Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

Published: July 13, 2011 doi: 10.3791/2794
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Summary

מחקרים עדכניים רבים זיהו מוטציות חלבונים סינפטיים הקשורים פתולוגיות במוח. ראשי נוירונים בקליפת המוח בתרבית להציע גמישות רבה לבחון את ההשפעות של מחלות אלה הקשורים חלבונים על מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים.

Abstract

הקוצים הדנדריטים הם האתרים של רוב הקשרים מעוררים בתוך המוח, ויוצרים את תא פוסט סינפטי של סינפסות. מבנים אלו עשירים אקטין הוכח להיות מאוד דינמי. בתגובה פלסטיות Hebbian הקלאסית כמו גם אותות neuromodulatory, הקוצים הדנדריטים יכולים לשנות את הצורה ואת מספר, אשר נחשב קריטי עבור עידון של מעגלים עצביים ועל עיבוד ואחסון של מידע בתוך המוח. בתוך הקוצים הדנדריטים, רשת מורכבת של חלבונים הקישור אותות תאיים עם cyctoskeleton אקטין המאפשר שליטה על מורפולוגיה עמוד השדרה במספר הדנדריטים. מחקרים Neuropathological הוכיחו כי מספר מדינות המחלה, החל סכיזופרניה הפרעות הספקטרום האוטיסטי, להציג עמוד השדרה נורמלי מורפולוגיה הדנדריטים או מספרים. יתר על כן, מחקרים גנטיים האחרונות זיהו מוטציות בגנים המקודדים חלבונים רבים הסינפטי, המוביל הצעות כי חלבונים אלה עשויים לתרום גמישות עמוד השדרה סוטה כי, בין השאר, בבסיס הפתופיזיולוגיה של הפרעות אלה. על מנת ללמוד את התפקיד הפוטנציאלי של חלבונים אלה בשליטה מורפולוגיות עמוד השדרה הדנדריטים / מספר, השימוש של נוירונים בקליפת המוח בתרבית מציע מספר יתרונות. ראשית, מערכת זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של הקוצים הדנדריטים בתאים קבועים, כמו גם זמן לשגות הדמיה של תאים חיים. שנית, זו מערכת חוץ גופית מאפשר מניפולציה קלה של תפקוד החלבון על ידי ביטוי של חלבונים מוטנטים, מציאה על ידי בונה shRNA, או טיפולים תרופתיים. טכניקות אלו מאפשרים לחוקרים להתחיל לנתח את התפקיד של מחלות הקשורות חלבונים לחזות כיצד מוטציות של חלבונים אלה יפעלו in vivo.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש כדי לבחון מורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים ודינמיקה בכל מערכת תרבותית ראשונית.

