Summary
Detta protokoll är en enkel bakterie vidhäftning analysen består i att räkna antalet bakterier kolonibildande enheter som följs på odlade celler. Analysen är robust, studerade oberoende av adhesin, och många varianter används i de flesta laboratorier som arbetar på bakteriell patogenes.
Abstract
Att orsaka infektioner måste bakterier kolonisera sin värd. Sjukdomsalstrande bakterier uttrycka olika molekyler eller strukturer kan främja anknytning till värdceller 1. Dessa adhesinerna förlitar sig på interaktion med ytan värdcell receptorer eller lösliga proteiner fungerar som en bro mellan bakterier och värd. Vidhäftning är ett avgörande första steg före invasionen och / eller utsöndring av toxiner, därför är det en viktig händelse som ska studeras i bakteriell patogenes. Dessutom följs bakterier inducerar ofta utsökt finjusteras cellulära svaren, de studier som har fött på "cellulär mikrobiologi" 2. Robust testmetoder för bakteriell vidhäftning på värdceller och deras invasion spelar därför en nyckelroll i bakteriell patogenes studier och har länge använts i många pionjär laboratorier 3,4. Dessa analyser är nu praktiseras av de flesta laboratorier arbetar på bakteriell patogenes.
Här beskriver vi en standard följs analys visar bidraget från en viss adhesin. Vi använder Escherichia coli stam 2787 5, en humanpatogena stam uttrycka Autotransporter Adhesin Deltar i Diffus Anslutning (AIDA). Som en kontroll, använder vi en mutant stam saknar aida genen, 2787Δ aida (F. Berthiaume och M. Mourez, opublicerat), och ett kommersiellt laboratorium stam av E. coli, C600 (New England Biolabs). Bakterierna är kvar att följa celler från vanliga HEp-2-mänskliga epitelceller linje. Denna analys har varit mindre utförligt beskrivits tidigare 6.
Protocol
1. Preliminära: Bakteriestammar och epitelceller.
Manipulationer av celler och bakterier utförs aseptiskt, i dragskåp huva.
- Färskt isolera E. coli stammar 2787, 2787Δ Aida, och C600 från glycerol lager på Lysogeny buljong (LB) agarplattor (1% trypton, 0,5% natriumklorid, 0,5% jästextrakt, 1,5% agar) och växa vid 37 ° C. För att minimera variabiliteten i analysen är det tillrådligt att alltid använda färska pläterade stammar och för att hålla stammar vid 4 ° C på förseglade Petri tallrikar bara för högst ett par veckor.
- Kultur HEp-2 celler (ATCC CCL-23) i höga glukos Dulbecco ändrade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% värmeinaktiverad bovint serum (värmeinaktivering utförs vid 56 ° C i 30 min). Under rutin kultur vi även lägga till 10 U / ml penicillin och 10 mikrogram / ml streptomycin.
- Grow Hep-2 celler vid 37 ° C i en cell inkubator med en atmosfär som innehåller 5% CO 2. Använd standardrutiner cellodling att bibehålla celler som odlas i 75 cm 2 kolvar och subkultiveras varje gång de når sammanflödet. Vi använder vår odlade celler tills de når 30 till 40 stycken och sedan kasta dem.
- Förbered en analys när HEp-2-celler i ett 75 cm 2-kolv är nästan når sammanflödet och därför är redo för en anslutning analys.
2. DAG 1: Förbereda inokulatet och epitelceller
- Tvätta HEp-2-celler i kolven en gång med varmt Dulbecco är fosfatbuffrad saltlösning (DPBS: 8 g / L NaCl, 0,2 g / L KCl, 0,2 g / L KH 2 PO 4, 0,21 g / L Na 2 HPO 4: 7H 2 O)
- Cellerna inkuberas med 0,05% trypsin - EDTA i 5 minuter innan du tillsätter färska varma komplett medium. Efter färska medelstora läggs, är de celler återsuspenderade genom att pipettera upp och ned.
- Centrifugera cellsuspension vid 2000 rpm i 5 min och resuspendera pellets i DPBS och centrifugera igen.
- Resuspendera cellerna i färska medelstora kompletterad med 10% serum men som inte innehåller antibiotika, i en koncentration av 2x10 5 celler / ml.
- Utsäde en milliliter cellsuspensionen i tre uppsättningar av två brunnar (en för varje stam) i mitten av en 24-brunnar och inkubera plattan över natten i en cell kultur inkubator.
OBS: Det är viktigt att serum grundlig decomplemented och att antibiotika är utelämnade efter detta skede. Underlåtenhet att göra detta kan döda infekterande bakterier. - Inokulera en isolerad koloni av varje bakteriestam (2787, 2787Δ Aida och C600) i 5 ml LB buljong (1% trypton, 0,5% natriumklorid, 0,5% jästextrakt) och växa över natten vid 37 ° C med kraftig skakning (180 rpm ).
