Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Анализ морфологии Дендритные позвоночника в культуре нейронов ЦНС

doi: 10.3791/2794 Published: July 13, 2011

Summary

Многочисленные недавние исследования выявили мутации в синаптические белки, связанные с мозговыми патологиями. Первичная культурный нейронов коры предлагаем большую гибкость при рассмотрении последствий этих заболеваний белков, связанных с морфологией на дендритных позвоночника и подвижности.

Abstract

Дендритные шипы сайтах большинства возбуждающих связей в мозгу, и образуют постсинаптические отсеке синапсов. Эти структуры представляют собой богатый актина и было показано, что весьма динамичным. В ответ на классической пластичности Хебба, а также neuromodulatory сигналов, дендритных шипиков может изменить форму и номер, который считается критическим для уточнения нейронных цепей и обработки и хранения информации в мозге. В дендритных шипиков, сложная сеть белков внеклеточного ссылку сигналов с актином cyctoskeleton позволяет контролировать морфологию дендритных позвоночника и номер. Нейропатологических исследования показали, что количество болезненных состояний, начиная от шизофрении расстройства аутистического спектра, дисплей ненормальные дендритные морфологии позвоночника или цифр. Кроме того, недавние генетические исследования выявили мутации во многих генах, которые кодируют белки синаптических, что приводит к предположениям, что эти белки могут способствовать аберрантных пластичности позвоночника, что, в частности, лежат в основе патофизиологии этих расстройств. С целью изучения потенциальной роли этих белков в контроле дендритных морфологии позвоночника / номер, использование культурных нейронов коры обладает рядом преимуществ. Во-первых, эта система позволяет изображений с высоким разрешением дендритных шипиков в основной клетки, а также замедленная съемка живых клеток. Во-вторых, эта система в пробирке позволяет легко манипулировать функции белка путем экспрессии мутантных белков, нокдаун по конструкции shRNA или фармакологические методы лечения. Эти методы позволяют исследователям, чтобы начать анализировать роль болезней связанных белков и предсказать, как мутации этих белков может функционировать в естественных условиях.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол, описанный здесь, может использоваться для изучения морфологии дендритных позвоночника и динамика в любой первичной культурной системы.