1. הכנת העיקרי בתרבויות נוירונים בקליפת המוח

  1. הכן בצפיפות גבוהה תרבויות נוירון קורטיקלי מ Sprague-E18 Dawley עוברי חולדה ותרבות בינוני סרום ללא גליה ממוזג 1-2.
  2. להרדים עכברוש אחד בהריון (E18) על פי הנהלים ACUC; במהירות להסרת הרחם (עם עוברים את זה) ומניחים בצלחת פטרי 100 מ"מ על הקרח.
  3. גזור הרחם פתוח קרום השפיר, העובר להחזיק בצוואר (חבל הטבור שלם) עם מלקחיים, מלקחיים שימוש אחר לקרקפת לקלף מאחור קדימה, ושיסף את הגולגולת פתוחה עם מלקחיים חדה טיפ לאורך קו האמצע מהחלק האחורי לחזית.
  4. הסר את המוח כולו עם מלקחיים מעוקל (בתנועה סקופ) ומניחים צלחת פטרי 100 מ"מ המכילים 10 קר כקרח Ca2 + מ"ל - ו - Mg 2 + ללא HBSS.
  5. החזק גזע המוח עם מלקחיים, חצאי נפרד עם מלקחיים אחר, להסיר בסטריאטום ההיפוקמפוס, קליפת המוח להפריד בזהירות לקלף רקמת קליפת המוח מן קרומי המוח.
  6. בריכת גזור רקמות קליפת המוח, בשר טחון בקצרה ולהעביר שפופרת 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל מראש חימם טריפסין / EDTA (0.25 טריפסין%, 0.53 mM EDTA; HyQ טריפסין מ HyClone SH30042.01); דגירה של 37 ° C אמבט מים ~ 15 דקות, להסיר טריפסין / EDTA ככל האפשר עם טפטפת פלסטיק חד פעמיות, להוסיף 1.5 מ"ל בינוני עצביים.
  7. לנתק את רקמות מעוכל מכנית על ידי pipetting עדין עם 5 מ"ל פיפטה (~ 10 שבץ, למנוע יצירת בועות אוויר), להוסיף 2 מ"ל בינוני, שלא להתפשר על 30 שניות, ולאחר מכן להעביר 2 supernatant מ"ל לשפופרת 15 מ"ל.
  8. חזור על שלב 6 פעמיים (צריך לקחת על סך 15 דקות ~).
  9. ספין ההשעיה התא ב 200 דקות 2.
  10. הסר supernatant (עם 5 מ"ל פיפטה - לא לשאוב אבק); לשחרר את הכדור על ידי היפוך אצבעות נגד התחתונה; תא גלולה resuspend בינוני 5 מ"ל ולסנן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך שפופרת 50 מ"ל.
  11. מערבבים 10 ההשעיה תא μl ו 10 μl trypan כחול; ספירת תאים קיימא (הרחקה trypan כחול) עם hematocytometer.
  12. תשואה אופיינית: 5 x 10 6 תאים / המוח; לדלל את הצפיפות הרצויה (לדוגמא 1.5 x 10 6 תאים / מ"ל) לציפוי.
  13. מלא צלחות תרבות עם ציפוי התקשורת (מדיה Neurobasal בתוספת 2% B27, גלוטמין 0.5 מ"מ פניצילין 1%: stretomycin) (הנפח הכולל פחות נפח ציפוי) המכיל 18 מ"מ עגול או מרובע 22x22 מ"מ coverslips, מצופה פולי-D-ליזין ( 0.2 מ"ג / מ"ל, Sigma) מומס 0.1 M borate חיץ (3.1g / L חומצת בור, 4.8g / L בורקס, pH 8.5, מסנן מעוקרים); הנפח הכולל של צלחת 12-טוב = 0.8 מ"ל / היטב.
  14. נוירונים פלייט בצפיפות בתנאי בשלב הבא, לפזר באופן שווה על ידי תאים עדין נדנדה / הקשה.
  15. במשך 12 גם צלחות (3.5cm 2 / טוב): (Hi-צפיפות 3 x 10 5 / טוב = 857/mm 2) (אמצע צפיפות 1.5 x 10 5 / טוב = 430/mm 2); 6-גם צלחות (9.6cm 2 / טוב): (Hi-צפיפות 9 x 10 5 / טוב = 624/mm 2) (אמצע צפיפות 4.5 x 10 5 / טוב = 312/mm 2).
  16. שעה אחת לאחר ציפוי, להחליף את כל בינוני עם בינוני טרי (מדיה Neurobasal בתוספת 2% B27, גלוטמין 0.5 מ"מ פניצילין 1%: stretomycin). מאחר פסולת תא נוטים להתיישב באמצע המערבולת, גם את צלחות המנה הראשונה כדי להקל על סילוק פסולת; להיזהר לא לתת תאים יבשים בכל עת.
  17. שנה וחצי בינונית פעמיים בשבוע לאחר מכן (להסיר ~ 300-350 μl מכל טוב, ולהוסיף 400 μl חימם בינוני האכלה טרי זה טוב).
    אופציונלי: ב DIV 4 להוסיף 200 מיקרומטר D, L-חומצה אמינית phosphonovalerate (D, L-APV, אסנט מדעי) כדי להאכיל בינוני; נוירונים תרבות במדיום Neurobasal בתוספת 2% B27, גלוטמין 0.5 מ"מ פניצילין 1%: stretomycin + 200 מיקרומטר APV.
  18. לגדול תרבויות העיקרי של נוירונים בקליפת המוח ימים 24-28 במבחנה (DIV), כמו בכל הזמן הזה נקודה הקוצים הדנדריטים להציג מורפולוגיה בוגרת (כלומר, הם יוצרים קשרים סינפטיים עם טרום שותפים, יש מבנה ברור הראש אוהב) מתאימות ההתבגרות מוקדם מכרסמים 3-4. נוירונים גדל ב -18 מ"מ coverslips עגול ניתן tranfected וטופלו פרמקולוגית, בטרם קבוע, immunostained, הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal ומשמש לניתוח מפורט של morphometeric הקוצים הדנדריטים. תאים גדל על coverslips מרובע 22x22 מ"מ לאחר מכן ניתן להשתמש בכל זמן לשגות ניסויי הדמיה לחקור את הדינמיקה עמוד השדרה הדנדריטים.

2. Transfection העיקרי של נוירונים בקליפת המוח בתרבית

  1. נוירונים בקליפת המוח הם transfected 2-3 ימים לפני ניסויים באמצעות Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5.
  2. הכן "h-DMEM" על ידי איזון ה-pH של DMEM (השתנה Dulbecco הנשר בינוני, לא גלוטמין,Invitrogen 11965-092) עם 10 HEPES סטרילי מ"מ (4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה; MediaTech Cellgro 25-060-CI, 1M, pH 7). חם על 37 ° C.
  3. העברת coverslips ל μl 600/1000 (18/22x22 coverslips מ"מ) מראש התחמם (37 ° C) בינוני חדש ללא אנטיביוטיקה (בינוני Neurobasal, B27, גלוטמין 0.5 מ"מ), ותאי מדגירים את humidified 37 ° C בחממה, בתוספת עם 5% CO 2 למשך 30 דקות.
  4. במשך כל coverslip, להוסיף סכום המיועד של ה-DNA (או פלסמידים DNA מרובים, pEGFP למשל להתוות מורפולוגיה תאים מתויג-מוטציה בחלבון הסינפטי; 1-2 מיקרוגרם בהתאם לבנות) כדי μl 50 של H-DMEM; מאפשרים לעמוד על 5 דקות.
  5. במשך כל coverslip, להוסיף 4 / 6 μl (18/22x22 coverslips מ"מ) Lipofectamine 2000-50 μl h-DMEM; לאפשר לעמוד במשך 5 דקות.
  6. לערבב ביסודיות צינורות מן הצעדים 1.3 & 1.4, לשמור על לפחות 20 דקות humidified 37 ° C בחממה, בתוספת 5% CO 2. קומפלקס יציב למשך עד 6 שעות על פי היצרן.
  7. הוסף Lipofectamine תערובת 2000/DNA מ dropwise צעד 1.5 לתאים. דגירה תאים humidified 37 ° C החממה, CO2 בתוספת 5%, למשך 4 שעות.
  8. באמצעות מדיום האכלה משלב 1.1 (300/600 μl), עם תוספת טרום חימם (37 ° C) 400/800 האכלה μl בינוני טרי (18/22x22 coverslips מ"מ). 1.6 בעקבות צעד, coverslips להעביר לתוך מדיום המכיל בינוני האכלה ישנים טריים.
  9. לאפשר ביטוי של פלסמידים להימשך 2-3 ימים.

