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Neuroscience

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

doi: 10.3791/2794 Published: July 13, 2011

Summary

Numerosos estudios recientes han identificado mutaciones en las proteínas sinápticas asociadas a patologías cerebrales. Primaria neuronas corticales cultivadas ofrecen una gran flexibilidad en el examen de los efectos de estas proteínas asociadas a la enfermedad en la morfología y motilidad de la espina dendrítica.

Abstract

Las espinas dendríticas son los sitios de la mayoría de las conexiones excitatorias en el cerebro, y forman el compartimiento de post-sináptica de las sinapsis. Estas estructuras son ricas en actina y han demostrado ser altamente dinámico. En respuesta a la plasticidad clásica Hebb así como señales de neuromoduladores, las espinas dendríticas pueden cambiar de forma y número, que se cree que es fundamental para el perfeccionamiento de los circuitos neuronales y la transformación y el almacenamiento de información dentro del cerebro. Dentro de las espinas dendríticas, una compleja red de proteínas de enlace de señales extracelulares con la cyctoskeleton actina que permite el control de la morfología de la espina dendrítica y el número. Estudios neuropatológicos han demostrado que un número de estados de enfermedad, que van desde la esquizofrenia hasta trastornos del espectro autista, mostrar la morfología anormal de la espina dendrítica o números. Por otra parte, recientes estudios genéticos han identificado mutaciones en muchos genes que codifican las proteínas sinápticas, lo que lleva a sugerir que estas proteínas pueden contribuir a la plasticidad de la columna vertebral aberrante que, en parte, la base de la fisiopatología de estos trastornos. Con el fin de estudiar el papel potencial de estas proteínas en el control de las morfologías dendríticas columna / número, el uso de cultivos de neuronas corticales ofrece varias ventajas. En primer lugar, este sistema permite obtener imágenes de alta resolución de las espinas dendríticas en las células fijadas, así como time-lapse de imágenes de células vivas. En segundo lugar, este sistema in vitro permite una fácil manipulación de la función de proteínas mediante la expresión de las proteínas mutantes, caída por las construcciones shRNA, o tratamientos farmacológicos. Estas técnicas permiten a los investigadores comienzan a analizar el papel de las enfermedades asociadas a proteínas y para predecir cómo las mutaciones de estas proteínas pueden funcionar in vivo.

Protocol

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El protocolo aquí descrito puede ser utilizado para examinar la morfología de la espina dendrítica y la dinámica de cualquier sistema de cultivo primario.

