler kullanmalarına rağmen, (örneğin cytotoxins olarak, örneğin) bakteri gece kültürlerde salgılanan moleküllerin zararlı etkilerini önlemek için santrifüj ve DPBS onları tekrar süspansiyon bazen tavsiye edilir
Not: İçişleri Bakanlığı 100:1 ve 1:10 arasında değişebilir. Yüksek İçişleri Bakanlığı, yüksek değişkenliğini ve arka plan verim ve bakteri plaka plastik sopa eğiliminde olacaktır. İçişleri Alt yüksek değişkenlik verir. Bir İçişleri Bakanlığı seçildikten sonra, tutarlı olması ve bu İçişleri Bakanlığı tutmak zorunludur. - , 37 ° 3 saat enfekte hücreleri hücre kültürü inkübatörde inkübe ° C,% 5 CO 2.
Not: Bu bakteri hücreleri ile doğrudan temas halinde getirmek amacıyla, kısa bir süre düşük hızda (örneğin 1.000 xg 1-2 dakika) plaka santrifüj da mümkündür. Bu enfeksiyon senkronize da yarar vardır ve kısa inkübasyon süreleri (15-30 dakika kadar az) sağlayan. - Enfekte hücrelerden orta çıkarın ve sıcak DPBS hücreleri 3 kere yıkayın. Bu aşamada, yapışkan bakteri genellikle standart bir mikroskop ile görülebilir ve biz rutin olarak bu onay gerçekleştirmek.
- Olmuş akyuvarlar ve yapıştırılır bac ayırmak içinmalıdır, Triton X-100 her biri için% 1 100 ul eklemek de içeren hücreler. Diğer deterjanlar (örneğin saponin gibi) kullanılabilir.
- Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve sonra 900 LB ul orta ekleyin.
- Süspansiyonlar pipetleme yukarı ve aşağı tekrar hafifçe karıştırılır. Inokulum içeren hücreler olmadan kuyu benzer hafifçe homojenize edilir.
Not: C. Bazı bakteriler, bu durumda% 0.05 tripsin ile inkübasyon epitel hücreleri ayırmak, deterjan çok hassas olabilir - EDTA 20 dakika süreyle 37 ° Ile birlikte uyulması bakteri hücreleri de bir pipet ile kuyulardan kazınmış olabilir. - 3 LB agar dilüsyonları 1:1,000, 1:10,000 ve 1:100,000 dilüsyonları (genellikle) LB suyu ve plaka 100 ul kullanarak yapıştırılır bakteri ve inokulum süspansiyonlar seri 10 kat dilüsyonlarının hazırlayın ve 37 ° gece inkübe ° C .
4. 3. GÜN: kob sayma ve veri sunumu.
- Plakalar kolonileri sayın ve her dizi dilüsyonlarının ortalamasını alarak, uyulması bakteri ve inokulum kob sayısını hesaplamak. Sadece plakaları ile 10-300 koloniler arasında sayılmalıdır.
5. Temsilcisi sonuçları:
Aşağıdaki tabloda, uyulması bakteri ve 3 farklı günlerde yapılan deneyler inokulum sayımı kob tipik sonuçları göstermektedir:
Şekil 1A gösterildiği gibi sonuçları, doğrudan kob yapıştırılır rapor edilebilir. Inokulum boyutları, büyüme oranlarındaki farklılıklar veya pipetleme hataları nedeniyle suşları arasında değişebilir bu yana, uyulması bakteri yüzdesi olarak sonuçlarını rapor için genellikle tavsiye edilir. Şekil 1B gösterildiği gibi yapıştırılır bakterilerin yüzde inokulum mikroorganizma sayısına göre uyulması bakteri mikroorganizma sayısına bölünmesiyle hesaplanır. Şekil 1B tüm sütunları karşılaştırmak için tekrarlanan ölçümler ANOVA ve Bonferroni post-test yaparak, aida 2787 ve 2787Δ arasında önemli farklılıklar (p <0.05) yanı sıra 2787 ve C600 arasında olduğunu, ancak anlamlı bir fark 2787Δ Aida ve C600 arasında.
Şekil 1 uyulması bakteri kob (A) veya yapıştırılır bakteri yüzdesi (B) gibi sonuçlar Temsilciliği
Gözlenen bağlılığın yüzde genellikle deneysel çok bağımlı set-up (ve bir dereceye kadar, deneyci). Özellikle önemli olan İçişleri Bakanlığı ve yıkar sayısı yüzdesi anlamıyla yorumlanmalıdır olmamalıdır.