3. הטיפול העיקרי נוירונים בקליפת המוח בתרבית גדל ב -18 מ"מ coverslips

נוירונים גדל על coverslips 18 מ"מ, transfected בעבר, יכול גם להיות כפופים להם בקלות לטיפול תרופתי.

  1. הכן ACSF (מלאכותי הנוזל השדרתי, מ"מ: 125 NaCl, KCl 2.5, 26.2 NaHCO 3, 1 לאא 2 PO 4, 11 גלוקוז, HEPES 5, 2.5 ו - 1.25 CaCl 2 MgCl 2 עם 200 מיקרומטר D, L-APV). חם על 37 ° C. טרום דגירה coverslips ב ACSF 900 μl חם עבור 30-60 דקות. טרום לטיפול במעכבי יכול להתבצע במהלך תקופה זו.
  2. הכן סוכני תרופתי / רכב מפתרונות המניות ריכוז עובדים 10X; לבצע דילולים של פתרונות ACSF. בזהירות להוסיף סוכן / רכב לתאים (נפח סופי של μl 1000, לריכוז סופי של סוכן 1X / רכב), ולאפשר טיפול להמשיך לזמן הרצוי 5.
  3. בעקבות הטיפול (ים), לתקן תאים תהליך immunocytohistochemistry.

4. קיבוע ו immunocytohistochemistry (ICC)

  1. תקן נוירונים פורמלדהיד או 4% / סוכרוז PBS 4% (800 μl) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, או בפורמלין 4% / סוכרוז PBS 4% (800 μl) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שוטף 2X ב PBS , ואחריו 10 דקות לתקן עם טרום צונן מתנול (-20 ° C) (800 μl) בשעה 4 ° C. קיבעון מתנול יצירות denaturing והאצת חלבונים. הליך זה מוביל חשיפת של החלבונים בצפיפות פוסט סינפטי (PSD), כמו גם שומנים עשירים אזורים.
  2. לשטוף coverslips ב PBS (800 μl), 2x, במשך 10 דקות כל אחד.
  3. Permeabilize ולחסום תאים בו זמנית PBS המכיל 2% נסיוב עז נורמלי 0.1% Triton-X-100 (800 μl) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
  4. הוספת נוגדנים כנגד העיקרי העלה GFP, epitope תג (למשל myc, שלו, V5) או חלבונים אנדוגניים, כדי PBS המכיל עז נורמלי 2% סרום בריכוז המתאים. קחו צלחת 15 ס"מ, לחלק אותה לריבועים, מספר להם, ומכסים parafilm. הוסף על 80 μl של תערובת נוגדנים ולחסום את parafilm (טיפה אחת לכל מרובע), ו coverslip מקום לערבב נוגדן / לחסום עם תאים כלפי מטה. מודגרות לילה ב 4 מעלות.
  5. לשטוף coverslips ב-PBS, 3x במשך 15 דקות כל אחד.
  6. מדולל אלקסה, מצומדות נוגדנים משני (Invitrogen) ב-PBS המכיל 2% נסיוב עז נורמלי בריכוז המתאים. דגירה נוגדנים משני באותו אופן כמו בשלב 3.4, בטמפרטורת החדר למשך 1 שעה, מוגן מפני אור.
  7. לשטוף coverslips 3x עוד 15 דקות ב-PBS.
  8. Coverslips הר על גבי שקופיות באמצעות מיקרוסקופ רגיל להאריך מגיב antifade זהב (Invitrogen).

5. ניתוח כמותי של מורפולוגיות עמוד השדרה

אנו להשיג תמונות confocal של נוירונים חד פעמיים מוכתם (תאים להביע GFP חלבון לבנות או אנדוגני ריבית) באמצעות מיקרוסקופ LSM5 Zeiss פסקל confocal. עבור כל הניסויים הדמיה לבחור עצב פירמידליים בריא להיות צילמו והשתמשו בניתוח שלאחר מכן. הנוירונים הם תאים בריאים שאינם מציגים שום סימן של blebbing או מצוקה עקב טיפול או קיבעון ו המכילים סוכת מלא, הדנדריטים ללא הפרעה.

