Summary
نقدم نهجا لجمع العينات موسع بكفاءة عينات الشعر من الثدييات الصغيرة بعيد المنال ، كما هو موضح لبيكا الأميركية. نحن لشرح فائدة هذا الأسلوب من خلال استخراج الحمض النووي من عينات الشعر وتضخيم عدة أنواع من المؤشرات الجزيئية التي يشيع استخدامها في دراسات البيئة البرية والمحافظة عليها.
Abstract
موسع النهج أخذ العينات الوراثية أصبحت ذات أهمية متزايدة لدراسة الحياة البرية. وقد أفاد عدد من الدراسات التي تستخدم تقنيات أخذ العينات موسع للتحقيق في علم الوراثة السكانية والديمغرافية للسكان البرية 1. وقد أثبت هذا النهج أن يكون مفيدا بشكل خاص عند التعامل مع أنواع نادرة أو بعيدة المنال 2. في حين وضعت عددا من هذه الأساليب لعينة الشعر والبراز والمواد البيولوجية الأخرى من الحيوانات آكلة اللحوم والثدييات المتوسطة الحجم ، فإنها ظلت إلى حد كبير لم تختبر في الثدييات الصغيرة بعيد المنال. في هذا الفيديو ، نقدم رواية ، رخيصة وموسع كمين الشعر تستهدف الثدييات الصغيرة an بعيد المنال ، وبيكا الأمريكية (Ochotona princeps). وصفنا العامة انشاء لكمين الشعر ، والتي تتألف من شرائط من التعبئة الشريط رتبت بطريقة تشبه الشبكة وضعت على طول طرق السفر في موطن pikas. نحن لتوضيح كفاءة كمين في جمع كمية كبيرة من الشعر الذي يمكن بعد ذلك جمعها واعادته الى المختبر. ثم نبدي استخدام نظام الذكاء الحمض النووي (Promega) لعزل الحمض النووي وتسليط الضوء على جدوى هذا الأسلوب لتضخيم المؤشرات الجزيئية يشيع استخدامها بما في ذلك النووية الصغرية وتضخيمها الأشكال المتعددة طول القطعة (AFLPs) ، تسلسل الميتوكوندريا (800bp) فضلا عن الجزيئية sexing علامة. عموما ، نحن لشرح فائدة هذا الفخ الشعر موسع الرواية كأسلوب أخذ العينات لسكان الأحياء البرية. ونحن نتوقع أن هذا النهج سوف تكون قابلة للتطبيق على مجموعة متنوعة من الثدييات الصغيرة ، وفتح مجالات التحقيق داخل العشائر الطبيعية ، مع التقليل من تأثير على الكائنات الدراسة.
Protocol
1. الشعر كمين
قبل وضع كمين ، موقعا مثاليا لابد من تحديد الموائل داخل بيكا أو المنحدر الكاحل. ويشمل هذا أكوام القش ، والتي هي مخابئ النباتات والحيوانات التي تتجمع في أواخر الصيف وكذلك scats جديدة عثر عليها في مواقع المراحيض. وتوالت الشرائط من الشريط التعبئة والتغليف (10 - 50cm في الطول) لتوفير 360 درجة على سطح لزجة ومرتبة بطريقة تشبه إلى الويب مغلف مدخل كومة القش وبيكا في (الشكل 1) أو موقع المراحيض. اعتمادا على تكوين الصخور ، يمكن استخدام قطعة من خط الصيد لدعم بنية الشعر الفخ ، ولكن هذا غالبا ما لا يكون ضروريا عند مداخل صغيرة جدا (<30cm في القطر) ، وصفا كاملا للاستخدام ويمكن الاطلاع على خط الصيد في هنري وRussello (2010) 3. يتم التحقق من الافخاخ الشعر بقدر الإمكان ، وعينات الشعر المودعة في الشريط (الشكل 2) ثم يتم جمع والمسمى. نقلها مرة واحدة مرة أخرى إلى المختبر ، تتم إزالة الشعر من الشريط اللاصق باستخدام ملقط معقم ، ونقل إلى أنابيب المبردة وتخزينها على -20 درجة مئوية حتى التلاعب أخرى. تعتبر عينات الشعر عنقودية معا على طول الشعر لكمين تنتمي إلى فرد واحد ، في حين يفترض عينات عنقودية مستقلة تنتمي إلى مختلف الأفراد. في الحالة الأخيرة ، ثم يتم وضع الشعر في أنابيب مختلفة. ويمكن في وقت لاحق سيتم اختبار هذه الافتراضات عن طريق الحمض النووي وبصمات الأصابع حسابات احتمال الهوية استنادا إلى بيانات الوراثي الصغرية.