1. Подготовка первичных корковых нейронов культур

  1. Подготовка высокой плотности коркового нейрона культур от Sprague-Dawley крыс E18 эмбрионов и культуры в глии с кондиционером бессывороточной среде 1-2.
  2. Эвтаназии одной беременной крысы (E18) в соответствии с ACUC процедур; быстро удалить матку (с плодов в нем) и место в 100 мм чашки Петри на льду.
  3. Разрежьте маткой и амниотической мембраны, удерживая плода за шею (пуповина нетронутыми) с одним щипцы, пинцеты использовать другой очистить кожу головы от конца к началу, и щели череп с острым кончиком пинцета по средней линии от задней стенки к передней.
  4. Удалите весь мозг с изогнутым пинцетом (в совок движение) и место в 100 мм чашки Петри, содержащие 10 мл ледяной Ca2 + - и Mg 2 +-свободный HBSS.
  5. Держите ствола мозга с одной щипцы, отдельных полушарий с другим пинцетом, удалите гиппокампе и полосатом теле, отдельные коры и тщательно очистить от коры ткани из мозговых оболочек.
  6. Бассейн расчлененный корковой ткани, фарш кратко и трансфер в 15 мл пробирку 4 мл подогретого трипсин / ЭДТА (0,25% трипсина, 0,53 мМ ЭДТА; HyQ трипсина из Hyclone SH30042.01); инкубировать в 37 ° С на водяной бане ~ 15 мин, удалить трипсин / ЭДТА как можно больше с одноразовой пластиковой пипетки, добавляют 1,5 мл нейронной среде.
  7. Диссоциируют усваивается тканями механически нежный пипетки с 5 мл пипетки (~ 10 ударов, во избежание создания пузырьков воздуха), добавьте 2 мл среды, давайте соглашайтесь на 30 секунд, а затем перенести 2 мл супернатанта в 15 мл трубки.
  8. Повторите шаг 6 в два раза (должно занять около ~ 15 мин общего числа).
  9. Спиновые клеточной суспензии в 200 г в течение 2 мин.
  10. Удалить супернатант (с 5 мл пипетки - не вакуумной аспирации); ослабить гранул, щелкая пальцами по нижней; ресуспендируют осадок клеток в 5 мл среды и фильтруют через 40 мкм ячейки фильтра в 50 мл трубки.
  11. Смешать 10 мкл клеточной суспензии и 10 мкл трипанового синий, граф жизнеспособных клеток (трипанового синего исключения) с гемоцитометр.
  12. Типичный выход: 5 х 10 6 клеток / мозга; разбавить до требуемой плотности (например, 1,5 х 10 6 клеток / мл) для металлизации.
  13. Заполните культуры плиты с покрытием средств массовой информации (СМИ Neurobasal с добавлением 2% B27, 0,5 мМ глютамина и 1% пенициллина: stretomycin) (общий объем минус покрытия объема), содержащий 18 тур мм или 22x22 мм, квадратные покровные стекла, покрытые поли-D-лизина ( 0,2 мг / мл, Sigma), растворенного в 0,1 М боратном буфере (3.1g / л борной кислоты, 4.8g / л буры, рН 8,5, фильтруют стерилизовать), общий объем для 12-луночного планшета = 0,8 мл / лунку.
  14. Пластина нейронов при плотности представить в следующем шаге; разгонять клетки равномерно, осторожно качалки / выпуске плавки.
  15. Для 12-луночных планшетах (3,5 см 2 / а): (привет плотности 3 х 10 5 / а = 857/mm 2) (середина плотностью 1,5 х 10 5 / а = 430/mm 2); 6-луночных (9.6cm 2 / а): (привет плотности 9 х 10 5 / а = 624/mm 2) (середина плотностью 4,5 · 10 5 / а = 312/mm 2).
  16. Через час после покрытия, замену всех средних свежей средой (Neurobasal среде с 2% B27, 0,5 мМ глютамина и 1% пенициллина: stretomycin). Потому что клетка мусора оседает в середине и, вихрем пластин первого для облегчения удаления мусора; быть осторожным, чтобы не позволить клетки сухой в любое время.
  17. Изменение ½ среду два раза в неделю после этого (удаления ~ 300-350 мкл из каждой лунки, и добавьте 400 мкл свежей среды нагревается питание в каждую лунку).
    Дополнительно: На DIV 4 добавить 200 мкМ D, L-амино-phosphonovalerate кислота (D, L-APV, Восхождение Научно) для кормления среды, культуры нейронов в Neurobasal среду с добавлением 2% B27, 0,5 мМ глютамина и 1% пенициллина: stretomycin + 200 мкМ APV.
  18. Рост первичных культурах нейронов коры на 24-28 дней в пробирке (DIV), а в это время точка шипами дендритных дисплей зрелой морфологии (т.е. они образуют соединения с пресинаптических партнерами и ясной головой-как структура) и соответствуют ранней юности у грызунов 3-4. Нейроны, выращенные на покровных 18 мм выстрел может быть tranfected и лечить фармакологически, прежде чем быть фиксированной, immunostained и отображаемого использованием конфокальной микроскопии и используется для подробного анализа morphometeric дендритных шипиков. Клетки, выращенные на 22x22 мм квадратные покровные затем могут быть использованы в замедленной экспериментов отображения, чтобы исследовать динамику дендритных позвоночника.

2. Трансфекция первичных культурных нейронов коры

  1. Корковых нейронов трансфицированных за 2-3 дня до экспериментов с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5.
  2. Подготовка "ч-DMEM", уравновешивая рН DMEM (Дульбеко изменения Eagle среднего; не глутамин,Invitrogen 11965-092) с 10 мМ стерильной HEPES (4 - (2-гидроксиэтил)-1-piperazineethanesulfonic кислоты; Mediatech Cellgro 25-060-ДИ 1М, рН 7). Нагреть до 37 ° C.
  3. Передача покровные для 600/1000 мкл (18/22x22 покровные мм) подогретого (37 ° С) новых антибиотиков среды (Neurobasal среды, B27, 0,5 мМ глутамина), и инкубировать клетки в увлажненной 37 ° С инкубатор, дополненные с 5% CO 2 в течение 30 минут.
  4. Для каждого покровное, добавьте назначенный количество ДНК (одной или нескольких плазмид ДНК, например pEGFP наметить морфологии клеток и меткой-мутант синаптических белков, 1-2 мкг в зависимости от конструкции) до 50 мкл ч-DMEM, дать постоять в течение 5 минут.
  5. Для каждого покровное, добавить 4 / 6 мкл (18/22x22 мм покровные) Lipofectamine 2000 по 50 мкл ч-DMEM, дайте настояться 5 минут.
  6. Тщательно перемешайте труб из шагов 1,3 и 1,4, держать в течение как минимум 20 минут в увлажненной 37 ° C инкубатора, с добавлением 5% СО 2. Комплекс стабилен в течение до 6 часов в зависимости от производителя.
  7. Добавить Lipofectamine смесь 2000/DNA с шага 1,5 каплям к клеткам. Инкубируйте клетки в увлажненной 37 ° C инкубатора, с добавлением 5% CO2, в течение 4 часов.
  8. Использование кормления среды от шага 1.1 (300 / 600 мкл), добавка с подогретого (37 ° С) 400 / 800 мкл свежей среды кормления (18/22x22 покровные мм). Следующим шагом 1,6, передача покровных в среде, содержащей старые и свежие кормления среды.
  9. Разрешить выражение плазмид продолжаться в течение 2-3 дней.