  1. לרכוש תמונות של נוירונים באמצעות המטרה 63x הנפט טבילה (Zeiss) עם NA (numהצמצם erical) של 1.4, כמו Z-סדרה של 3-8 תמונות, בממוצע 4 פעמים, עם מרווחי 0.37 מיקרומטר, 1024x1024 פיקסלים ברזולוציה במהירות סריקה של 2.5 שניות לכל קטע. תרבויות כי יש להשוות ישירות צריך להיות צילמו עם הפרמטרים רכישת אותו. 10-20 נוירונים / תנאי, כל 3-5 ניסויים נפרדים, 2 דנדריטים של 100 מיקרומטר לכל נוירון יש לנתח. ניסויים צריך לעשות עיוורת על תרבויות אחותו. התאם להשיג גלאי לקזז לכלול קוצים רזה אפילו פלורסנט במעומעם מבלי ליצור הילה סביב דנדריט, כגון כי המעבר בין האות ניאון בעמוד השדרה ואת הרקע חד, המאפשר כימות מדויק. שמור את הפרמטרים רכישת זהה עבור כל סריקות בתוך ניסוי זהה.
  2. תמונות GFP ניתן לרכוש באמצעות קו לייזר ארגון, מרגש ב 488 ננומטר איסוף עם מסנן הלהקה לעבור על 505-530 ננומטר. תמונות של חלבונים overexpressed או חלבונים אנדוגניים immunostained עם נוגדן 568 אלקסה משני (Invitrogen) ניתן לאסוף באמצעות לייזר HeNe מרגש ב 543 ננומטר, איסוף באמצעות מסנן ארוך לעבור ב 560 ננומטר. שמור כוחות לייזר עד למינימום כדי למנוע photobleaching של דגימות.
  3. שימוש MetaMorph תוכנה (התקנים מולקולריים, Inc), דו מימדי, הרקע מופחתים, שחזורים הקרנת המרבי של Z-סדרת תמונות משמשים לניתוח וכימות morphometric ו. כדי לבחון את מורפולוגיות של הקוצים הדנדריטים, התמוטטות Z-סדרת תמונות, לכייל את המרחק הנדרש, ולאחר מכן לסף לכלול את כל הקוצים באופן סף מתאים בדיוק המתאר של עמוד השדרה (2E איור, F). רק על הקוצים הדנדריטים משניים ושלישוניים (האורך הכולל של 100 מיקרומטר לכל נוירון) יש למדוד להפחית השתנות, ומדידות של מגזרים צריך להתבצע בין נקודות הסניף. באופן ידני המתאר כל עמוד השדרה כך שהוא יהפוך למתחם סגור (איור 2G).
  4. מדוד את הפרמטרים הבאים עמוד השדרה באופן אוטומטי MetaMorph: אורך עמוד השדרה, רוחב עמוד השדרה, חתך באזור, וצפיפות עמוד השדרה הדנדריטים ליניארי. ייצוא הפרמטרים עמוד השדרה הדנדריטים morphometric לתוך Excel עבור כימות. השתמש בדיקות t מזווג של סטודנט כדי לקבוע את המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים בין שתי הקבוצות; חד סטרי ANOVA ניתן להשתמש כדי להשוות שלוש או יותר קבוצות, ואחריו טיוקי ב-post hoc להשוואות מרובות. ניתוח סטטיסטי יכול להתבצע ב-Excel, GraphPad או SPSS. ניתוח מגרשים מצטבר באמצעות קולמוגורוב סמירנוב-מבחן (מבחן KS) 2,5-6.

6. כמותי immunofluorescence (IF)

כימות באמצעות נוגדנים כנגד חלבונים סינפטיים immunofluorescence ספציפי, דמיינו באמצעות נוגדן 568 אלקסה משני (Invitrogen), יכול לשמש כדי לבחון שינויים באשכולות ולוקליזציה סינפטיים של חלבונים סינפטיים אנדוגני.

  1. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal כמתואר לעיל. השתמש ארגון ו לייזר HeNE (ראה לעיל) להכפיל מוכתם נוירונים התמונה. רק בריאה תמונה עצב פירמידליים שאינם מציגים כל סימני מצוקה.
  2. עבור מדידות עוצמת הקרינה, לחסר את הרקע המתאים הפיר הדנדריטים (איור 2i, צהוב מרובע) כדי ליצור "הרקע מופחתים" תמונה (איור 2J) באמצעות MetaMorph. פחות תמונות סף לכלול אשכולות בעוצמה לפחות שני לקפל מעל דנדריט הסמוכה (איור 2K). מתאר אזורים לאורך הדנדריטים (100 מיקרומטר לכל נוירון) באמצעות "היקפה" השירות (איור 2 ד) באופן אוטומטי למדוד את צפיפות ליניארית (number/100 דנדריט אורך מיקרומטר), ועוצמת משולב (סה"כ אם העוצמה) של כל אשכול הסינפטי באמצעות MetaMorph 7-9.
  3. כדי למדוד תוכן עמוד השדרה יחסית של חלבון הסינפטי, לקבוע תחילה על ידי חלבון באשכולות thresholding את תמונת ה-GFP כדי לקבוע מורפולוגיה עמוד השדרה (2E איור, F) באמצעות MetaMorph. העברת אזורים של עניין, כי רק קוצים כוללים תמונות של החלבון עניין שנתפסו בערוץ השני (איור 2G, ח). ספירת אשכולות חלבון למדוד את העוצמה המשולבת immunofluorescence בתוך עמוד השדרה על מנת להעריך חלבון תוכן עמוד השדרה.
  4. ייצוא אם הפרמטרים של חלבונים סינפטיים לתוך Excel עבור כימות. השתמש בדיקות t מזווג של סטודנט כדי לקבוע את המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים בין שתי הקבוצות; חד סטרי ANOVA ניתן להשתמש כדי להשוות שלוש או יותר קבוצות, ואחריו טיוקי ב-post hoc להשוואות מרובות. ניתוח סטטיסטי יכול להתבצע ב-Excel, GraphPad או SPSS.

7. זמן לשגות הדמיה

כדי לבחון את הדינמיקה עמוד השדרה הדנדריטים, כגון שינויים תנועתיות עמוד השדרה או במורפולוגיה של עמוד השדרה עמוד השדרה הפרט, נוכחות או היעדר של מחלה הקשורים חלבונים סינפטיים, לגדול נוירונים בקליפת המוח העיקרית תרבותי על coverslips מרובע 22x22 מ"מ עבור DIV 24-28. Neurתוספות יכול להיות פעמיים transfected עם GFP / mCherry להגדיר מורפולוגיה התא מתויג fluorescently חלבונים סינפטיים מוטציה כמתואר לעיל. עבור כל הניסויים הדמיה, בחר להביע עצב פירמידליים בריא הן בונה; תאים אלה יכולה להיות נתונה טיפול תרופתי, צילמו בשימוש ניתוחים שלאחר מכן.