2. استخراج الحمض النووي
منذ بيكا شعر رقيق جدا ويحتوي على لمبة صغيرة الجذرية ، أظهرنا سابقا أن هناك حاجة لا تقل عن 25 شعرات للحصول على كميات كافية من الحمض النووي لنوعية جيدة PCR التضخيم المصب 3. استخدمنا الذكاء الحمض النووي للنظام (Promega ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة) ، ونسخة معدلة بشكل طفيف من إرشادات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي من عينات الشعر. أولا ، يتم نسج عينة الشعر لأسفل في جهاز للطرد المركزي الصغرى من أجل تجنب فقدان الشعر أثناء فتح الأنبوب. ثم أعد حل الحضانة عن طريق خلط 80 ميكرولتر من محلول الحضانة مع 10μl من DTT (1M) و10μl K من بروتين (18ng/ml) أن يؤدي إلى تركيز النهائي من DTT M 0.1 و 1.8ng/ml من الحضانة K. بروتيناز الحل (100 ميكرولتر) يضاف إلى العينة والمحتضنة في 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. في غضون ذلك ، يستعد حل تحلل بإضافة 1 ميكرولتر من DTT (1M) لكل ميكرولتر 100 من تحلل العازلة ، مما أدى إلى تركيز DTT 0.01M النهائي. ثم يتم إضافة أعد حل تحلل (200 ميكرولتر) إلى نموذج ، جنبا إلى جنب مع 7 ميكرولتر من راتنج الذكاء الحمض النووي ، vortexed لمدة 3 ثوان على سرعة عالية وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ومن ثم vortexed العينة لمدة 2 ثانية ، وأدرجت في الوقوف المغناطيسي ، حيث فصل من الخرز المغناطيسي من الحل يحدث. ثم يستنشق هو الحل المتبقية والتخلص منها ، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه من راتنج المغناطيسي. ثم يتم التعامل مع العينة 100 ميكرولتر من الحل أعد تحلل ، vortexed وعاد إلى حيث تقف الفصل المغناطيسي يحدث مرة أخرى. ويستنشق المخزن تحلل والتخلص منها ، ويتم تكرار هذه الخطوة ثلاث مرات باستخدام غسل العازلة (100 ميكرولتر). تبقى بعد ذلك عينة ليجف في موقف المغناطيسي لمدة 15 دقيقة. الجاف مرة واحدة ، يتم إضافة 100 ميكرولتر من المخزن لشطف العينة والمحتضنة في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. هو vortexed العينة وإدراجها في الوقوف المغناطيسي. ثم يتم نقل محلول يحتوي الآن على الحمض النووي لeluted أنبوب 1.5 مل إيبندورف وتخزينها على -20 درجة مئوية حتى التلاعب أخرى. كما تم استخراج الحمض النووي من عينات الكبد باستخدام نظام الذكاء الحمض النووي واستخدامها كعنصر تحكم إيجابية لالتكبير PCR.