1. La preparación de cultivos primarios de neuronas corticales

  1. Prepare de alta densidad cultivos de neuronas corticales de rata Sprague-Dawley E18 embriones y la cultura en la glía acondicionado medio libre de suero 1-2.
  2. La eutanasia a una rata preñada (E18), de acuerdo a los procedimientos de ACUC, rápido extraer el útero (con fetos en el mismo) y colocar en una placa de Petri de 100 mm sobre el hielo.
  3. Cortar el útero abierto y de membrana amniótica, mantenga el feto por el cuello (el cordón umbilical intacto) con una pinza, pinza de utilizar otro en el cuero cabelludo cáscara de atrás hacia delante, y le cortó el cráneo abierto con una pinza de punta afilada a lo largo de la línea media de atrás hacia adelante.
  4. Quite todo el cerebro con una pinza curva (en un movimiento de cuchara) y colóquelo en un plato de Petri de 100 mm con 10 ml de helado de Ca2 + - y Mg 2 + HBSS libre.
  5. Mantenga tronco cerebral con una pinza, los hemisferios separados con otra pinza, retire el hipocampo y el estriado, la corteza separada y pelar cuidadosamente el tejido cortical de fuera de las meninges.
  6. Piscina disecados tejidos corticales, carne picada brevemente y transferir a un tubo de 15 ml que contiene 4 ml precalentado tripsina / EDTA (0,25% de tripsina, 0,53 mM EDTA; HyQ tripsina de HyClone SH30042.01), incubar a 37 ° C baño de agua a ~ 15 minutos, retire la tripsina / EDTA tanto como sea posible con una pipeta de plástico desechables, añadir 1,5 ml de medio neuronal.
  7. Disociar los tejidos digerido mecánicamente mediante pipeteo suave con una pipeta de 5 ml (~ 10 golpes, evitar la creación de burbujas de aire), añadir 2 ml de medio, dejar reposar durante 30 segundos, entonces la transferencia de 2 ml sobrenadante en un tubo de 15 ml.
  8. Repita el paso 6 dos veces (se debe tomar sobre total de aproximadamente 15 minutos).
  9. Giro suspensión celular a 200 g durante 2 min.
  10. Aspirar el sobrenadante (con una pipeta de 5 ml - no aspirar al vacío), aflojar el pellet por voltear los dedos contra la parte inferior; celular resuspender el pellet en 5 ml de medio y filtrar a través de un filtro 40 micras de células en un tubo de 50 ml.
  11. Se mezclan 10 l de suspensión celular y 10 l azul tripán, recuento de células viables (exclusión del azul tripano) con un hematocitómetro.
  12. Rendimiento habitual: 5 x 10 6 células / cerebro; diluir a la densidad deseada (por ejemplo, 1,5 x 10 6 células / ml) para la siembra.
  13. Llenar las placas de cultivo con los medios de comunicación de chapado (los medios de comunicación Neurobasal suplementado con 2% B27, 0,5 mM de glutamina y 1% de penicilina: stretomycin) (volumen total menos el volumen de planchas), que contiene 18 mm redondo o cubreobjetos de 22x22 mm cuadrados, recubiertos con poli-D-lisina ( 0,2 mg / ml, Sigma) disuelto en 0,1 M tampón borato (3,1 g / l de ácido bórico, 4,8 g / L de bórax, pH 8,5, esterilizada por filtración), el volumen total de 12 y placa = 0,8 ml / pocillo.
  14. Neuronas en la placa de la densidad prevista en el siguiente paso, se dispersan uniformemente por las células de suave balanceo / roscado.
  15. De 12 y placas (3,5 cm 2 / así): (alta densidad de 3 x 10 5 / así = 857/mm 2) (a mediados de la densidad de 1,5 x 10 5 / así = 430/mm 2), placas de 6 pocillos (9,6 cm 2 / así): (alta densidad de 9 x 10 5 / y = 624/mm 2) (a mediados de la densidad de 4,5 x 10 5 / y = 312/mm 2).
  16. Una hora después de la siembra, reemplace todo el medio con medio fresco (los medios de comunicación Neurobasal suplementado con 2% B27, 0,5 mM de glutamina y 1% de penicilina: stretomycin). Debido a que los restos celulares tienden a asentarse en el medio de la turbulencia, así, las primeras placas para facilitar la remoción de escombros, ten cuidado de no dejar las pilas secas en cualquier momento.
  17. Cambiar ½ medio dos veces por semana a partir de entonces (quitar ~ 300-350 l de cada bien, y añadir 400 l calentado medio de alimentación fresca a cada pocillo).
    Opcional: En DIV 4 añadir 200 M D, L-amino-ácido phosphonovalerate (D, L-APV, Ascenso Científica) para alimentar a medio; las neuronas de cultivo en medio Neurobasal suplementado con 2% B27, 0,5 mM de glutamina y 1% de penicilina: stretomycin + 200 M APV.
  18. Los cultivos primarios de neuronas corticales para los días 24-28 in vitro (DIV), como en este punto de las espinas dendríticas de tiempo muestran una morfología madura (es decir, formar conexiones con pre-sináptica socios, y tienen un claro cabeza-como la estructura) y corresponden a la adolescencia en roedores 3-4. Las neuronas cultivadas en cubreobjetos de 18 mm redondo puede ser transfectadas y tratados farmacológicamente, antes de ser fijo, immunostained, y la imagen con un microscopio confocal y se utiliza para el análisis detallado morphometeric de las espinas dendríticas. Las células cultivadas sobre cubreobjetos de 22x22 mm cuadrados puede ser utilizado en los experimentos de imagen lapso de tiempo para investigar la dinámica de la columna vertebral dendríticas.

2. La transfección de primaria neuronas corticales cultivadas

  1. Las neuronas corticales son transfectadas 2-3 días antes de los experimentos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5.
  2. Prepare "h-DMEM" al equilibrar el pH de DMEM (Dulbecco medio de Eagle modificado, sin glutamina,Invitrogen 11965-092) con 10 mM HEPES estéril (4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido; Mediatech Cellgro 25-060-CI, 1 M, pH 7). Calentar a 37 ° C.
  3. Transferencia de cubreobjetos para 600/1000 l (18/22x22 cubreobjetos mm) previamente calentada (37 ° C) nuevo medio libre de antibióticos (medio Neurobasal, B27, 0,5 mM de glutamina), y las células se incuban en un humidificado incubadora a 37 ° C, complementados con 5% de CO 2 durante 30 minutos.
  4. Para cada portaobjetos, añadir una cantidad designada de ADN (uno o varios plásmidos de ADN, por ejemplo, pEGFP para delinear la morfología celular y controlada la proteína mutante sináptica, 1-2 mg en función de la construcción) a 50 l de h-DMEM, dejar reposar durante 5 minutos.
  5. Para cada portaobjetos, añadir 6.4 l (18/22x22 cubreobjetos mm) Lipofectamine 2000 a 50 h-l DMEM, dejar reposar durante 5 minutos.
  6. Mezclar bien los tubos de los pasos 1,3 y 1,4, tenga por lo menos durante 20 minutos en un humidificado incubadora a 37 ° C, suplementado con 5% de CO 2. Complejo es estable hasta 6 horas según el fabricante.
  7. Añadir Lipofectamine mezcla 2000/DNA de paso, gota a gota 1,5 a las células. Se incuban las células en un humidificado incubadora a 37 ° C, suplementado con 5% de CO2, durante 4 horas.
  8. Utilizando un medio de alimentación de la etapa 1.1 (300/600 l), con suplemento pre-calentado (37 ° C) 400 / 800 l medio de alimentación fresca (18/22x22 cubreobjetos mm). Después de 1,6 paso, cubreobjetos transferencia a un medio que contenía medio de alimentación vieja y nueva.
  9. Permitir la expresión de los plásmidos para continuar durante 2-3 días.