  1. טרום דגירה נוירונים גדל על coverslips 22x22 מ"מ ב 1.5 מ"ל ACSF עבור 30-60 דקות humidified 37 ° C בחממה, בתוספת 5% CO 2. תאים יכול להיות גם טרום שטופלו בתרופות בשלב זה גם כן. בעקבות pre-incubation/treatment, תאים להעביר תא הבמה מוקף הדמיה (וורנר, RC-30HV). שמרו על טמפרטורה של 37 ° C עם יחידת הבקרה (וורנר, TC-344B) 2,5-6,10.
  2. כדי לבחון את תנועתיות עמוד השדרה, טרום לטפל בתאים עם סמים או כלי רכב למשך 30-60 דקות לפני העברת תאים לתא הדמיה. זה מאפשר מספיק זמן עבור התרופה / רכב ליזום מסלולים השליח השני בתוך הנוירון. לרכוש תמונות דרך יעד 63X (Ziess, NA 1.4) עם ממוצעים של 2X ב 10 דקות intervals. בחר נוירונים בריא עם מורפולוגיות פירמידה הכולל להביע GFP / mCherry או ניאון מתויג חלבון. כדי למזער את נזקי, לצמצם כוח לייזר 0.5-1%. השוואות של הרכב שטופלו לעומת התרופה בתאים שטופלו תדגים שינויים תנועתיות עמוד השדרה. לחלופין, תנועתיות עמוד השדרה ניתן להעריך לפני ואחרי הטיפול, על ידי טפטוף של התרופה / רכב (ראה להלן). איסוף Z-ערימות בכל נקודת זמן.
  3. כדי לעקוב אחר שינויים במורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים לאורך זמן, coverslips תמונה במשך שעה 1 להקים בסיס שינויים במורפולוגיה. בשלב זה, perfuse את התרופה / רכב לתוך תא הדמיה באמצעות משאבת peristaltic (Gilson, Minipuls 3), נוירון התמונה עבור שעות נוספות. רוכשת confocal Z-ערימות באמצעות המטרה שמן 63X (Ziess, NA 1.4), עם 2X בממוצע כל 10 דקות. צמצום כוח לייזר% 0.5-1 כדי למזער את נזקי.
  4. בסוף כל מפגש הדמיה, לקבל תמונה 20X של נוירון כולה לרמה של נזקי לברר. הנוירונים כל מפגין סימני מצוקה צריך להיות מושמט מן כימות. Z-ערימות של נקודה בכל פעם יש התמוטט לתוך תחזיות 2D ב Metamorph. בהתאם איכות התמונה ואת רמת transfection, חציון עוברים סינון או חיסור רקע ניתן ליישם Metamorph להפיק תמונות ברורות לניתוח.
  5. כדי להעריך את עמוד השדרה morphing ואת תנועתיות, תמונות שצולמו בתחילת, אמצע וסוף מושב הדמיה 100 דקות צריכים להיות בצבעים ומצופה MetaMorph. לפחות 100 מיקרומטר של דנדריט לכל תא צריך להיות מנותח. חלק הכולל תנועתיות עמוד השדרה מוגדרת במספר הכולל של אירועים תנועתיות, כלומר הרחבה, הכחשה, ראש morphing או תנועתיות בולט מנורמל למספר 6,11 עמוד השדרה. שיטה זו מודדת את תדירות האירועים, מבלי לקחת בחשבון את בהירויותיהן, זה בריכות לכל סוגי האירועים, והוא הערכה כללית של תנועתיות הכוללת. אירוע בולט מוגדר הופעת בליטה חדשה, חולף מהראש עמוד שדרה או פיר הדנדריטים. האירוע נסיגת מוגדר היעלמותו של בליטה קיים או חולף ממוקם על ראש עמוד השדרה או פיר הדנדריטים. סכום של אירועים בליטה והסיומת מחולקים על ידי המספר הכולל של עמוד השדרה באזור דנדריט כי הוא לכימות.
  6. כדי להעריך שינויים במורפולוגיה עמוד השדרה הפרט כתגובה לטיפול תרופתי, למדוד את שטח חתך של הקוצים הדנדריטים, או צפיפות עמוד השדרה הדנדריטים ליניארי בשעה נקודת זמן -1 (1 שעה לפני זלוף), מיד לפני הטיפול הבא על כל נקודת זמן הטיפול. נרמל כל נקודת זמן לפני שעה 1-to-נקודת זמן הטיפול. כדי לקבוע כי שינויים במורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים או צפיפות ליניארית לא היו בשל נזקי, לנתח נוירונים perfused עם הרכב. הבדלים אמצעים ניתן לקבוע על ידי בדיקות t מזווג של סטודנט או אחד מדגם הבדיקה לא.