3. Лечение первичного культурного корковые нейроны, выращенные на 18-мм покровные

Нейроны выросли на 18 мм покровные, ранее трансфекции, также может быть легко подвергается фармакологические методы лечения.

  1. Подготовка ACSF (искусственный спинномозговой жидкости, в мм: 125 NaCl, 2,5 KCl, 26,2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 глюкозы, 5 HEPES, 2,5 CaCl 2 и 1,25 MgCl 2 с 200 мкМ D, L-APV). Нагреть до 37 ° C. Предварительно инкубировать покровных в 900 мкл теплой ACSF в течение 30-60 минут. Предварительная обработка с ингибиторами могут быть выполнены в течение этого времени.
  2. Подготовка фармакологических средств / транспортного средства со склада решения 10X рабочей концентрации; выполнять разведения решений в ACSF. Аккуратно добавить агент / транспортного средства в клетки (окончательный объем 1000 мкл, чтобы конечная концентрация 1X агент / транспортного средства), и позволяют проводить лечение в течение нужного времени 5.
  3. После лечения (ы), исправить клетки и процесс immunocytohistochemistry.

4. Фиксация и immunocytohistochemistry (МУС)

  1. Fix нейронов в любом 4% формальдегида / 4% сахарозы PBS (800 мкл) в течение 20 минут при комнатной температуре, или в 4% формальдегида / 4% сахарозы PBS (800 мкл) в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем 2X моет в ФСБ , затем 10 минут исправить с предварительно охлажденной (-20 ° C) метанол (800 мкл) при 4 ° C. Метанол фиксации работ денатурирующих и осаждение белков. Эта процедура приводит к разоблачение белков в постсинаптической плотности (PSD), а также в богатых липидами областях.
  2. Вымойте покровных в PBS (800 мкл), 2x, в течение 10 минут каждый.
  3. Permeabilize и блокировать клетки одновременно в PBS, содержащем 2% нормальной козьей сывороткой и 0,1% Triton-X-100 (800 мкл) в течение 1 часа при комнатной температуре.
  4. Добавить первичных антител, выдвигаемые против GFP, эпитопа теги (например, его, Myc, V5) или эндогенных белков, PBS, содержащий 2% нормальной козьей сыворотке в соответствующей концентрации. Возьмите 15 см блюдо, разделите его на квадраты, пронумеровать их и накройте парафильмом. Добавьте примерно 80 мкл смеси антител и блока парафильмом (одна капля на квадратный), а место покровное на антитела / блок смешать с клетками вниз. Инкубировали в течение ночи при температуре 4 оС.
  5. Вымойте покровных в ФБР, 3x в течение 15 минут каждый.
  6. Развести Alexa-сопряженных вторичными антителами (Invitrogen) в PBS, содержащем 2% нормальной козьей сывороткой в ​​соответствующей концентрации. Инкубируйте вторичными антителами в том же порядке, как в пункте 3.4, при комнатной температуре в течение 1 часа, защищенном от света месте.
  7. Вымойте покровные дальнейшего 3x 15 минут в PBS.
  8. Горы покровные на стандартные предметные стекла использованием Продли Золотой реагента antifade (Invitrogen).

5. Количественный анализ позвоночника морфологии

Получим конфокальных изображений одно-и двухместных окрашенных нейронов (клеток, экспрессирующих GFP и построить или эндогенный белок), используя Zeiss LSM5 Паскаль конфокальной микроскопии. Для всех изображений экспериментов выбирают здоровый пирамидных нейронов для включения в образ и использовать в дальнейшем анализе. Здоровые клетки нейронов, которые не отображаются какие-либо признаки blebbing или бедствия из-за лечение или фиксации и которые содержат полную, непрерывную беседка дендритных.