3. El tratamiento de neuronas corticales primarias cultivadas crecido en 18 mm cubreobjetos

Las neuronas cultivadas en cubreobjetos de 18 mm, previamente transfectadas, también pueden ser fácilmente sometidos a tratamientos farmacológicos.

  1. Prepare ACSF (líquido cefalorraquídeo artificial, en mM: 125 NaCl, 2,5 KCl, 26,2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glucosa, HEPES 5, 2,5 CaCl 2 y 1,25 de MgCl 2 con 200 M D, L-APV). Calentar a 37 ° C. Preincubarlos cubreobjetos en 900 l ACSF caliente durante 30-60 minutos. El tratamiento previo con inhibidores se puede realizar durante este tiempo.
  2. Preparar agentes farmacológicos / vehículo de las soluciones madre a una concentración 10 veces más de trabajo, realizar diluciones de soluciones en ACSF. Añadir con cuidado agente / vehículo a las células (volumen final de 1000 l, para una concentración final de 1X agente / vehículo), y permitir el tratamiento a seguir por el tiempo deseado 5.
  3. Después del tratamiento (s), fijar las células y el proceso de immunocytohistochemistry.

4. La fijación y immunocytohistochemistry (CPI)

  1. Fijar las neuronas, ya sea en formaldehído al 4% / 4% de sacarosa PBS (800 l) durante 20 minutos a temperatura ambiente, o en formol al 4% / 4% de sacarosa PBS (800 l) durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de lavados 2 veces en PBS , seguido de 10 minutos con solución pre-enfriada (-20 ° C) de metanol (800 l) a 4 ° C. La fijación de metanol obras de la desnaturalización y precipitación de las proteínas. Este procedimiento conduce a un desenmascaramiento de las proteínas en la densidad postsináptica (PSD), así como en las áreas ricas en lípidos.
  2. Lave cubreobjetos en PBS (800 l), 2 veces, durante 10 minutos cada uno.
  3. Permeabilizar las células y bloquear simultáneamente en PBS que contenía 2% de suero normal de cabra y un 0,1% Triton-X-100 (800 l) durante 1 hora a temperatura ambiente.
  4. Añadir los anticuerpos primarios planteados contra las buenas prácticas agrarias, epítopo etiqueta (por ejemplo, Su, myc, V5) o las proteínas endógenas, a PBS que contenía 2% de suero de cabra normal en la concentración adecuada. Tomar un plato de 15 cm, que se dividen en cuadrados, el número de ellos, y cubrir con parafilm. Añadir unos 80 l de mezcla de anticuerpos y el bloque de parafina (una gota por metro cuadrado), y el cubreobjetos lugar a la mezcla de anticuerpos / bloque con las células hacia abajo. Incubaron durante la noche a 4 ° C.
  5. Lave cubreobjetos con PBS, 3 veces durante 15 minutos cada uno.
  6. Diluir Alexa-conjugado con anticuerpos secundarios (Invitrogen) en PBS que contenía 2% de suero normal de cabra a la concentración adecuada. Incubar los anticuerpos secundarios de la misma manera que en el paso 3.4, a temperatura ambiente durante 1 hora, protegido de la luz.
  7. Lave cubreobjetos otros 3x 15 minutos en PBS.
  8. Cubreobjetos de montaje en microscopio estándar diapositivas con prolongar reactivo Antifade Oro (Invitrogen).

5. El análisis cuantitativo de la morfología de la columna vertebral

Obtenemos imágenes confocal de neuronas individuales y dobles manchado (las células que expresan GFP y la proteína endógena construir o de interés), utilizando un microscopio Zeiss LSM5 Pascal confocal. Para todos los experimentos de imagen saludable elegir las neuronas piramidales de ser fotografiado y utilizado en el análisis posterior. Las neuronas son las células sanas que no muestran ningún signo de vesiculación o angustia debido al tratamiento o la fijación y que contienen una glorieta completa, sin interrupciones dendríticas.