Inokulum bakteriler bazen bakteri hücreleri ile kuyu gerçek toplam sayısı ile karşılaştırılması inokulum büyüklüğü halde, hücre varlığında bakteriler çok daha hızlı büyüyebilir. Bu sorunu hafifletmek için, ya da tavsiye edilir: HEp-2 hücreleri iyi ek bir numaralı seribaşı ve enfekte: (i) hücreleri ile inokulum belirlemek için kuyu kullanabilirsiniz. Testin sonunda, At yerine atarak süpernatant ve çamaşır 100 ul,% 10 Triton X-100 de eklenir. Olmuş akyuvarlar ve yapıştırılır ve non-uyulması bakteri içeren lizat yavaşça tekrarlanan yukarı ve aşağı pipetleme homojenize veya, (ii) testin sonunda süpernatantlar enfekte olmuş hücreleri toplamak gibi süpernatantlar DPBS yıkar ve bu havuzlu Süpernatantları mikroorganizma sayısını belirlemek. Bu kob olmayan uyulması bakteri sayısı verecektir. Uyulması bakteri yüzdesi sonra yapıştırılır ve non-uyulması bakteri mikroorganizma sayısının yanı sıra uyulması bakteri mikroorganizma sayısına bölünmesiyle hesaplanır.
Testinin sağlamlığını göstermek için, kısa bir süre önce kurulan trakeal piglet hücre hattı, NPTr 8 hücreleri ile inkübe S4074 ile yapılan tahlil, Actinobacillus pleuropneumoniae 7 yapışkan bir domuzlara patojenik, bu protokolü karşılaştırın. Bakteri ve hücrelerin büyüme için gerekli ortam farklılıkları bir yana bırakırsak, tek fark, bakteri enfeksiyonu için kullanılan sabit bir fazlı gecede kültür katlanarak büyüyen bir kültür ve bu. A. pleuropneumoniae aksi toksinlerin salgılanması hücre ölümüne neden olacak ve sonuçlar önyargı, bir İçişleri Bakanlığı 10:01 saygı ve enfeksiyon 3 saati geçmemelidir de çok önemlidir. A. ek olarak, bu gerginlik konfluent hücreleri ve hücrelerin dökülmesi kapalı olmadığını görsel doğrulamak için önemli böylece pleuropneumoniae plastik kolayca yapışabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol işgali çalışma (gentamisin koruma tahlil 3 kullanarak) modifiye edilebilir bir standart bakteriyel aderans deneyi açıklar. Koloni oluşturan birim sayma, Giemsa boyama gibi yaklaşımlar, mikroskop altında standart görselleştirme teknikleri dayanarak ile karşılaştırıldığında, ölçme sağlar. İkincisi, sadece yapışma niteliksel bir görünüm verir ama yapışma çeşitli desenler farklılaştırmak ve mechanistical anlayışlar vermek 9 yılından bu yana sık sık yararlı bir tamamlayıcıdır. Örneğin bir Giemsa, 2787, 10 7 kob inokülum ile yapılan leke Şekil 2'de gösterildiği gibi faktörler konusunda bağlılık Escherichia coli 10 karakteristik tüm hücre yüzeyinde dağınık yapışma gösterir .
Bu protokolün nicel yönü rağmen, sonuçları genellikle değişken olduğu vurgulanmalıdır. Yapışma ve pozitif kontrollere göre 100 kat daha düşük seviyelerde negatif kontrol genellikle 10 arasında olan pozitif ve negatif kontroller arasında oldukça sabit bir fark yoktur. Ama her geçen gün, yapışma oranı 2 kat kadar değişebilir. Bu nedenle, 02:58 Deneme başına çoğaltmak pek çok deney planı ve tekrarlayan ölçümler veya eşleştirilmiş testleri (veya ANOVA ve Student t testi) kullanılarak istatistiksel analizler gerçekleştirmek için genellikle tavsiye edilir.
Bir diğer önemli nokta, bakteri yapışma sonra yıkar. Epitel hücreleri ayırmak için değil alınmalıdır. Eğer çok iyi hücrelerin sıyrılmış kapalı az uyulması bakteri olacaktır. Daha fazla veya daha az yıkama kullanılabilir ve uyulması bakteri sayısı çok yıkar sayısı (genellikle 2 ve 4 arasında) ile korele ve deneyci yıkar nasıl performans büyük ölçüde bağlıdır. Düşük bir arka plan sağlar yıkar en az sayıda kullanılmalıdır. Birçok yıkar nasıl seçilir olursa olsun, tüm kuyuları için yıkar aynı sayıda istihdam ve aynı jestleri bir yıkama yapılır her zaman tekrar etmek büyük önem taşımaktadır.
E. bakterilerin Şekil 2. Giemsa boyama coli suşu 2787 HEp-2 hücreleri yapıştırılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Kurumu, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü ve Kanada Araştırma Sandalyeler programı hibe yazarların laboratuarlarda çalışmalar desteklenmektedir. JL Viyana de Recherche en Sante du Quebec fon yoluyla Groupe d'Etüt des Protéines Membranaires (GEPROM) bir burs ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-054 | |
| DDPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-148 | |
| 24 well plates | Corning | 3337 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
References
- Kline, K. A.
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R.
- Elsinghorst, E. A.
- Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 161-161 (2002).
- Srivastava, A., Isberg, R. R. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 179-179 (2002).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
- Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
- Jacques, M., Paradis, S. E.
- Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
- Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
- Nataro, J. P., Kaper, J. B.
- Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).