8. גישות חלופיות ואת המפתחות להצלחה

  1. תיארנו נוירונים בקליפת המוח culturing בנוכחות D, L-APV, מעכב רצפטור NMDA, מן DIV 4 עד לפדיון (DIV24-28). יצוין כי בעוד נוירונים בקליפת המוח culturing בנוכחות D, L-APV יש את היתרון של שמירה על בריאות טובה של תרבויות נוירונים בקליפת המוח לטווח ארוך, הנוכחות של D, L-APV עשויים להשפיע על התפתחות סינפסה. ככזה אלטרנטיבה היא נוירונים תרבות בהעדר D, L-APV 2,5. כאשר נוירונים culturing בהעדר D, L-APV תשומת לב צריך להיות משולם לבריאות הכללית של תרבויות, שכן קיים סיכוי גידול של מוות של תאים עקב Ca2 + מופרז cytotoxicity באמצעות הפעלת יתר של הקולטן NMDA פעילים.
  2. תרבויות העצבית המתוארת פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון את המנגנונים הרלוונטיים להסדרת מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים של dendritiג קוצים הצגת מורפולוגיה בוגרת (כלומר, הם יוצרים קשרים סינפטיים עם טרום שותפים, יש מבנה ברור ראש דמוי) 2,4,5. לחלופין, להשתמש תרבויות בשעה מוקדמת יותר זמן נקודה, למשל DIV11-16, עשוי להיות מתאים יותר במטרה לענות על שאלות רלוונטיות היווצרות עמוד השדרה הדנדריטים, או תקנה של הקוצים הדנדריטים במהלך ההתפתחות המוקדמת.
  3. חלופה לשימוש מיקרוסקופיה confocal, היא שימוש רחב בתחום עלית פלואורסצנציה לרכוש תמונות של מטופלים נוירונים בקליפת המוח בתרבית. בשילוב עם אלגוריתמים deconvolution המתאים, ניתוח מפורט של עמוד השדרה morphometric יכול להתבצע בתאים קבוע או לחיות. יתר על כן, ניתן להשתמש בתוכנה חלופית, כגון ImageJ ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) או Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns . html ) אשר תוכנה חופשית, לניתוח מורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים.
  4. כאשר בוחנים תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים / morphing באמצעות זמן לשגות הדמיה, יש לציין כי השימוש זמן לשגות במרווחים קצרים יותר, למשל 50-10 דקות, יכול לספק ניתוח מפורט יותר של עמוד השדרה הדנדריטים turnover2, 5. השימוש במרווחי זמן קצרים יותר עשויים גם לזהות צורות מהירה יותר של עמוד השדרה morphing כי לא יהיה לאתר באמצעות מרווחי זמן ארוכים יותר.
  5. השימוש של נוירונים בקליפת המוח בתרבית יש מספר חסרונות ובעיות שצריך לקחת בחשבון. ראשית, חשש של שימוש נוירונים בקליפת המוח בתרבית היא כי ייתכן שיש בין תרבויות שונות שיכולות להשפיע פרמטרים כגון צפיפות עמוד השדרה הדנדריטים. ככזה, הוא חיוני כי את הנקודות הבאות הם דבקו בקפידה כדי להבטיח את הכמות המינימלית של השתנות. ראשית, הפרמטרים culturing ו ריאגנטים צריך להישמר עקבי ככל האפשר בנוסף נוהלי culturing טוב, זה יהיה לצמצם במידה ניכרת את רמת השונות בין תרבויות. שנית, זה הכרחי כי כל הניסויים להתבצע בעת ובעונה אחת לנקודה, ועל תרבויות אחותו. בנוסף, זמן הנקודה שבה מבוצעים ניסויים צריך להיות שנבחרו בקפידה על מנת לאפשר הנסיין לשאול את השאלות המתאימות (ראה נקודה 2 לעיל). לבסוף, חשוב השולט המתאים משמשים כל הניסויים, כך התנאים טיפול נבדקות תמיד ביחס אלו בקרות פנימיות. זה יהיה להסיר כל חשש של השתנות בין תרבויות.
  6. השימוש של נוירונים בקליפת המוח תרבותי הוא כלי רב עוצמה המאפשר לחוקרים לבחון באופן ביקורתי את מנגנוני כי הם חיוניים להסדרת מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים. עם זאת, חשוב לציין כי תרבויות אלה אינם לשחזר במצב vivo, רכיבים כגון ארגון שכבת קליפת המוח ואת ההשפעה של סוגי תאים אחרים, כגון ותאי גלייה, על היווצרות הסינפסה לא ניתן לטפל במערכת שתוארו לעיל. עם זאת, מערכת כזו יכולה לשמש כדי לזהות מנגנונים חיוניים פוטנציאל הבסיסית הסדרת מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים.

9. נציג תוצאות

מבחני שתוארו לעיל נועדו לחקור שינויים במורפולוגיה הדנדריטים מספר, תנועתיות עמוד השדרה בתגובה הטיפול התרופתי ו / או מניפולציה גנטית של תפקוד החלבון במבחנה. במעבדה שלנו, יש לנו שימוש בטכניקות אלה כדי לאפיין את התפקיד של חלבונים סינפטיים המווסתים את cytoskeleton אקטין בתוך הקוצים הדנדריטים, ובכך לשנות את המבנה שלהם 2,9. יתר על כן, השתמשנו זה assay כדי לקבוע כיצד תרכובות neuroactive, כגון neuromodulators יכול לנהוג שינויים במורפולוגיה הדנדריטים מספר, עמוד השדרה או צורה, לבדם 4,6,10, או בנוכחות גירויים תלויי פעילות 5.