  1. Adquirir imágenes de las neuronas con un 63x de inmersión en aceite objetivo (Zeiss) con un NA (numapertura erical) de 1.4, como la serie Z de 3.8 imágenes, un promedio de 4 veces, con intervalos de 0,37 m, de 1024x1024 píxeles de resolución a una velocidad de barrido de 2,5 segundos por sección. Culturas que se van a comparar directamente necesidad de obtener imágenes con los parámetros de adquisición mismo. 10-20 neuronas / condición, cada 3-5 experimentos independientes, y 2 dendritas de las neuronas por 100 micras deben ser analizados. Los experimentos deben hacerse a ciegas y en culturas hermanas. Ajuste la ganancia del detector y el desplazamiento de incluir espinas delgadas, incluso débilmente fluorescentes sin necesidad de crear un halo alrededor de la dendrita, de tal manera que la transición entre la señal fluorescente en la columna vertebral y el fondo es fuerte, lo que permite una cuantificación precisa. Mantener los parámetros de adquisición de la misma para todos los análisis en el mismo experimento.
  2. Imágenes de las buenas prácticas agrarias pueden ser adquiridas mediante una línea láser de argón, emocionante a 488 nm y recogiendo con un filtro de paso de banda a 505-530 nm. Imágenes de las proteínas sobreexpresados ​​o proteínas endógenas immunostained con un anticuerpo secundario Alexa 568 (Invitrogen) se pueden recoger con un láser HeNe emocionante a 543 nm, y la recolección con un filtro de paso largo a 560 nm. Mantenga potencias de láser a un mínimo para evitar photobleaching de las muestras.
  3. Utilizando MetaMorph software (Molecular Devices, Inc.), de dos dimensiones, de fondo-resta, reconstrucciones máxima proyección de imágenes de la serie Z se utilizan para el análisis morfométrico y cuantificación. Para examinar la morfología de las espinas dendríticas, el colapso de la serie Z imágenes, calibrar la distancia requerida, y el umbral para incluir todas las espinas de una manera que el umbral se corresponde exactamente con el contorno de las espinas (Fig. 2E, F). Sólo espinas de las dendritas secundarias y terciarias (longitud total de 100 micras por neurona) se debe medir para reducir la variabilidad, y las mediciones de los segmentos es necesario realizar entre los puntos de ramificación. Esquema de forma manual cada columna de manera que se convierta en un perímetro cerrado (Fig. 2G).
  4. Medir los parámetros de la columna siguiente de forma automática en MetaMorph: longitud espina dorsal, la columna vertebral amplitud, área de sección transversal, y la densidad de la columna vertebral lineal dendríticas. Exportación de los parámetros morfométricos columna dendríticas en Excel para la cuantificación. El uso del estudiante pruebas t no apareado para determinar la significación estadística de las diferencias entre los dos grupos, un modelo lineal se puede utilizar para comparar tres o más grupos, seguido de Tukey-b post hoc para comparaciones múltiples. El análisis estadístico se puede realizar en Excel, GraphPad o SPSS. Analizar las parcelas acumulado de Kolmogorov-Smirnov (KS prueba) 2,5-6.

6. Cuantitativo de inmunofluorescencia (IF)

La cuantificación de anticuerpos con inmunofluorescencia específica contra las proteínas sinápticas, visualizado utilizando un anticuerpo secundario Alexa 568 (Invitrogen), se puede utilizar para examinar los cambios en la agrupación y la localización sináptica de las proteínas endógenas sináptica.

  1. Adquirir imágenes con un microscopio confocal, tal como se describió anteriormente. Use una de argón y un láser de HeNe (ver arriba) a doble imagen manchada de las neuronas. Sólo la imagen saludable neuronas piramidales que no muestran ningún signo de angustia.
  2. Para las mediciones de intensidad de fluorescencia, restar el fondo correspondiente al eje dendríticas (Fig. 2I, cuadrado amarillo) para generar un "fondo-resta" la imagen (Fig. 2J) con MetaMorph. Igualmente las imágenes umbral para incluir grupos con intensidad por lo menos dos veces por encima de la dendrita adyacente (Fig. 2C). Regiones esquema a lo largo de las dendritas (100 micras por neurona) a través del "Perímetro" utilidad (Fig. 2D) y automáticamente medir la densidad lineal (number/100 longitud dendrítica micras), y la intensidad integrada (total si la intensidad) de cada grupo sináptica con MetaMorph 9.7.
  3. Para medir el contenido de la columna relativa de una proteína sináptica, en primer lugar determinar la agrupación proteína GFP umbral de la imagen para determinar la morfología de la columna vertebral (Fig. 2E, F) con MetaMorph. Transferencia de las regiones de interés que sólo se incluyen las espinas a las imágenes de la proteína de interés capturado en el otro canal (Fig. 2G, H). Cuente el número de grupos de proteínas y medir la intensidad de inmunofluorescencia integrado dentro de espinas para evaluar el contenido de la columna vertebral de proteínas.
  4. Si los parámetros de la exportación de proteínas sinápticas en Excel para la cuantificación. El uso del estudiante pruebas t no apareado para determinar la significación estadística de las diferencias entre los dos grupos, un modelo lineal se puede utilizar para comparar tres o más grupos, seguido de Tukey-b post hoc para comparaciones múltiples. El análisis estadístico se puede realizar en Excel, GraphPad o SPSS.

7. Time-lapse de imágenes

Para examinar la dinámica de la columna vertebral dendríticas, tales como cambios en la motilidad de la columna vertebral o en la morfología de la espina dorsal de espinas individual, en la presencia o ausencia de enfermedad asociada a las proteínas sinápticas, crecer neuronas corticales primarias cultivadas en cubreobjetos de 22x22 mm cuadrados para DIV 24-28. NeurFirefox puede ser el doble-transfectadas con GFP / mCherry para definir la morfología celular, y marcado con fluorescencia mutante proteínas sinápticas como se describió anteriormente. Para todos los experimentos de imagen, elija saludables las neuronas piramidales que expresan tanto las construcciones, estas células pueden ser sometidos a tratamiento farmacológico, imágenes y se utiliza en los análisis posteriores.

  1. Preincubarlos neuronas cultivadas en cubreobjetos de 22x22 mm en 1,5 ml ACSF durante 30-60 minutos en un humidificado incubadora a 37 ° C, suplementado con 5% de CO 2. Las células también pueden ser pre-tratados con fármacos en esta etapa también. Pre-incubation/treatment siguiente, las células de transferencia a una cámara de imágenes escenario cerrado (Warner, RC-30 HV). Mantenga una temperatura de 37 ° C con una unidad de control (Warner, TC-344B) 2,5-6,10.
  2. Para examinar la motilidad columna, antes de tratar las células con la droga o el vehículo de hasta 30-60 minutos antes de transferir las células en la cámara de imágenes. Esto permite que el tiempo suficiente para que la droga / vehículo para iniciar las vías de segundo mensajero dentro de la neurona. Adquirir imágenes a través de un objetivo de 63X (Ziess, NA 1.4) con un promedio de 2 veces a intervalos de 10 minutos. Elija las neuronas sanas con el conjunto de morfologías piramidal que expresan GFP / mCherry o proteína fluorescente con etiquetas. Para minimizar el daño solar, reduce la potencia del láser a un 0,5-1%. Las comparaciones de los vehículos tratados en comparación con las células tratadas con la droga se muestran cambios en la motilidad de la columna vertebral. Por otra parte, la movilidad de la columna vertebral pueden ser evaluados antes y después del tratamiento, la perfusión de la droga / del vehículo (ver más abajo). Recoger Z-pilas en cada momento.
  3. Para seguir los cambios en la morfología de la espina dendrítica con el tiempo, cubreobjetos imagen durante 1 hora para determinar los cambios de base en la morfología. En este momento, perfundir el fármaco / vehículo en la cámara de imágenes usando una bomba peristáltica (Gilson, Minipuls 3), y las neuronas de imagen para una hora más. Adquirir confocal Z-pilas utilizando un objetivo de 63X (Ziess, NA 1.4), con un promedio de 2 veces cada 10 minutos. Reducir la potencia del láser a un 0,5-1% para minimizar el daño solar.
  4. Al final de cada sesión de imágenes, obtener una imagen de 20x de toda la neurona a nivel de determinar el daño solar. Cualquier neuronas muestran signos de sufrimiento debe ser omitido de la cuantificación. Z-pilas de cada punto de tiempo debe ser derrumbado en las proyecciones 2D en Metamorph. Dependiendo de la calidad de imagen y el nivel de transfección, un filtro de mediana-pass o sustracción de fondo se puede aplicar en Metamorph para producir imágenes claras para su análisis.
  5. Para evaluar la columna vertebral de morphing y de la motilidad, las imágenes tomadas al principio, mitad y final de la sesión de 100 minutos de imágenes deben ser de colores y cubierta en MetaMorph. Por lo menos 100 m de las dendritas por celda deben ser analizados. La fracción de la columna vertebral motilidad total se define como el número total de eventos de la motilidad, es decir, la extensión, la retracción, la cabeza o la motilidad morphing protrusiva normalizado al número de columna 6,11. Este método mide la frecuencia de los acontecimientos, sin tener en cuenta su magnitud, sino que las piscinas de todo tipo de eventos, y es una estimación general de la movilidad en general. Un evento protrusiva se define como la aparición de una protuberancia nueva, transitoria a partir de una cabeza de la columna vertebral o eje dendríticas. Un caso de retracción se define como la desaparición de un saliente existente o transitoria se encuentra en una cabeza de la columna vertebral o eje dendríticas. La suma de los acontecimientos saliente y de extensión se dividen por el número total de espinas en la región de las dendritas que se cuantifica.
  6. Para evaluar los cambios en la morfología de la columna individual en la respuesta al tratamiento farmacológico, medir el área de la sección transversal de las espinas dendríticas, o la densidad de la espina dendrítica lineal en el punto de horas de tiempo de -1 (1 hora antes de la perfusión), inmediatamente antes del tratamiento y en cada punto de tiempo después de el tratamiento. Normalizar cada momento a la 1 hora antes-a-punto en el tiempo de tratamiento. Para determinar que los cambios en la morfología de la espina dendrítica o densidad lineal no se deben a daño solar, analizar las neuronas perfundidos con el vehículo. Las diferencias en los medios puede ser determinada por unpaired prueba t de Student o de una muestra de prueba de la t.

8. Enfoques alternativos y claves para el éxito

  1. Hemos descrito las neuronas corticales en cultivo la presencia de D, L-APV, un inhibidor de los receptores NMDA, de 4 DIV hasta su vencimiento (DIV24-28). Cabe señalar que mientras que las neuronas corticales en cultivo la presencia de D, L-APV tiene la ventaja de mantener la buena salud de los cultivos de neuronas corticales a largo plazo, la presencia de D, L-APV pueden influir en el desarrollo de sinapsis. Como una alternativa a las neuronas es la cultura en la ausencia de D, L-APV 2,5. Cuando las neuronas de cultivo en ausencia de D, L-APV más atención debe prestarse a la salud general de las culturas, ya que hay una posibilidad de aumento de muerte celular debido a exceso de Ca2 + a través de la citotoxicidad más activa activación del receptor NMDA.
  2. Los cultivos neuronales se describe en este protocolo se puede utilizar para examinar los mecanismos que son relevantes para la regulación de la morfología de la espina dendrítica y la motilidad de dendritic espinas mostrando una morfología madura (es decir, formar conexiones con pre-sináptica socios, y tienen un claro cabeza-como la estructura) 2,4,5. Por otra parte, el uso de las culturas en un tiempo anterior punto, por ejemplo, DIV11-16, puede ser más adecuado para abordar las cuestiones relevantes para la formación de la espina dendrítica, o la regulación de las espinas dendríticas durante el desarrollo temprano.
  3. Una alternativa al uso de la microscopía confocal, es el uso de gran campo epi-fluorescencia para obtener imágenes de los tratados con las neuronas corticales cultivadas. En combinación con los algoritmos de deconvolución su caso, un análisis detallado morfométricos de las espinas se pueden hacer en las células fijas o en vivo. Además, es posible el uso de software alternativos, tales como ImageJ ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) o Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns . html ), que son software libre, para el análisis de la morfología de la espina dendrítica.
  4. Al examinar la motilidad espina dendrítica / morphing con time-lapse de imágenes, hay que señalar que el uso de más corto lapso de tiempo-intervalos, por ejemplo, 5-10 minutos, puede ofrecer un análisis mucho más detallado de la espina dendrítica turnover2, 5. El uso de intervalos más cortos de tiempo también puede identificar las formas más rápidas de la columna vertebral de transformación que no serían detectados con intervalos más largos de tiempo.
  5. El uso de cultivos de neuronas corticales tiene una serie de inconvenientes y preocupaciones que deben ser tomados en consideración. En primer lugar, una preocupación de la utilización de cultivos de neuronas corticales es que puede haber una variabilidad entre las culturas que pueden afectar a parámetros como la densidad de la espina dendrítica. Por lo tanto, es esencial que los siguientes puntos son cuidadosamente adherido para garantizar la menor cantidad de variabilidad. En primer lugar, los parámetros de cultivo y los reactivos deben ser lo más consistente posible, además de las prácticas de cultivo bien, lo que reducirá en gran medida el nivel de variabilidad entre las culturas. En segundo lugar, es esencial que todos los experimentos se realizaron en el mismo punto del tiempo, y en culturas hermanas. Además, el punto de tiempo en el que los experimentos se llevan a cabo deben ser elegidos cuidadosamente para permitir que el experimentador para hacer las preguntas adecuadas (véase el punto 2). Por último, es fundamental que los controles adecuados se utilizan en todos los experimentos, de modo que las condiciones de tratamiento se examinan siempre en relación con estos controles internos. Esto quitará cualquier preocupación de la variabilidad entre las culturas.
  6. El uso de cultivos de neuronas corticales es una poderosa herramienta para permitir a los investigadores a examinar críticamente los mecanismos que son esenciales para la regulación de la morfología y motilidad de la espina dendrítica. Sin embargo, es importante tener en cuenta que estas culturas no recapitulan una situación in vivo, y los componentes tales como la organización cortical y el efecto de otros tipos de células, como células gliales, en la formación de sinapsis no se pueden abordar en el sistema descrito anteriormente. Sin embargo, este sistema se puede utilizar para identificar los mecanismos subyacentes potencialmente crucial la regulación de la morfología y motilidad de la espina dendrítica.

9. Resultados representante

Los ensayos descritos anteriormente están diseñados para investigar los cambios en la morfología dendrítica columna, el número y la motilidad en respuesta a los tratamientos farmacológicos y / o la manipulación genética de la función de la proteína in vitro. En nuestro laboratorio, hemos utilizado estas técnicas para caracterizar el papel de las proteínas sinápticas que regulan el citoesqueleto de actina en las espinas dendríticas, lo que altera su estructura de 2,9. Por otra parte, hemos utilizado esta prueba para determinar cómo los compuestos neuroactivos, como neuromoduladores pueden manejar los cambios en la morfología dendrítica columna, el número o la forma, ya sea solo 4,6,10, o en la presencia de actividad dependiente de los estímulos 5.

Para estimar la precisión de nuestras mediciones de los parámetros de 1D o 2D, que mide los diámetros y las áreas de microesferas fluorescentes de látex (Duke Scientific) de dimensiones conocidas (0,2, 0,52, 1,0 m) montada en las mismas condiciones que las neuronas durante el estudio. Utilizando las condiciones de imagen igual que para las mediciones de la columna vertebral (63X NA = 1,4 petróleo objetivo de inmersión, LSM 5 Pascal) que tomó imágenes de la micro, y luego determina los diámetros y las áreas en Metamorph, del mismo modo con las mediciones de nuestra columna vertebral. A continuación, comparó las medidas reales con las dimensiones conocidas de las microesferas.

El gráfico de la figura 1 (Fig. 1) muestra que podría medir con precisión las áreas de microesferas de 0,52 micras y 1.0 (zonas = 0,21 m 2 y 0,78 m 2, respectivamente) (desviación estándar mide aproximadamente 15%, los fabricantes de determinados desviación estándar ~ 9%). Incluso para los micras microesferas 0,2 nuestras mediciones fueron bastante cerca de las dimensiones reales (sin embargo con grandes SD). Esto es consistente con la resol calcula lateral lución de nuestro microscopio confocal con este objetivo concreto, un 0,3 micras (usando la ecuación Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) 12. Esta cifra es significativamente mejor que la resolución axial, que es conocido por ser pobre para los microscopios confocal y dos fotones. Además, hemos determinado experimentalmente el lateral (ejes X / Y) la función de dispersión puntual (PSF) por la medición de color verde fluorescente microesferas de diámetro de 200 nm (Duke Científica) para ser ~ 0,5 micras. Esta estimación se realizó con la apertura del agujero de alfiler, y por lo tanto se puede suponer que cuando el agujero se cierra, que el PSF en realidad sería menor. Sin embargo, esto indica nuevamente que somos capaces de medir con precisión la superficie es superior a 0.196 m 2 (diámetro = 0,5 mm). Una indicación real de la PSF se da en el lateral (Svoboda et al.) 13 como "no menos de 0,4 micras, lo que resultaría en un área de 0,16 m 2". Estas comparaciones y consideraciones teóricas indican que se puede medir con precisión las áreas de los objetos de tamaño similar a las espinas, ya que las dimensiones de las espinas que se midieron más de este límite de resolución (> 0,25 m 2). Para tales condiciones, "clásico técnicas morfométricas son cuantitativos" 13, lo que indica que se puede medir de forma fiable las áreas columna vertebral, y comparar con precisión las morfologías columna vertebral en diferentes condiciones de tratamiento.

Con el fin de medir con precisión la morfología de la espina dendrítica, hemos transfectadas DIV 23 neuronas corticales con una construcción EGFP por 2 días. Después de la transfección, las células pueden ser sometidos a tratamiento, y son fijados y procesados ​​para la CPI, donde se mejora la señal de las buenas prácticas agrarias para permitir una distribución uniforme a través de las dendritas (o neurona). La figura 2 muestra una imagen representativa de una neurona cortical transfectadas con GFP, fotografiado usando un microscopio confocal con un objetivo de 63X (NA 1.4) (Fig. 2A). Esto permite una detallada imágenes de alta resolución de las espinas dendríticas (Fig. 2B). Detallado análisis morfométricos de las espinas dendríticas se llevan a cabo en nuestro laboratorio utilizando el programa Metamorph. Este programa nos permite no sólo medir la morfología de la espina dendrítica, sino también para examinar la localización de las proteínas endógenas. Una visión general de cómo realizar este análisis se presenta en la Figura 2 (Fig. 2C-G).

Un efecto bien caracterizados de la actividad dependiente de los estímulos es un aumento en el tamaño de la espina dendrítica 2. La Figura 3 muestra representativa de lapso de tiempo de imágenes de una espina dendrítica de un DIV 24 EGFP neuronas corticales que expresan, fotografiado durante 30 minutos antes y después de un estímulo depende de la actividad. Este experimento de lapso de tiempo confirma que dependen de la actividad de estímulos aumentar el tamaño de la espina dendrítica (Fig. 3A, B). Para examinar la motilidad columna basal, las imágenes fueron adquiridas en los puntos de tiempo 0, 50 y 100 minutos, y las extensiones de la columna vertebral, la retracción, la movilidad y protrusiva cabeza morphing se midieron por separado y combinados como la movilidad total. Figura 3C-D confirma que, incluso en condiciones basales, las espinas dendríticas de las neuronas corticales mostrar un cierto grado de movilidad.

Figura 1
Fig. 1. La comparación de las áreas medidas y real de microesferas fluorescentes barras de error. Representan la desviación estándar de las áreas medidas. Imágenes de microesferas de 0,2 m, 0,52 m y m 1. Barra de escala = 5 micras.

Figura 2
Fig. 2. Cuantificación de la morfología de la columna vertebral y SI. A. Imagen de DIV 25 EGFP-expresando neuronas corticales cultivadas. Aumentos B. alta de la morfología típica de la espina dendrítica se encuentra en las neuronas corticales. C. EGFP y proteína endógena (GluR1) superposición. D. Colapso de la serie Z de una pirámide EGFP transfectadas dendritas de células, la división entre el eje y la columna vertebral se traza manualmente E. Distinto, regiones superthreshold se esbozó por Metamorph y cuantificados F. mano trazó las neuronas utilizan para determinar la longitud de la columna vertebral, la anchura y sección transversal G. determinadas regiones... por Metamorph que corresponden a las espinas. describe H. columna vertebral será transferido a la imagen del canal rojo (proteína endógena) para cuantificar la columna específica de la señal. IK. Para cuantificar receptor o grupo de proteínas sinápticas SI, proyección de imágenes de la serie Z se utilizan. I. Antecedentes del eje dendríticas IF (cuadrado amarillo) se resta para generar un "fondo-resta" de la imagen. J. Esta imagen es un umbral y el programa automáticamente medidas de la zona de racimo, la densidad lineal, y el valor total de gris (si la intensidad) K. imagen de un umbral a partir de barras de escala H., A = 15 m, B = 1 micra.

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Fig. 3. Dependientes de la actividad los cambios en la morfología de la columna vertebral, y la motilidad basal de las espinas dendríticas. A. Tiempo de imágenes a intervalos de una espina dendrítica representante antes y después de la adición de un estímulo depende de la actividad. Dependen de la actividad de los estímulos fueron inducidos por el cambio de los medios experimentales de ASCF contiene Mg2 + y APV a ACSF sin Mg2 + y APV, pero con 10 micras de glicina B. La cuantificación del área de la espina dendrítica (tamaño), normalizada a punto -30 minutos de tiempo (30 minutos antes de la perfusión). imágenes C. Representante de los puntos de 0, 50 y 100 minutos de tiempo de la motilidad espina dendrítica. Las imágenes de arriba muestra la superposición de 0 (color rojo), 50 (verde) y 100 (azul) los puntos de minutos de tiempo, mientras que las imágenes a continuación son cada momento por separado. Asterisco indica extensión de la columna, la flecha blanca indica la retracción columna vertebral, cabeza de la flecha verde indica la motilidad protrusiva, la cabeza abierta flecha amarilla indica la cabeza columna D. morphing cuantificación de los parámetros de la columna vertebral dendríticas movilidad y motilidad total E. 20X imagen de las neuronas corticales que expresan EGFP siguiente imagen.. sesión para determinar la salud de la célula.

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Las técnicas descritas anteriormente para el análisis cuantitativo detallado de la morfología de la espina dendrítica, densidad lineal y la movilidad en fijos o en vivo las neuronas corticales primaria se centran en la comprensión de los efectos de la post-sináptica mecanismos que pueden contribuir a neuropatologías. Un enfoque similar puede utilizarse para cuantificar la morfología de la columna vertebral o de la motilidad en cualquier neurona espinosa, incluyendo piramidales del hipocampo, Purkinje, o neuronas espinosas medianas.

El protocolo aquí descrito se puede adaptar para ver las propiedades fundamentales de las proteínas sinápticas y / o los efectos de los tratamientos farmacológicos en las espinas dendríticas. Además, se puede utilizar para evaluar los cambios en la localización de las proteínas endógenas sinápticas que van desde proteínas de andamiaje de receptores de glutamato. Además, permite no sólo un análisis detallado morfométricos de las espinas fijas, sino también la medición de los efectos de las proteínas sinápticas o el tratamiento farmacológico en la motilidad espina dendrítica. Estas técnicas de time-lapse de imágenes también se pueden modificar para examinar el tráfico de proteínas, con o sin al mismo tiempo examinar la morfología de la espina dendrítica.

El análisis detallado de la morfología de la espina dendrítica y la movilidad es una herramienta esencial para la investigación de los efectos potenciales de las proteínas mutantes sináptica, y cómo las mutaciones en estas proteínas asociados a enfermedades sináptica puede afectar a la estructura y función de la sinapsis, lo que contribuye a la fisiopatología de una serie de trastornos de la el cerebro.

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Disclosures

La producción de este trabajo fue apoyado por MetaMorph (Molecular Devices, Inc.).

Acknowledgments

Damos las gracias a Kelly Jones para la edición de cuidado. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención R01MH 071316, la Asociación de Alzheimer, la Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión (NARSAD), y la Alianza Nacional para la Investigación del Autismo (NAAR) (PP), la American Heart Association Postdoctoral Fellowship (DPS), de América Becas predoctorales Heart Association (KMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

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References

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Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas
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Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

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