3. DAG 2: Infektion av celler
- Inspektera HEp-2-celler under ett inverterat mikroskop för att fastställa att de är minst 90% sammanhängande och inte har förorenats.
- Tvättade celler med varma DPBS och i varje brunn, tillsätt 1 ml färsk medelstora kompletteras med 10% serum men som inte innehåller antibiotika. Lägg även till färska medelstora till tre brunnar utan celler. Detta kommer att användas för att bestämma det totala antalet bakterier i inokulatet för varje stam.
- Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD 0,600 nm) av bakteriekulturer. Lägg en del av varje bakteriekultur till en uppsättning av två brunnar som innehåller Hep-2 celler och en brunn som inte innehåller celler. Vanligtvis använder vi en volym på natten kultur motsvarande 10 6 kolonibildande enheter (CFU). Detta innebär en mångfald av infektion (MOI) i 5:1 (bakterier: celler). Även om vi direkt använda vår natten kulturer, är det ibland lämpligt att centrifugera bakterier och resuspendera dem DPBS att undvika skadliga effekter av utsöndrade molekyler som finns i natten kulturer (t.ex. cellgifter, till exempel)
Obs: MOI kan variera mellan 100:1 och 01:10. Högre MOI ger större variabilitet och bakgrund och bakterier tenderar att hålla sig till plasten i plattan. Lägre MOI ger också hög variabilitet. När ett MOI som väljs, är det viktigt att vara konsekvent och hålla denna MOI. - Inkubera de infekterade cellerna i cellkultur inkubator för 3 timmar vid 37 ° C med 5% CO 2.
Obs: Det är också möjligt att centrifugera kort plattan i låg hastighet (t.ex. 1000 xgi 1-2 min), för att få alla bakterier i direkt kontakt med cellerna. Detta har den extra fördelar av synkronisera infektion, och låta kortare inkubationstiderna (så lite som 15-30 min). - Ta bort mediet från den infekterade celler och tvätta cellerna 3 gånger med varmt DPBS. I detta steg kan anhängare bakterier brukar ses med en vanlig mikroskop och vi rutinmässigt utför denna kontroll.
- För att Lyse cellerna och ta bort följs bacterier, tillsätt 100 ìl av 1% Triton X-100 till varje brunn som innehåller celler. Andra rengöringsmedel kan användas (exempelvis saponin till exempel).
- Inkubera cellerna i 10 min i rumstemperatur och sedan lägga till 900 ìl LB medium.
- Försiktigt homogenisera de upphävanden av upprepade upp-och-ner pipettering. Brunnarna utan celler som innehåller inokulatet är lika försiktigt homogeniseras.
OBS: Vissa bakterier kan vara för känslig för tvättmedel i så fall vi bort epitelceller genom inkubering med 0,05% trypsin - EDTA i 20 minuter vid 37 ° C. Celler med följs bakterier kan också skrapas från brunnarna med en pipettspetsen. - Förbered seriella 10-faldigt utspädningar av suspensioner av följs bakterier och inokulatet med LB buljong och platta 100 l från 3 spädningar (vanligtvis 1:1,000, 1:10,000 och 1:100,000 utspädningar) på LB-agar och inkubera över natten vid 37 ° C .
4. DAG 3: cfu räkna och presentation av data.
- Räkna kolonierna på plattorna och beräkna antalet cfu på följs bakterier och inokulatet som genomsnittet av varje serie spädningar. Endast plattor med mellan 10-300 kolonier ska räknas.
5. Representativa resultat:
Följande tabell visar typiska resultat av cfu rösträkningen följs bakterier och inokulat från 3 experiment utförts på olika dagar:
Resultaten kan redovisas direkt som följs CFU, som visas i Figur 1A. Eftersom inokulatet storlekar kan variera mellan stammar på grund av skillnader i tillväxt eller pipettering fel, är det ofta lämpligt att redovisa resultatet i procent av efterlevs bakterier. Andelen levt bakterier kan beräknas genom att dividera antalet cfu av anslutit bakterier genom att antalet CFU av inokulatet, som visas i figur 1B. Genom att utföra en återkommande åtgärd ANOVA och Bonferroni post-tester för att jämföra alla kolumner i figur 1B, kan vi se att det finns betydande skillnader (p <0,05) mellan 2787 och 2787Δ Aida, samt mellan 2787 och C600, men ingen signifikant skillnad mellan 2787Δ Aida och C600.
Figur 1. Representation av resultaten som cfu av följs bakterier (A) eller andelen följs bakterier (B)
Andelen observerade följsamhet är ofta mycket beroende av den experimentella set-up (och, i mindre utsträckning, om försöksledaren). Särskilt viktiga är MOI och antalet tvättar, så procent bör inte bokstavligt tolkas.