כדי להעריך את רמת הדיוק של המדידות שלנו פרמטרים 1D או 2D, מדדנו את קוטר ותחומי פלורסנט לטקס microspheres (דיוק מדעי) של ממדים ידוע (0.2, 0.52, 1.0 מיקרומטר) רכוב באותם תנאים כמו הנוירונים לאורך כל תקופת המחקר. שימוש בתנאי הדמיה כמו למדידות עמוד השדרה (63X NA = 1.4 הנפט טבילה אובייקטיבי, LSM פסקל 5) אנו צילמו את microspheres, וקבע אז בקטרים ​​שלהם בתחומים Metamorph, בדומה עם מדידות עמוד השדרה שלנו. אז השווינו את המדידות בפועל עם הממדים הידועים של microspheres.

הגרף באיור 1 (תמונה 1) מראה שאנחנו יכולים למדוד במדויק את תחומי microspheres של 0.52 ו - 1.0 מיקרומטר (אזורים = 0.21 מיקרומטר 2 ו - 0.78 מיקרומטר 2 בהתאמה) (סטיית התקן נמדדת ~ 15%; היצרנים נקבע סטיית תקן ~ 9%). גם עבור 0.2 מיקרומטר microspheres המדידות שלנו היו קרובים למדי ממדי בפועל (אך עם SD גדול). זה עולה בקנה אחד עם resol לרוחב מחושב ution של מיקרוסקופ confocal שלנו באמצעות מטרה זו בפרט, 0.3 מיקרומטר (באמצעות המשוואה Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) 12. זה משמעותי יותר מאשר ההחלטה צירית, אשר ידוע להיות עני עבור מיקרוסקופים confocal ו -2 פוטון. בנוסף, אנו בניסוי נקבע את התפשטות לרוחב (X / Y ציר) נקודה הפונקציה (כוחות הביטחון הפלסטינים) על ידי מדידת ירוק ניאון microspheres בקוטר 200 ננומטר (דיוק מדעי) להיות ~ 0.5 מיקרומטר. הערכה זו בוצעה עם חריר פתוח, ולכן ניתן להניח שכאשר חריר סגור, כי כוחות הביטחון הפלסטינים יהיו למעשה קטן יותר. עם זאת, זה שוב מציין כי אנו מסוגלים למדוד במדויק את האזורים יותר מיקרומטר 0.196 2 (= בקוטר 0.5 מיקרומטר). אינדיקציה של כוחות הביטחון הפלסטינים לרוחב בפועל ניתנת (סוובודה et al.) 13 כמו "לא הרבה פחות מ 0.4 מיקרומטר, אשר תביא שטח של 0.16 מיקרומטר 2". השוואות אלה שיקולים תיאורטיים מצביעים על כך שאנו יכולים למדוד במדויק את האזורים של אובייקטים דומים בגודלם עמוד השדרה, שכן המידות של קוצים מדדנו היו גדולים יותר להגביל את הרזולוציה (> 0.25 מיקרומטר 2). במשך בתנאים כאלה, "טכניקות morphometric קלאסי הם כמותי" 13, המציין כי אנו יכולים למדוד באופן מהימן אזורים בעמוד השדרה, ובאופן מדויק להשוות מורפולוגיות עמוד השדרה בתנאים טיפול שונה.

על מנת למדוד במדויק את המורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים, יש לנו transfected DIV 23 נוירונים בקליפת המוח עם לבנות EGFP עבור 2 ימים. בעקבות transfection, תאים יכולים להיות נתונים לטיפול, הם קבועים ומעובדים עבור ICC, שם את האות ה-GFP מוגברת כדי לאפשר הפצה אפילו על פני דנדריט (או נוירון). תרשים 2 מציג תמונה מייצגת של תא עצב בקליפת המוח transfected עם GFP, צילמו באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרה 63X (NA 1.4) (איור 2 א). זה מאפשר תמונות ברזולוציה גבוהה מפורט של הקוצים הדנדריטים (איור 2B). ניתוח מפורט של morphometric הקוצים הדנדריטים מבוצעות במעבדה שלנו באמצעות תוכנית Metamorph. תוכנית זו מאפשרת לנו לא רק למדוד מורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים, אלא גם כדי לבחון את לוקליזציה של חלבונים אנדוגניים. סקירה של האופן שבו אנו מבצעים את הניתוח הזה ניתן באיור 2 (איור 2C-G).

אפקט מאופיין היטב תלויי פעילות גירויים היא עלייה בגודל עמוד השדרה הדנדריטים 2. איור 3 מראה הדמיה נציג זמן לשגות של עמוד השדרה הדנדריטים של 24 EGFP DIV נוירון קורטיקלי להביע, צילמו במשך 30 דקות לפני ואחרי גירוי פעילות תלויי. ניסוי זה זמן לשגות מאשרת כי פעילות תלוית גירויים להגדיל את גודל עמוד השדרה הדנדריטים (איור 3 א, ב). כדי לבחון את תנועתיות עמוד השדרה הבזליים, תמונות נרכשו בנקודות זמן 0, 50 ו - 100 דקות, הרחבות עמוד השדרה, הכחשות, תנועתיות ראש מזדקר ו morphing נמדדו בנפרד, בשילוב כמו תנועתיות מוחלט. איור 3C-D מאשרת כי גם בתנאים הבסיסיים, הקוצים הדנדריטים של נוירונים בקליפת המוח להציג רמה מסוימת של תנועתיות.

איור 1
איור. 1. השוואה בין אזורים נמדד בפועל של פלורסנט microspheres. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של האזורים נמדד. תמונות של microspheres של 0.2 מיקרומטר, 0.52 מיקרומטר ו 1 מיקרומטר. בר סולם = 5 מיקרומטר.