  1. Получение изображений нейронов использовании 63x нефтью погружения цели (Zeiss) с Н. А. (питerical диафрагма) на 1,4, а Z-серии 3-8 изображений, в среднем 4 раза, с 0,37 мкм интервалы, 1024x1024 пикселей, скорость сканирования составляет 2,5 секунд на секцию. Культуры, которые должны быть напрямую сравнивать необходимо для включения в образ с теми же параметрами приобретения. 10-20 нейронов / состояние, каждая из 3-5 отдельных экспериментах, и 2 дендритов 100 мкм на один нейрон должны быть проанализированы. Эксперименты следует делать слепой и на сестру культур. Настройка детектора усиления и смещения включить даже смутно флуоресцентные тонкие шипы, не создавая ореол вокруг дендритов, такое, что переход между флуоресцентного сигнала в позвоночнике и фон резко, позволяя точную количественную оценку. Держите приобретение параметры одинаковы для всех сканирований в рамках одного эксперимента.
  2. GFP изображения могут быть получены с помощью линии аргонового лазера, захватывающий на 488 нм и сбора с полосовой фильтр на 505-530 нм. Изображения экспрессия белков или эндогенных белков immunostained с Alexa 568 вторичных антител (Invitrogen) могут собираться с помощью гелий-неоновый лазер захватывающих в 543 нм, а также сбор, используя длинную фильтра при 560 нм. Держите лазерной полномочия к минимуму, чтобы избежать фотообесцвечивания образцов.
  3. Использование Метаморф программного обеспечения (Molecular Devices, Inc), двумерные, фон-вычитается, максимальная реконструкций проекции Z-серии изображений используются для морфометрического анализа и количественной оценки. Изучить морфологию дендритных шипиков, коллапс Z-серии изображений, калибровки требуемое расстояние, а затем порог, чтобы включить все шипы таким образом, что порог в точности соответствует контур шипами (рис. 2E, F). Только шипы на вторичном и третичном дендритов (общая длина 100 мкм на один нейрон) должна быть измерена уменьшить изменчивость, и измерения сегменты должны быть сделаны между точками ветвления. Вручную контур каждого позвоночник так, что он станет закрытым периметром (рис. 2G).
  4. Измерьте параметры позвоночника автоматически в Метаморф: длина позвоночника, позвоночник широты, площадь поперечного сечения, и дендритных позвоночника линейной плотности. Экспорт дендритных позвоночника морфометрических параметров в Excel для количественной оценки. Используйте непарный т Студенческая тестов для определения статистической значимости различий между двумя группами; однофакторного дисперсионного анализа может быть использован для сравнения трех и более групп, а затем Тьюки-б постфактум для множественных сравнений. Статистический анализ может быть выполнен в Excel, GraphPad или SPSS. Анализ кумулятивной участков использованием Колмогорова-Смирнова (KS тест) 2,5-6.

6. Количественные иммунофлюоресценции (ИФ)

Количественная оценка иммунофлюоресценции с использованием антител против определенных синаптических белков, визуализировать использованием Alexa 568 вторичных антител (Invitrogen), могут быть использованы для изучения изменений в кластеризации и синаптической локализации эндогенных синаптические белки.

  1. Приобретать изображения с помощью конфокальной микроскопии, как описано выше. Использование аргона и лазерной HeNe (см. выше), чтобы изображение двойной окрашенных нейронов. Только здоровый образ пирамидных нейронов, которые не отображаются какие-либо признаки дистресса.
  2. Для измерения интенсивности флуоресценции, вычитание фона соответствующие дендритных вала (рис. 2I, желтый квадрат) для создания "фона вычитается" изображение (рис. 2J), используя Метаморф. Столь же порог изображений включить кластеров с интенсивностью по крайней мере два раза выше соседних дендритов (рис. 2K). Структура областей вдоль дендритов (100 мкм на нейрон) с помощью "периметров" полезности (рис. 2D) и автоматического измерения линейной плотности (число/100 мкм длиной дендритов) и интегральной интенсивности (всего ЕСЛИ интенсивности) каждого кластера с помощью синаптических Метаморф 7-9.
  3. Для измерения относительного содержания позвоночника синаптические белки, в первую очередь определяет белок кластеризации порога GFP изображения для определения позвоночника морфологии (рис. 2E, F) с помощью Метаморф. Передача регионах интересов, которые включают только шипы к образам белок, захваченных в другом канале (рис. 2G, H). Подсчитайте количество белка кластеров и измерить иммунофлюоресценции интегральной интенсивности внутри шипами для оценки содержания белка позвоночника.
  4. Экспорт ЕСЛИ параметров синаптических белков в Excel для количественной оценки. Используйте непарный т Студенческая тестов для определения статистической значимости различий между двумя группами; однофакторного дисперсионного анализа может быть использован для сравнения трех и более групп, а затем Тьюки-б постфактум для множественных сравнений. Статистический анализ может быть выполнен в Excel, GraphPad или SPSS.

7. Покадровый изображений

Изучить динамику дендритных позвоночника, такие как изменения в позвоночнике подвижность в позвоночнике или морфологии отдельных шипами, в наличии или отсутствии заболевания, связанные синаптические белки, растут первичные корковые нейроны культивировали на 22x22 мм квадратные покровные для 24-28 DIV. Neurдополнений может быть дважды трансфицированных GFP / mCherry для определения морфологии клеток, и флуоресцентно меткой мутант синаптические белки, как описано выше. Для всех изображений экспериментов, выбрать здоровый пирамидных нейронов выражения и конструкции, эти клетки могут быть подвергнуты фармакологического лечения, отображаемого и используется в последующих анализах.

  1. Предварительно инкубировать нейроны, выращенные на покровных 22x22 мм в 1,5 мл ACSF в течение 30-60 минут в увлажненной 37 ° C инкубатора, с добавлением 5% СО 2. Клетки также могут быть предварительно обработаны с наркотиками на данном этапе, а также. После pre-incubation/treatment, передача клетки закрытой камере стадии визуализации (Warner, RC-30HV). Поддерживайте температуру 37 ° С, блок управления (Warner, TC-344B) 2,5-6,10.
  2. Для изучения позвоночника подвижность, предварительная обработка клеток с наркотиками или транспортного средства на срок до 30-60 минут до передачи клеткам изображения камеры. Это позволяет достаточно времени для наркотиков / транспортного средства для начала второго пути посланника в нейроне. Получение изображений через 63x цели (Ziess, Н. А. 1.4) с 2X среднем с 10-минутными интервалами. Употребляйте здоровую нейронов с общей пирамидальной морфологии выражения GFP / mCherry или флуоресцентными метками белка. Чтобы свести к минимуму фотостарения, снизить мощность лазера до 0.5-1%. Сравнение транспортных средств обработанные против наркотиков обработанных клеток продемонстрируют изменения в позвоночнике подвижности. Кроме того, подвижность позвоночника могут быть оценены до и после лечения, по перфузии наркотиков / транспортного средства (см. ниже). Сбор Z-стеки в каждый момент времени.
  3. Для отслеживания изменений в морфологии дендритных позвоночника с течением времени, образ покровных в течение 1 часа, чтобы установить базовые изменения в морфологии. В это время заливать наркотиков / транспортного средства в камеру визуализации с использованием перистальтического насоса (Gilson, Minipuls 3), и изображение нейрона для дальнейшего час. Приобретать конфокальной Z-стеки использованием 63x цель нефти (Ziess, Н. А. 1.4), с 2X среднем каждые 10 минут. Уменьшить мощность лазера до 0.5-1%, чтобы минимизировать фотостарения.
  4. В конце каждой сессии изображений, получить 20-кратный образ всего нейрона выяснить уровень фотостарения. Любой нейронов выставке признаки бедствия должны быть исключены из количественной оценке. Z-стеки каждой временной точке должна быть свернуты в 2D-проекций в Метаморф. В зависимости от качества изображения и уровень трансфекции, средний фильтр или вычитание фона могут быть применены в Метаморф для получения четких изображений для анализа.
  5. Для оценки позвоночника морфинга и подвижность, снимки, сделанные в начале, середине и в конце 100 минуты изображений сессия должна быть цветной и обложил в Метаморф. По крайней мере, 100 мкм дендритов на клетку необходимо анализировать. Общая доля подвижности позвоночника определяется как общее число моторики событий, то есть расширение, стягивания, глава морфинга или выступающими подвижность позвоночника нормированная на число 6,11. Этот метод измеряет частоту событий, без учета их величины, это бассейнов всех типов событий, и общая оценка общей моторики. Выступающими определено событие, как появление новых, переходных выступать из головы или позвоночника дендритных вала. Втягивание событие определяется как исчезновение существующих или переходных выступ расположен на голову позвоночника или дендритных вала. Сумма выступ и расширение событий, деленное на общее число шипов в области дендритов, которая количественно.
  6. Для оценки изменений в отдельные морфологии позвоночника в ответ на медикаментозное лечение, измерение площади поперечного сечения дендритных шипиков или дендритных позвоночника линейной плотности в момент времени -1 час (1 час до перфузии), непосредственно предшествующего лечения и в каждой из следующих точек раз лечение. Нормализовать каждый момент времени в 1 час до к лечению момент времени. Чтобы определить, что изменения в морфологии дендритных позвоночника или линейной плотности не были из-за фотостарения, анализировать нейронов озарен автомобиля. Различия в средствах может быть определен непарный т Студенческая тестов или одного образца т тестов.

8. Альтернативные подходы и ключи к успеху

  1. Мы описали культивирование корковых нейронов в присутствии D, L-APV, NMDA-рецепторов ингибитор, от DIV 4 до погашения (DIV24-28). Следует отметить, что в то время культивирования нейронов коры в присутствии D, L-APV имеет преимущество в поддержании хорошего здоровья корковых нейронов культур долгосрочные, наличие D, L-APV могут повлиять на развитие синапсов. Таким вариантом является культура нейронов в отсутствии D, L-APV 2,5. При культивировании нейронов в отсутствии D, L-APV особое внимание следует обратить на общее состояние здоровья культур, так как есть возможность увеличения клеточной смерти из-за чрезмерного Ca2 + цитотоксичность через чрезмерно активных NMDA-рецепторов активации.
  2. Нейронных культур, описанных в данном протокол может быть использован для изучения механизмов, которые важны для регулирующих морфологию дендритных позвоночника и подвижность dendritiс шипами отображения зрелой морфологии (т.е. они образуют соединения с пресинаптических партнерами и ясной головой-как структура) 2,4,5. Кроме того, использование культур на более ранней временной точке, например DIV11-16, может быть более подходящим для решения вопросов, имеющих значение для дендритных формирование позвоночника, или регулирование дендритных шипиков на ранних стадиях развития.
  3. Альтернативой использованию конфокальной микроскопии, заключается в использовании широкого поля эпи-флуоресценции можно получить изображения очищенных культурный корковых нейронов. В сочетании с соответствующими алгоритмы деконволюции, подробный анализ морфометрических шипов могут быть сделаны в фиксированных или живых клеток. Кроме того, возможно использование альтернативного программного обеспечения, таких как ImageJ ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) или Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns . HTML ), которые являются свободным программным обеспечением для анализа морфологии дендритных позвоночника.
  4. При рассмотрении дендритных подвижность позвоночника / морфинга использованием покадровой обработки изображений, следует отметить, что использование коротких покадровой промежутки времени, например, 5-10 минут, может обеспечить гораздо более детальный анализ дендритных позвоночника turnover2, 5. Использование более короткие промежутки времени может также определить более быстрому формы позвоночника морфинга, которые не будут обнаружены с помощью более длительных интервалах времени.
  5. Использование культурного нейронов коры имеет ряд недостатков и проблем, которые должны быть приняты во внимание. Во-первых, озабоченность использования культурного корковых нейронов, что может быть изменчивости между культурами, которые могут повлиять такие параметры, как плотность дендритных позвоночника. Таким образом, важно, чтобы следующие моменты тщательно придерживался обеспечить наименьшее количество изменчивости. Во-первых, культивирование параметров и реагенты должны быть как можно более последовательными в дополнение к передовой практике культивирования, это позволит значительно сократить уровень изменчивости между культурами. Во-вторых, важно, что все эксперименты быть выполнена в той же временной точке, а на сестру культур. Кроме того времени точки, в которой проводятся эксперименты должны быть тщательно подобраны, чтобы экспериментатор задать соответствующие вопросы (см. пункт 2 выше). Наконец, крайне важно, чтобы соответствующие органы управления используются во всех экспериментах, так что лечение условия всегда рассматриваются относительно этих внутреннего контроля. Это позволит удалить какой-либо озабоченности изменчивости между культурами.
  6. Использование культурного корковых нейронов является мощным инструментом в обеспечении исследователи критически изучить механизмы, которые необходимы для регулирования морфологии дендритных позвоночника и подвижности. Тем не менее, важно отметить, что эти культуры не повторять в естественных условиях ситуации, и такие компоненты, как корковых организации слой и действие других типов клеток, таких как глиальные клетки, на формирование синапса не могут быть решены в системе, описанной выше. Тем не менее, такая система может быть использована для выявления потенциально важным механизмы, лежащие регулирования дендритных морфологии позвоночника и подвижности.

9. Представитель Результаты

Анализы, описанные выше, предназначен для исследования изменений в позвоночнике дендритные морфологии, количество и подвижность в ответ на фармакологические методы лечения и / или генетических манипуляций функции белка в пробирке. В нашей лаборатории мы использовали эти методы, чтобы охарактеризовать роль синаптических белков, которые регулируют актина цитоскелета в дендритных шипиков, изменяя таким образом их структуру 2,9. Кроме того, мы использовали этот анализ, чтобы определить, как нейроактивные соединений, таких как нейромодуляторов может управлять изменениями в позвоночнике дендритные морфология, число или форма, либо самостоятельно, 4,6,10, или в присутствии деятельности зависят от стимулов 5.

Для оценки точности наших измерений 1D или 2D параметры, мы измерили диаметр и областей флуоресцентных латексных микросфер (Duke Scientific) известных размеров (0,2, 0,52, 1,0 мкм), установленных в тех же условиях, как нейроны на протяжении всей учебы. Используя те же условия, как для визуализации позвоночника измерений (63x NA = 1,4 нефтью погружения цели, LSM 5 Паскаль), мы отображаемого микросфер, а затем определяется их диаметры и областей, в Метаморф, так же с нашими измерениями позвоночника. Затем мы сравнили фактические размеры с известными размерами микросфер.

График на рисунке 1 (рис. 1) показывает, что мы могли бы точно измерить области микросфер 0,52 и 1,0 мкм (области = 0,21 мкм 2 и 0,78 мкм 2 соответственно) (измеряется стандартным отклонением ~ 15%, производители определяется стандартным отклонением ~ 9%). Даже для 0,2 мкм микросферы наши измерения были достаточно близки к фактическим размерам (однако с большим SD). Это согласуется с расчетными боковой резольного ution нашей конфокальной микроскопии с помощью этой конкретной цели, 0,3 мкм (с помощью уравнения Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) 12. Это значительно лучше, чем осевые резолюции, который, как известно, плохой для конфокальных и 2-фотонных микроскопов. Кроме того, мы экспериментально определили боковой (х / у оси) функции рассеяния точки (PSF) путем измерения зеленого флуоресцентного микросфер диаметром 200 нм (Duke Scientific) составляет ~ 0,5 мкм. Эта оценка была выполнена с отверстием открытые, и, следовательно, можно предположить, что, когда отверстие закрыто, что НПФ фактически будет меньше. Тем не менее, это еще раз показывает, что мы можем точно измерить областях больше, чем 0,196 мкм 2 (диаметр = 0,5 мкм). Указанием фактического бокового PSF приведен в (Свобода и соавт.) 13 как "не намного меньше, чем 0,4 мкм, что привело бы в области 0,16 мкм 2". Эти сравнения и теоретические соображения указывают на то, что мы можем точно измерить области объектов близки по размерам к шипами, так как размеры шипов мы измерили были больше, чем этот предел разрешения (> 0,25 мкм 2). Для таких условий ", классический морфометрические методы количественной" 13, указывая, что мы можем надежно измерить позвоночника районах, а также точное сравнение позвоночника морфологии в различных условиях лечения.

Для того, чтобы точно измерить дендритных морфологии позвоночника, у нас есть трансфекции DIV 23 нейронов коры с EGFP построить в течение 2 дней. После трансфекции клетки могут быть подвергнуты лечению, и фиксируются и обрабатываются для ICC, где сигнал GFP повышается, чтобы обеспечить равномерное распределение по всей дендритов (или нейрона). На рисунке 2 показан представителю образ корковых нейронов, трансфицированных GFP, отображаемого использованием конфокальной микроскопии с целью 63x (NA 1,4) (рис. 2). Это позволяет подробные изображения с высоким разрешением дендритных шипиков (рис. 2В). Подробный анализ морфометрических дендритных шипиков выполняются в нашей лаборатории с помощью программы Метаморф. Эта программа позволяет не только измерять дендритных морфологии позвоночника, но и для изучения локализации эндогенных белков. Обзор того, как мы проводим этот анализ осуществляется на рисунке 2 (рис. 2C-G).

Хорошо характеризует эффект деятельности зависит от стимулов увеличения дендритных размера позвоночника 2. На рисунке 3 показана представитель замедленная съемка дендритных позвоночника DIV 24 коркового нейрона выражения EGFP, отображаемого в течение 30 минут до и после деятельности зависит от стимула. Это покадровой эксперимент подтверждает, что деятельность зависит от стимулов увеличивать размер дендритных позвоночника (рис. 3А, Б). Изучить базальной моторики позвоночника, изображения были получены во время точках 0, 50 и 100 минут, и позвоночник расширения, ретракции, выступающими моторику и голова морфинга были измерены отдельно и объединены в общую подвижность. Рис 3C-D подтверждает, что даже в базальных условиях, дендритных шипиков корковых нейронов отображения какой-то степени подвижности.

Рисунок 1
Рис. 1. Сравнение измеренных и фактических областей флуоресцентных микросфер. Баров Ошибка представляют стандартное отклонение измеряемой области. Изображения микросфер 0,2 мкм, 0,52 мкм и 1 мкм. Шкала бар = 5 мкм.

Рисунок 2
Рис. 2. Количественная оценка позвоночника морфологии и IF. А. Изображение DIV 25 EGFP-культурного выражения коркового нейрона. Б. больших увеличениях типичной морфологией дендритных позвоночника находится на корковые нейроны. С. EGFP и эндогенных белков (GluR1) наложения. Д. Сложено Z-серии EGFP-трансфицированных пирамидальной клетка дендритов; разделение между валом и шипы прослеживается вручную Е. Distinct, superthreshold регионов, то изложенные Метаморф и количественно Ф. ручной прослеживается нейроны используются для определения позвоночника длину, ширину и площадь поперечного сечения Г. регионов определяется... по Метаморф, которые соответствуют шипами. очертания H. позвоночника будут переведены на красный канал изображения (эндогенный белок) количественно позвоночника конкретного сигнала. IK. Для количественной оценки рецепторов или синаптической кластера белка И.Ф., проекция изображения Z-серии используются. I. Дендритные фоне вала ЕСЛИ (желтый квадрат) вычитается для создания "фона вычитается" изображение. J. Это изображение затем thresholded и программа автоматически измеряет кластера области, линейной плотности, и общая стоимость серый (IF интенсивности) К. Thresholded изображение из H. шкалы барами, = 15 мкм, B = 1 мкм.

г "ALT =" Рисунок 3 "/>
Рис. 3. Активность зависит от изменений в позвоночнике морфологии, и базальной моторики дендритных шипиков. А. Покадровый изображений представитель дендритных позвоночника до и после добавления деятельности зависит от стимула. Активность зависит от раздражителей были вызваны переключения экспериментальных средств массовой информации из ASCF содержащие Mg2 + и APV для ACSF без Mg 2 + и АПВ, но содержащий 10 мкм глицин Б. Количественное дендритных области позвоночника (размер), нормированная на -30 минуте момент времени (30 минут до перфузии). С. представитель изображения 0, 50 и 100 минут моменты времени дендритных подвижность позвоночника. Популярные показывает наложение 0 (красный), 50 (зеленый) и 100 (синий) указывает минуты времени, в то время как изображение ниже, каждый момент времени по отдельности. Asterisk обозначает позвоночник расширения; белая стрелка обозначает позвоночник опровержение; зеленая голова стрелка обозначает выступающими моторики; открытые желтой головой стрелка обозначает позвоночник голову морфинга Д. Количественная оценка параметров подвижности дендритных позвоночника и общую моторику Е. 20X образ нейронов коры выражения EGFP следующие изображения.. сессии, чтобы определить здоровье клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Методы, описанные выше, для детального количественного анализа морфологии дендритных позвоночника, линейной плотности и подвижности в фиксированный или жить первичных корковых нейронов сосредоточены на понимании последствий постсинаптических механизмов, которые могут способствовать neuropathologies. Аналогичный подход может быть использован для количественной морфологии позвоночника и подвижность в любой нейрон колючий, в том числе гиппокампа пирамидальная, Пуркинье, или средних нейронов колючих.

Протокол, описанный здесь, могут быть адаптированы, чтобы смотреть на фундаментальные свойства синаптических белков и / или эффекты фармакологического лечения на дендритных шипов. Кроме того, он может быть использован для оценки изменений в локализации эндогенных белков синаптических белков от базового интерфейса для глутаматных рецепторов. Кроме того, она позволяет не только подробные морфометрического анализа основных шипов, но и измерение эффектов синаптических белков или фармакологического лечения на дендритных подвижность позвоночника. Эти покадровой методов визуализации может быть изменен, чтобы изучить торговлю белков, с или без одновременного изучения морфологии дендритных позвоночника.

Детальный анализ дендритных морфологии и подвижности позвоночника является важным инструментом для исследования возможных последствий мутант синаптические белки, и, как мутации в этих болезней связана синаптические белки могут влиять на синапс структуры и функции, способствуя тем самым патофизиологии количество нарушений мозга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Производство этого работа была поддержана Метаморф (Molecular Devices, Inc.)

Acknowledgments

Мы благодарим Келли Джонс тщательного редактирования. Эта работа была поддержана NIH грант R01MH 071316, Ассоциация Альцгеймера, Национальный Альянс по исследованиям в области шизофрении и депрессии (NARSAD) и Национальный альянс для изучения аутизма (NAAR) (PP); Американской ассоциации сердца Докторантура стипендий (DPS), американский Ассоциация Сердца Predoctoral стипендий (KMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
  2. Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
  3. Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
  4. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
  5. Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
  6. Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
  7. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  8. Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
  9. Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
  10. Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
  11. Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
  12. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
  13. Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
Анализ морфологии Дендритные позвоночника в культуре нейронов ЦНС
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter