Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen
Summary
Tal van recente studies hebben aangegeven mutaties in synaptische eiwitten in verband met de hersenen pathologieën. Primaire gekweekte corticale neuronen bieden een grote flexibiliteit in het onderzoeken van de effecten van deze ziekte-geassocieerde eiwitten op dendritische rug morfologie en beweeglijkheid.
Abstract
Dendritische stekels zijn de websites van de meerderheid van prikkelende verbindingen in de hersenen, en vormen de post-synaptische compartiment van synapsen. Deze structuren zijn rijk aan actine en is aangetoond dat zeer dynamisch. In reactie op de klassieke Hebbian plasticiteit evenals neuromodulatory signalen, kan dendritische spines van vorm veranderen en het aantal, waarvan wordt gedacht kritisch te zijn voor de verfijning van neurale circuits en de verwerking en opslag van informatie in de hersenen. Binnen de dendritische spines, een complex netwerk van eiwitten koppelen extracellulaire signalen met het actine cyctoskeleton waardoor de controle van dendritische wervelkolom morfologie en nummer. Neuropathologische studies hebben aangetoond dat een aantal van de ziekte staten, variërend van schizofrenie tot autisme spectrum stoornissen, abnormale dendritische ruggegraat morfologie of cijfers weer te geven. Bovendien hebben recente genetische studies geïdentificeerd mutaties in tal van genen die eiwitten coderen synaptische, wat leidt tot suggesties dat deze eiwitten kunnen bijdragen aan afwijkende wervelkolom plasticiteit die voor een deel ten grondslag liggen aan de pathofysiologie van deze aandoeningen. Met het oog op onderzoek naar de mogelijke rol van deze eiwitten in het controleren van dendritische wervelkolom morfologie / nummer, het gebruik van gekweekte corticale neuronen biedt verschillende voordelen. Ten eerste is dit systeem zorgt voor hoge-resolutie beeldvorming van dendritische spines in vaste cellen als time-lapse imaging van levende cellen. Ten tweede, dit in vitro systeem maakt een eenvoudige manipulatie van proteïne functie door de expressie van mutant eiwitten, knockdown door shRNA constructen, of farmacologische behandelingen. Deze technieken kunnen de onderzoekers om te beginnen met de rol van de ziekte-geassocieerde eiwitten ontleden en te voorspellen hoe de mutaties van deze eiwitten kunnen functioneren in vivo.
Protocol
Discussion
De hierboven beschreven technieken voor de gedetailleerde kwantitatieve analyse van dendritische wervelkolom morfologie, lineaire dichtheid en de beweeglijkheid in een van beide vaste of live primaire corticale neuronen zijn gericht op het begrijpen van de effecten van de post-synaptische mechanismen die kunnen bijdragen aan neuropathologieën. Een soortgelijke aanpak kan gebruikt worden om de wervelkolom morfologie of beweeglijkheid in een stekelige neuron, inclusief de hippocampus piramidale, Purkinje, of medium steke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Kelly Jones voor een zorgvuldige bewerking. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R01MH 071.316, Alzheimer's Association, de Nationale Alliantie voor onderzoek naar schizofrenie en depressie (NARSAD), en de Nationale Alliantie voor Autisme Research (naar) (PP), American Heart Association Postdoctoral Fellowship (DPS), de Amerikaanse Heart Association Predoctorale Fellowship (KMW).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 18 mm round Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm square Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P-0899 | MW 70~150 Kda |
| Neurobasal Media | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140148 | |
| D,L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | MediaTech Cellgro | 25-060-C 1 | 1M, pH 7 |
| Formaldehyde Solution | EMD Chemicals | FX0415-5 | 36%, Histology grade |
| Normal Goats Serum | VWR | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* | Invitrogen | A-11034 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Special Packaging |
| Enclosed imaging stage chamber | Warner | RC-30HV | |
| Temperature controller unit | Warner | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
References
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
- Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
- Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
- Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
- Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
- Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