Bakterierna i inokulatet kan ibland växa mycket snabbare än de bakterier i närvaro av celler, skevning storleken på inokulatet i jämförelse med det verkliga totala antalet bakterier i brunnar med celler. För att lindra detta problem, rekommenderas det att antingen (i) använda brunnar med celler för att fastställa inokulatet: HEp-2-celler är seedade i en extra bra och infekterad. I slutet av analysen, i stället för att kassera supernatanten och tvättning, 100 l 10% Triton X-100 läggs till brunnen. Cellerna kommer lyseras och lysat innehåller följs och icke-efterlevs bakterier är försiktigt homogeniseras genom upprepade upp-och-ner pipettering,. Eller (ii) samla in supernatanterna av infekterade celler i slutet av analysen, liksom supernatanterna från den DPBS tvättar och bestämma antalet CFU i de poolade supernatanterna. Detta kommer att ge antalet CFU icke-efterlevs bakterier. Andelen levt bakterier kan sedan beräknas genom att dividera antalet cfu av anslutit bakterier genom tillsats av antalet cfu på efterlevs och icke-efterlevs bakterier.
För att illustrera robustheten i analysen kan vi jämföra detta protokoll med analysen utförs med S4074, en självhäftande svin sjukdomsframkallande stam av Actinobacillus pleuropneumoniae 7, inkuberas med celler från ett nyligen etablerat trakeal smågris cellinje, NPTr 8. Bortsett från skillnader i media krävs för tillväxt av bakterier och celler, är den enda skillnaden att de bakterier som används för infektion är från ett exponentiellt växande kultur, och inte från en stationär fas natten kultur. Med A. pleuropneumoniae det är också mycket viktigt att respektera en MOI på 10:01 och att inte överskrida 3 timmar för infektion, annars utsöndringen av gifter kommer att orsaka celldöd och snedvrida resultaten. Dessutom har denna stam av A. pleuropneumoniae kan lätt ansluta sig till plasten så det är viktigt att använda konfluenta celler och kontrollera visuellt att cellerna inte är avskedandet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en vanlig bakteriell följsamhet analys som kan ändras för att studera invasion (t.ex. med gentamicin skydd analys 3). Räkningen kolonibildande enheter tillåter kvantifiering, i jämförelse med metoder beroende på standard visualiseringstekniker under ett mikroskop, som Giemsa färgning. Den senare ger endast en kvalitativ bild av vidhäftning, men är ofta ett bra komplement eftersom det kan skilja olika mönster av vidhäftning och ger mechanistical insikter 9. Till exempel en Giemsa fläck utförs med ett inokulum av 10 7 CFU av 2787 visas i Figur 2 och indikerar en diffus vidhäftning på hela cellytan, typiska för Diffust anslutna Escherichia coli 10.
Trots den kvantitativa aspekten av detta protokoll, bör det understrykas att resultaten är oftast rörliga. Det är en ganska konstant skillnad mellan positiva och negativa kontroller, med negativ kontroll normalt att ha mellan 10 - och 100-faldig lägre vidhäftning än positiva kontroller. Men från dag till dag, kan andelen vidhäftningsförmåga variera upp till 2-faldigt. Därför är det ofta lämpligt att använda två till tre likadana per försök, planera flera experiment och utföra statistiska analyser med hjälp av upprepade mätningar eller parade test (antingen ANOVA eller Students t-test).
En annan viktig punkt är tvättar efter vidhäftning av bakterier. Man måste vara försiktig att inte ta bort epitelceller. Om cellerna kasta av sig då det blir mindre följs bakterier i så bra. Mer eller mindre tvättar kan användas och antalet följs bakterier är mycket korrelerad med antalet tvättar (vanligtvis mellan 2 och 4) och beror mycket på hur försöksledaren utför tvättar. Det minsta antalet tvättar som gör att en liten bakgrund bör användas. Oavsett hur många tvättar väljs är det av yttersta vikt att anställa lika många tvättar för alla brunnar och upprepa samma rörelser varje gång en tvätt utförs.
Figur 2. Giemsa färgning av bakterier från E. coli stam 2787 följt HEp-2 celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet i laboratorier av författarna stöds av bidrag från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada, Kanada Institutes of Health Research, och Kanada forskning Stolar programmet. JL stöds av ett stipendium från Groupe d'Étude des Protéines Membranaires (GEPROM) genom finansiering från Fonds de Recherche en Santé du Quebec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-054 | |
| DDPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-148 | |
| 24 well plates | Corning | 3337 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
References
- Kline, K. A. Bacterial adhesins in host-microbe interactions. Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. Cellular microbiology emerging. Science. 271, 315-315 (1996).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).
- Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 161-161 (2002).
- Srivastava, A., Isberg, R. R. Molecular Cellular Microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. , Academic Press. London. Vol. 31 179-179 (2002).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
- Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
- Jacques, M., Paradis, S. E. Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae. FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).
- Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
- Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
- Nataro, J. P., Kaper, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).
- Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).