איור 2
איור. 2. כימות מורפולוגיה אם עמוד השדרה. א מקדימה של 25 DIV EGFP-לבטא סדרת-Z נוירונים בקליפת המוח בתרבית. בהגדלה ב הגבוה מורפולוגיה טיפוסית עמוד השדרה הדנדריטים נמצא על נוירונים בקליפת המוח. ג EGFP וחלבון כיסוי אנדוגני (GluR1). ד שהתמוטטו EGFP-transfected פירמידה דנדריט התא; החלוקה בין פיר קוצים הוא איתר ידני E. נפרדים, באזורים superthreshold מתוארים מכן על ידי Metamorph לכמת פ יד לייחס נוירונים בשימוש כדי לקבוע אורך עמוד השדרה, רוחב חתך אזור אזורים ג'נקבע... על ידי Metamorph שמתאימים קוצים. מתווה ח השדרה יועברו התמונה מסלול אדום (חלבון אנדוגני) לכמת את עמוד השדרה ספציפי האות. IK. כדי לכמת או אשכול חלבון קולטן הסינפטי IF, תמונות השלכה של Z-סדרת משמשים. רקע א פיר דנדריטים IF (ריבוע צהוב) מופחת כדי ליצור "הרקע מופחתים" התמונה. J. זו התמונה thresholded אז התוכנית באופן אוטומטי אמצעים אזור אשכול, צפיפות קווית, ואת הערך הכולל אפור (IF אינטנסיביות) ק תמונה Thresholded מן הסורגים H. סולם, א = 15 מיקרומטר, B = 1 מיקרומטר.

g "alt =" איור 3 "/>
איור. 3. פעילות תלויי שינויים במורפולוגיה עמוד השדרה, תנועתיות הבסיס של הקוצים הדנדריטים. א זמן לשגות הדמיה של עמוד השדרה הדנדריטים נציג לפני ואחרי תוספת של גירוי פעילות תלויי. פעילות תלוית גירויים היו המושרה על ידי החלפת כלי התקשורת הניסיוני מ ASCF המכיל Mg2 + ו APV כדי ACSF ללא Mg2 + ו APV, אך המכיל 10 מיקרומטר גליצין ב כימות באזור עמוד השדרה הדנדריטים (גודל), מנורמל לנקודת זמן -30 דקות (30 דקות לפני זלוף). תמונות C. נציג של 0 נקודות, 50 ו - 100 דקות זמן של תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים. התמונות למעלה מראה כיסוי של 0 (אדום), 50 (ירוק) ו -100 (כחול) זמן נקודות לדקה, בעוד תמונות להלן כל נקודת זמן בנפרד. כוכבית מציינת הארכת עמוד השדרה; החץ הלבן מסמל נסיגת עמוד השדרה, ראש החץ הירוק מסמן תנועתיות ובולטות, לפתוח ראש החץ הצהוב מסמן בראש עמוד השדרה morphing כימות ד הפרמטרים הדנדריטים תנועתיות עמוד השדרה תנועתיות סך ה 20X תמונה של נוירונים בקליפת המוח לבטא הדמיה EGFP הבאה.. הפגישה כדי לקבוע בריאות של התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטכניקות המתוארות לעיל עבור ניתוח כמותי מפורט של עמוד השדרה הדנדריטים מורפולוגיה, תנועתיות צפיפות לינארית בשני הנוירונים קבוע או לחיות קליפת המוח העיקריים הם התמקדו בהבנת ההשפעות של הפוסט סינפטי מנגנונים עשויים לתרום neuropathologies. גישה דומה ניתן לכמת מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה או על כל נוירון קוצני, כולל פירמידה בהיפוקמפוס, פורקינג', או נוירונים קוצני בינוני.

הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים מסתכל על התכונות הבסיסיות של חלבונים סינפטיים ו / או את ההשפעות של טיפול תרופתי על הקוצים הדנדריטים. יתר על כן, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את השינויים לוקליזציה של חלבונים סינפטיים אנדוגני החל חלבונים הפיגום אל קולטני גלוטמט. בנוסף, היא מאפשרת לא רק ניתוח מפורט של עמוד השדרה morphometric קבוע, אלא גם מדידה של השפעות של חלבונים סינפטיים או טיפול תרופתי על תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים. זמן לשגות אלו שיטות הדמיה יכולה גם להיות שונה כדי לבחון הסחר של חלבונים, עם או בלי זמנית בחינת מורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים.

ניתוח מפורט של מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים היא כלי חיוני עבור חוקרים את ההשפעות האפשריות של חלבונים סינפטיים מוטציה, וכיצד מוטציות אלה מחלות הקשורות חלבונים סינפטיים עשויים להשפיע על מבנה ותפקוד הסינפסה, ובכך לתרום פתופיזיולוגיה של מספר הפרעות של המוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

הפקה של עבודה זו נתמכה על ידי MetaMorph (התקנים מולקולריים, Inc).

Acknowledgments

אנו מודים קלי ג'ונס לעריכה זהיר. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק R01MH 071,316, האגודה לאלצהיימר, הברית הלאומית למחקר על סכיזופרניה ודיכאון (NARSAD), והברית הלאומית לחקר האוטיזם (NAAR) (PP); American Heart Association אחוות דוקטורים (DPS); האמריקאי איגוד הלב אחוות Predoctoral (KMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
  2. Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
  3. Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
  4. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
  5. Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
  6. Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
  7. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  8. Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
  9. Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
  10. Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
  11. Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
  12. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
  13. Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).

Tags

Neuroscience גיליון 53 סינפסה מעוררים מדעי המוח מוח קליפת המוח נוירונים בקליפת המוח תרבות העיקרית מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות הדמיה שיפוץ.
ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M.,… More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter