Summary

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Published: July 13, 2011
doi:

Summary

Numerosos estudios recientes han identificado mutaciones en las proteínas sinápticas asociadas a patologías cerebrales. Primaria neuronas corticales cultivadas ofrecen una gran flexibilidad en el examen de los efectos de estas proteínas asociadas a la enfermedad en la morfología y motilidad de la espina dendrítica.

Abstract

Las espinas dendríticas son los sitios de la mayoría de las conexiones excitatorias en el cerebro, y forman el compartimiento de post-sináptica de las sinapsis. Estas estructuras son ricas en actina y han demostrado ser altamente dinámico. En respuesta a la plasticidad clásica Hebb así como señales de neuromoduladores, las espinas dendríticas pueden cambiar de forma y número, que se cree que es fundamental para el perfeccionamiento de los circuitos neuronales y la transformación y el almacenamiento de información dentro del cerebro. Dentro de las espinas dendríticas, una compleja red de proteínas de enlace de señales extracelulares con la cyctoskeleton actina que permite el control de la morfología de la espina dendrítica y el número. Estudios neuropatológicos han demostrado que un número de estados de enfermedad, que van desde la esquizofrenia hasta trastornos del espectro autista, mostrar la morfología anormal de la espina dendrítica o números. Por otra parte, recientes estudios genéticos han identificado mutaciones en muchos genes que codifican las proteínas sinápticas, lo que lleva a sugerir que estas proteínas pueden contribuir a la plasticidad de la columna vertebral aberrante que, en parte, la base de la fisiopatología de estos trastornos. Con el fin de estudiar el papel potencial de estas proteínas en el control de las morfologías dendríticas columna / número, el uso de cultivos de neuronas corticales ofrece varias ventajas. En primer lugar, este sistema permite obtener imágenes de alta resolución de las espinas dendríticas en las células fijadas, así como time-lapse de imágenes de células vivas. En segundo lugar, este sistema in vitro permite una fácil manipulación de la función de proteínas mediante la expresión de las proteínas mutantes, caída por las construcciones shRNA, o tratamientos farmacológicos. Estas técnicas permiten a los investigadores comienzan a analizar el papel de las enfermedades asociadas a proteínas y para predecir cómo las mutaciones de estas proteínas pueden funcionar in vivo.

Protocol

El protocolo aquí descrito puede ser utilizado para examinar la morfología de la espina dendrítica y la dinámica de cualquier sistema de cultivo primario. 1. La preparación de cultivos primarios de neuronas corticales Prepare de alta densidad cultivos de neuronas corticales de rata Sprague-Dawley E18 embriones y la cultura en la glía acondicionado medio libre de suero 1-2. La eutanasia a una rata preñada (E18), de acuerdo a los procedimientos de ACUC, r…

Discussion

Las técnicas descritas anteriormente para el análisis cuantitativo detallado de la morfología de la espina dendrítica, densidad lineal y la movilidad en fijos o en vivo las neuronas corticales primaria se centran en la comprensión de los efectos de la post-sináptica mecanismos que pueden contribuir a neuropatologías. Un enfoque similar puede utilizarse para cuantificar la morfología de la columna vertebral o de la motilidad en cualquier neurona espinosa, incluyendo piramidales del hipocampo, Purkinje, o neuronas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a Kelly Jones para la edición de cuidado. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención R01MH 071316, la Asociación de Alzheimer, la Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión (NARSAD), y la Alianza Nacional para la Investigación del Autismo (NAAR) (PP), la American Heart Association Postdoctoral Fellowship (DPS), de América Becas predoctorales Heart Association (KMW).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)  
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)  
Poly-D-Lysine Sigma P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049  
B27 Invitrogen 17504044  
Glutamine Invitrogen 21051024  
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148  
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004  
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019  
DMEM Invitrogen 11965092  
HEPES MediaTech Cellgro 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Chemicals FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029  
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034  
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner RC-30HV  
Temperature controller unit Warner TC-344B  
MetaMorph Universal Imaging    

References

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Cite This Article
Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

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