3. PCR التضخيم
ثم استخدمت في الحمض النووي التي تم الحصول عليها من كمين لدينا موسع الشعر وعينات الكبد لتضخيم مجموعة من المؤشرات الجزيئية استخداما (الصغرية ، AFLP ، الميتوكوندريا وباء السيتوكروم ZFX / ZFY علامة sexing). أجريت تقارير إتمام المشروعات باستخدام الحرارية Veriti cycler (النظم البيولوجية التطبيقية ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة) في 25 مجلدا تحتوي على ميكرولتر : 10 -- 20 نانوغرام DNA ، و 0.5 ميكرومتر لكل التمهيدي ، و 10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.3) ، 50 ملي بوكل ، 1.5 ملي MgCl 2 ، و 200 ميكرومتر dNTPs والأبقار مصل الزلال 10 μ (BSA ؛ Biolabs نيو انغلاند ، ايبسويتش ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 0.5 U الحمض النووي الذهب AmpliTaq بوليميريز (النظم البيولوجية التطبيقية). وكانت المعلمات الأمثل لركوب الدراجات مواضع الصغرية باستخدام برنامج هبوط الدراجات (10 دقيقة الى 95 درجة مئوية ، و 35 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 30 ثانية الصلب ، و 45 ثانية في 72 درجة مئوية ، تليها خطوة نهائية في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة). درجة الحرارة الصلب انخفضت بنسبة 1 درجة مئوية لكل دورة 60-55 درجة مئوية حتى تصل إلى الدورة السادسة ، وعند هذه النقطة دورات استمرت 29 المتبقية في 55 درجة مئوية. وصفت بأنها المعلمات الدراجات لشظايا الميتوكوندريا أعلاه ولكن يتكون من 35 دورات مع الصلبدرجة حرارة 50 درجة مئوية. وقد اضطلع تضخيم تعدد الأشكال المدة قطعة بعد بروتوكول لجينومات الفقاريات التي وصفها بونين 4. أخيرا ، أجري sexing الجزيئي باستخدام PCR - RFLP من ZFX / ZFY المكاني مع تقييد HinfI انزيم الهضم 5. تم تشغيل هذه المنتجات من AFLPs PCR ، الصغرية ومتواليات السيتوكروم B على محلل 3130XL ABI الجينية (النظم البيولوجية التطبيقية) ، في حين تم تشغيل هضمها ZFX / ZFX شظايا جنبا إلى جنب مع سلم غليان 100 (نيو إنجلاند Biolabs) على agarose هلام يحتوي على 3 ٪ 2.5 ٪ هلام SYBR الحمض النووي الآمن. صمة عار (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة) وتصور باستخدام الجل الأحمر التصوير الشخصية النظام (Innotech ألفا ، وسان لياندرو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) والصغرية وAFLPs تصور باستخدام Genemapper v3.7 (النظم البيولوجية التطبيقية) والحمض النووي chromatogram كان تصور باستخدام Sequencher v4.7 (جين قانون المؤسسة ، آن هاربور ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة).
4. ممثل النتائج
تم استخدام الحمض النووي المستخرج من عينات الشعر كمين تم الحصول عليها باستخدام موسع لدينا تضخيم PCR نوع مختلف من المؤشرات الجزيئية. كأساس للمقارنة ، باستخدام الحمض النووي المستخرج تم تضخيمها الى جانب عينات من الكبد عينات الشعر لدينا. وتضخمت بنجاح النووية لكلا الصغرية مواضع الشعر وعينات الكبد (الشكل 3). على الرغم من شدة إشارة كان أكبر عند استخدام عينات الكبد ، إلا أن ذلك لن يكون له أثر سلبي على تسجيل النمط الجيني (الشكل 3). وقد تحققت نتائج مماثلة عند استخدام AFLPs (الشكل 4) ، وتسلسل الحمض النووي (الشكل 5) ، وZFX / ZFY علامة sexing الجزيئية (الشكل 6).
الشكل 1. مثالا للشرك الشعر موسع حتى في كومة القش. يتم ترتيب شرائح من الشريط طوى التعبئة بطريقة واضحة على شبكة الإنترنت أن أرفق مدخل إلى كومة القش. ويستخدم قطعة من خط الصيد هنا لتقديم المزيد من الدعم لكمين الشعر.
الشكل 2. فخا الشعر الناجحة التي تحتوي على عدد كبير من الشعر عالقا في الشريط التعبئة والتغليف.
الشكل 3. ممثل chromatogram الصغرية النووي (Ocp6) 8 كما هو معروض في Genemapper v3.7 (النظم البيولوجية التطبيقية). تم الحصول على الحمض النووي من قبل كبار chromatogram تضخيم من أنسجة الكبد ، ومتخالف (354/358) في هذا الموضع. ويمثل قاع chromatogram الفردية المختلفة اظهار الوراثي متخالف (358/362) بناء على الحمض النووي المستخرج من الشعر. في حين أن إشارة chromatogram من العينة الشعر لديه أقل كثافة من عينة الكبد ، هو عدم التهديف الوراثي يتأثر سلبا نتيجة هذا الاختلاف في الإشارة.
الشكل 4 ألف chromatogram AFLP ممثل (E31T32) كما هو معروض في Genemapper v3.7 (النظم البيولوجية التطبيقية). تم الحصول على الحمض النووي من قبل كبار chromatogram تضخيم من أنسجة الكبد ، وchromatogram أسفل يمثل الحمض النووي المستخرج من الشعر.
الشكل 5. ممثل تسلسل الحمض النووي chromatogram (السيتوكروم B) كما هو معروض في Sequencher v4.7 (قانون مؤسسة جين). تم الحصول على الحمض النووي من قبل كبار chromatogram تضخيم من أنسجة الكبد ، وchromatogram أسفل يمثل الحمض النووي المستخرج من الشعر.
الشكل 6. ممثل علامة sexing الجزيئي (ZFX / ZFY) تتضخم الكبد ولكل من عينات الشعر. هذا النهج يعتمد على الملاحظة بأن كروموسوم Y يمتلك موقع تقييد HinfI في هذه المنطقة التي تفتقر للكروموسوم X. وبالتالي ، تنتج الإناث رئيسين المهاجرة شظايا من 432 سنة مضت ، بينما تنتج الذكور شظايا من 432 سنة مضت ، بي بي BP 261 و 171.
Discussion
أصبح أخذ العينات الوراثية موسع بديلا جذابا لمحاصرة الطرق التقليدية ليعيش لعدة أسباب. أولا ، من خلال جمع المواد البيولوجية بشكل مخفي (مثل البراز ، الشعر ، الريش ، واللعاب والمخاط) من الأنواع البرية ، يمكن للباحثين دراسة هذه الأنواع من دون إزعاج ، والمناولة ، أو حتى مراقبة لهم ، وبالتالي تقليل المخاطر التي يتعرض لها كل من الحيوانات والباحثين. الثانية ، وأخذ العينات الوراثية تمكن علماء البيولوجيا موسع لدراسة السكان من الأنواع النادرة وبعيد المنال ، وهي مهمة يمكن أن يثبت أن من الصعب العيش مع النهج التقليدي للاحتباس 6. والثالث ، ويمكن زيادة محتملة NGS أحجام العينات عن طريق الحد من اضطراب للحيوانات ، وجهود أخذ العينات ، والتكاليف ، مما يساعد على تقليل التحيز في تقديرات السكان المعلمات 7. هذه النقطة الأخيرة قد يكون حاسما عند التعامل مع الأنواع المهددة بالانقراض ، حيث تشير تقديرات منحازة للمعلمات السكان قد يؤدي في الإدارة غير الملائمة.
في مقالة الفيديو الحاضر نحن تصف طريقة بسيطة ، والرواية ، وغير مكلفة وموسع لعينة الثدييات الصغيرة بعيد المنال ، وذلك باستخدام بيكا الأمريكية كمثال على ذلك. علينا أن نظهر أن الحمض النووي المستخرج من الشعر ينفذ بالمثل على الحمض النووي المستخرج من عينات الكبد فيما يتعلق الصغرية ، AFLP ، وعلامات sexing الميتوكوندريا ، مما يجعل هذا الأسلوب أخذ العينات موسع بديلا جذابا للعيش أخذ العينات الملائمة أو مميتة. عموما ، فإننا نتوقع أن هذا الأسلوب سيكون مفيدا في مرحلة جمع البيانات من الدراسات السكانية والسلوكية الوراثية النادرة أو بعيد المنال نوعا من الثدييات الصغيرة ، مع التقليل من تأثيرها على الكائنات الحية تحت الدراسة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر L. إيفانز ، جرانجر B. ، Rissling D. ، سيم Z. ، غودوين A. ، K. Hayhurst وكوش دال للمساعدة في هذا المجال. K. Galbreath قدمت عينات الكبد يرجى بيكا من وادي Coola بيلا. بفضل دا سيلفا غونسالفيس وألف لارسن كاف لإجراء مناقشات مثيرة للاهتمام التي ساهمت في تصميم هذا الأسلوب أخذ العينات الوراثية موسع. وقد تم تمويل هذا العمل من جانب العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث اكتشاف كندا ، وجامعة كولومبيا البريطانية البحوث الفردية المنح أوكاناغان إلى مارس A الوطني السويسري زمالة مؤسسة العلوم الدكتوراه PBSKP3_128523 يؤيد PH. وقد أجريت هذه الدراسة في أعقاب بروتوكول الرعاية الحيوانية من جامعة كولومبيا البريطانية (رقم الشهادة : A07 - 0126).
Materials
Hair snare:
DNA extraction:
|
References
- Kendall, K. C. Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population. J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).
- Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia. Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).
- Henry, P. In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger. Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).
- Henry, P., Russello, M. A. Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares. Eur J Wildlife Res. , (2010).
- Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395. , 145-145 (2005).
- Fontanesi, L. Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci. Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).
- Piggott, M. P., Taylor, A. C. Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species. Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).
- Banks, S. C. Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material. Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).
- Litvaitis, J. A. A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails. Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).
- Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps. Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).
