Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Summary

Zahlreiche neuere Studien haben Mutationen in synaptischen Proteinen mit Hirnerkrankungen assoziiert identifiziert. Primär kultivierte kortikalen Neuronen bieten eine große Flexibilität bei der Prüfung der Auswirkungen dieser Krankheit assoziierte Proteine ​​auf dendritischen Dorn Morphologie und Motilität.

Abstract

Dendritischen Dornen sind die Seiten der Mehrheit der exzitatorischen Verbindungen im Gehirn, und bilden die postsynaptischen Fach von Synapsen. Diese Strukturen sind reich an Aktin und haben gezeigt, dass eine hohe Dynamik. Aufgrund der klassischen Hebb'sche Plastizität sowie neuromodulatorischen Signale können dendritischen Dornen in Form und Zahl, die vermutlich von entscheidender Bedeutung sein für die Veredelung von neuronalen Schaltkreisen und die Verarbeitung und Speicherung von Informationen im Gehirn ist. Innerhalb dendritischen Dornen, Link ein komplexes Netzwerk von Proteinen extrazelluläre Signale mit dem Aktin cyctoskeleton ermöglicht die Kontrolle von dendritischen Dorn Morphologie und Anzahl. Neuropathologische Studien haben gezeigt, dass eine Reihe von Erkrankungen, angefangen von Schizophrenie, Autismus-Spektrum-Störungen, abnorme dendritischen Dorn Morphologie oder Zahlen anzuzeigen. Darüber hinaus haben die jüngsten genetischen Studien Mutationen in zahlreichen Genen, die synaptischen Proteine ​​kodieren identifiziert, was für Vorschläge, dass diese Proteine ​​an aberranten Wirbelsäule Plastizität, die zum Teil unterliegen der Pathophysiologie dieser Erkrankungen beitragen können. Um die mögliche Rolle dieser Proteine ​​bei der Kontrolle der dendritischen Dorn Morphologien / Anzahl Studie bietet der Einsatz von kultivierten kortikalen Neuronen mehrere Vorteile. Erstens ermöglicht dieses System für hochauflösende Bildgebung der dendritischen Dornen in fixierten Zellen sowie Zeitraffer-Imaging lebender Zellen. Zweitens ermöglicht diese in vitro-System für einfache Handhabung der Funktion des Proteins durch Expression von mutierten Proteinen, Knockdown von shRNA-Konstrukte oder medikamentöse Behandlungen. Diese Techniken können die Forscher damit beginnen, die Rolle der krankheits-assoziierte Proteine ​​zerlegen und vorherzusagen, wie Mutationen dieser Proteine ​​können in vivo-Funktion.

Protocol

Die hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um dendritischen Dorn Morphologie und Dynamik in jeder primären kultivierten Systems zu untersuchen.

1. Vorbereitung der primären kortikalen Neuronen Kulturen

1. Bereiten Sie High-Density-kortikalen Neuronen Kulturen aus Sprague-Dawley Ratten E18 Embryonen und Kultur in Glia-bedingten serum-freiem Medium ^1-2.
2. Euthanize eine schwangere Ratte (E18) nach ACUC Verfahren; schnell zu entfernen Gebärmutter (mit Föten in it) und in eine 100 mm Petrischale auf Eis.
3. Aufschneiden Gebärmutter und Amnionmembran, halten Fötus durch den Hals (Nabelschnur intakt) mit einer Pinzette, eine andere Zange zu schälen Kopfhaut von hinten nach vorne, und schlitzte den Schädel öffnen mit einem scharfen Zange entlang der Mittellinie von hinten nach vorne Spitze.
4. Entfernen Sie das gesamte Gehirn mit einer gebogenen Pinzette (in einer Kugel motion) und in eine 100 mm Petrischale mit 10 ml eiskaltem Ca2 ⁺ - und Mg ² +-freiem HBSS.
5. Halten Hirnstamm mit einer Pinzette, separate Halbkugeln mit einem anderen Pinzette entfernen Hippocampus und Striatum, separate Kortex und sorgfältig schälen Rindengewebe off von Hirnhäuten.
6. Pool seziert kortikalen Gewebe, kurz zerkleinern und in ein 15 ml Röhrchen mit 4 ml vorgewärmten Trypsin / EDTA (0,25% Trypsin, 0,53 mM EDTA; HyQ Trypsin aus HyClone SH30042.01); in 37 ° C Wasserbad inkubieren ~ 15 min; entfernen Trypsin / EDTA so viel wie möglich mit einem Einweg-Kunststoff-Pipette 1,5 ml neuronalen Medium.
7. Distanzieren der verdauten Gewebe mechanisch durch vorsichtiges Pipettieren mit einer 5 ml Pipette (~ 10 Schläge, vermeiden Luftblasen), 2 ml Medium, lassen niederzulassen für 30 sec, dann Transfer 2 ml Überstand in ein 15 ml Tube.
8. Wiederholen Sie Schritt 6 zweimal (sollte etwa ~ 15 min insgesamt dauern).
9. Spin Zellsuspension bei 200 g für 2 min.
10. Überstand entfernen (mit einem 5 ml Pipette - nicht Vakuum absaugen); lockern das Pellet durch Umklappen Finger gegen den Boden; resuspendieren Zellpellet in 5 ml Medium und durch ein 40 &mgr; Zelle Sieb in eine 50 ml Tube.
11. Mix 10 ul Zellsuspension und 10 ul Trypanblau, Graf lebensfähigen Zellen (Trypanblau-Ausschluss) mit einer Zählkammer.
12. Typische Ausbeute: 5 x 10 ⁶ Zellen / Gehirn auf die gewünschte Dichte (z. B. 1,5 x 10 ⁶ Zellen / ml) für die Beschichtung zu verdünnen.
13. Füllen Kultur-Platten mit Beschichtung Medien (Neurobasal Medien mit 2% B27, 0,5 mM Glutamin und 1% Penicillin ergänzt: stretomycin) (Gesamtvolumen minus plating Volumen) mit 18 mm rund oder 22x22 mm ² Deckgläschen mit Poly-D-Lysin beschichtet ( 0,2 mg / ml, Sigma) in 0,1 M Boratpuffer (3.1g / L Borsäure, 4,8 g / L Borax, pH 8,5, sterilfiltriert) gelöst; Gesamtvolumen für 12-Well-Platte = 0,8 ml / well.
14. Platte Neuronen an der Dichte in einem nächsten Schritt vorgesehen ist; zerstreuen Zellen gleichmäßig durch sanfte Schaukeln / tippen.
15. Für 12-Well-Platten (3,5 cm ² / gut): (hallo-Dichte 3 x 10 ⁵ / gut = 857/mm ²⁾ (Mitte Dichte 1,5 x 10 ⁵ / gut = 430/mm ^2); 6-well Platten (9.6cm ² / gut): (hallo-Dichte 9 x 10 ⁵ / gut = 624/mm ²⁾ (Mitte Dichte 4,5 x 10 ⁵ / gut = 312/mm ^2).
16. Eine Stunde nach dem Ausplattieren, ersetzen alle durch frisches Medium (Neurobasal Medien mit 2% B27, 0,5 mM Glutamin und 1% Penicillin ergänzt: stretomycin). Da Zelltrümmer neigen dazu, in der Mitte des Brunnens, schwenken die Platten zunächst auf die Entfernung von Schmutz zu erleichtern beizulegen; darauf achten, nicht zu lassen Zellen trocken ist jederzeit möglich.
17. Ändern ½ Medium zweimal pro Woche danach (remove ~ 300-350 ul aus jedem Well, und fügen Sie 400 ul erwärmt frischen Fütterung Medium in jede Vertiefung).
    Optional: Auf DIV 4 mit 200 uM D, L-Amino-phosphonovalerate Säure (D, L-APV, Ascent Scientific) zur Fütterung Medium; Kultur Neuronen in Neurobasal Medium mit 2% B27, 0,5 mM Glutamin und 1% Penicillin ergänzt: stretomycin + 200 uM APV.
18. Wachsen primären Kulturen von kortikalen Neuronen für 24-28 Tage in vitro (DIV), da zu dieser Zeit-Punkt dendritischen Dornen zeigen eine reife Morphologie (dh sie bilden Verbindungen mit präsynaptischen Partner und haben einen klaren Kopf-Struktur) und entsprechen der frühen Adoleszenz in Nagetieren ^3-4. Neuronen auf 18 mm runde Deckgläser angebaut werden transfiziert und behandelt pharmakologisch werden, bevor sie fest, immungefärbt und aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop und für detaillierte morphometeric Analyse der dendritischen Dornen. Cells auf 22x22 mm ² Deckgläschen gezüchtet werden dann im Zeitraffer Bildgebung Experimente verwendet werden, um dendritischen Dorn Dynamik zu untersuchen.

2. Transfektion von primären kultivierten kortikalen Neuronen

1. Kortikalen Neuronen sind 2-3 Tage vor Experimenten mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ⁵ transfiziert.
2. Prepare "h-DMEM" durch den Ausgleich des pH-Wertes DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, kein Glutamin,Invitrogen 11965-092) mit 10 mM HEPES sterile (4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure; MediaTech CellGro 25-060-CI, 1M, pH 7). Warm bis 37 ° C.
3. Transfer Deckgläser zu 600/1000 ul (18/22x22 mm Deckgläser) vorgewärmten (37 ° C) neue Antibiotika-freien Mediums (Neurobasalmedium, B27, 0,5 mM Glutamin), und inkubieren Zellen in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator, ergänzt mit 5% CO ₂ für 30 Minuten.
4. Für jedes Deckglas, fügen Sie bezeichneten DNA-Menge (ein oder mehrere DNA-Plasmide, z. B. pEGFP auf Zellmorphologie und Tagged-Mutanten synaptischen Protein skizzieren; 1-2 ug je nach Konstruktion) auf 50 ul der h-DMEM; lassen für 5, Stand Minuten.
5. Für jedes Deckglas, fügen Sie 4 / 6 ul (18/22x22 mm Deckgläser) Lipofectamine 2000 bis 50 ul h-DMEM; lassen für 5 Minuten stehen lassen.
6. Gründlich mischen Rohre aus den Schritten 1.3 & 1.4, mindestens für 20 Minuten in einer feuchten 37 ° C Inkubator mit 5% CO ₂ ergänzt. Komplex ist für bis zu 6 Stunden stabil nach Angaben des Herstellers.
7. Add Lipofectamine 2000/DNA Mischung aus Schritt 1.5 tropfenweise zu den Zellen. Inkubieren Zellen in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit 5% CO2, für 4 Stunden ergänzt.
8. Mit Fütterung Medium aus Schritt 1.1 (300/600 ul), zu ergänzen, mit vorgewärmten (37 ° C) 400 / 800 ul frisch Fütterung Medium (18/22x22 mm Deckgläschen). Nach dem Schritt 1,6, Transfer Deckgläsern in Medium mit alten und frischen Fütterung Medium.
9. Lassen Ausdruck von Plasmiden für 2-3 Tage fortgesetzt werden.

3. Behandlung der primären kultivierten kortikalen Neuronen auf 18-mm-Deckgläschen gewachsen

Neuronen auf 18 mm Deckgläschen, die zuvor transfizierten gewachsen, kann auch einfach auf pharmakologische Behandlungen unterzogen werden.

1. Bereiten ACSF (künstliche Liquor; in mM: 125 NaCl, 2,5 KCl, 26,2 NaHCO _3, 1 NaH ₂ PO _4, 11 Glucose, 5 HEPES, 2,5 CaCl ₂ und 1,25 MgCl ₂ mit 200 uM D, L-APV). Warm bis 37 ° C. Pre-Inkubation Deckgläser in 900 ul warmen ACSF für 30-60 Minuten. Eine Vorbehandlung mit Inhibitoren können während dieser Zeit durchgeführt werden.
2. Bereiten pharmakologische Wirkstoffe / Fahrzeug aus Stammlösungen zu einem 10X Arbeitskonzentration; eine Verdünnung von Lösungen in ACSF. Vorsichtig agent / Fahrzeug-Zellen (Endvolumen von 1000 ul, bis zu einer Endkonzentration von 1X-Agent / Fahrzeug) und erlaubt die Behandlung weitermachen für die gewünschte Zeit ^5.
3. Nach der Behandlung (n), fix Zellen und Verfahren zur immunocytohistochemistry.

4. Fixation und immunocytohistochemistry (ICC)

1. Fix Neuronen entweder in 4% Formaldehyd / 4% Saccharose PBS (800 ul) für 20 Minuten bei Raumtemperatur oder in 4% Formaldehyd / 4% Saccharose PBS (800 ul) für 10 Minuten bei Raumtemperatur von den 2X-Wäschen in PBS gefolgt , gefolgt von 10 Minuten fix mit vorgekühlte (-20 ° C) Methanol (800 ul) bei 4 ° C. Methanol funtioniert durch Denaturierung und Ausfällen von Proteinen. Dieses Verfahren führt zu einer Demaskierung der Proteine ​​in der postsynaptischen Dichte (PSD), sowie in Lipid-reichen Gebieten.
2. Wash Deckgläschen in PBS (800 ul), 2x, für jeweils 10 Minuten.
3. Permeabilisieren und Block Zellen gleichzeitig in PBS mit 2% normalem Ziegenserum und 0,1% Triton-X-100 (800 ul) für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
4. Add primären Antikörper gegen GFP, Epitop-Tag erhöht (z. B. His, myc, V5) oder endogene Proteine, um PBS mit 2% normalem Ziegenserum in der entsprechenden Konzentration. Nehmen Sie eine 15 cm Schüssel, teilen sie in Quadrate, nummerieren Sie sie, und decken mit Parafilm. Fügen Sie etwa 80 ul von Antikörper-und Block-Gemisch auf Parafilm (ein Tropfen pro Quadratmeter), und legen Deckglas auf Antikörper / Block-Mix mit Zellen nach unten. Über Nacht bei 4 ° C inkubiert.
5. Wash Deckgläschen in PBS, 3x für jeweils 15 Minuten.
6. Verdünnen Alexa-konjugierten Sekundärantikörper (Invitrogen) in PBS mit 2% normalem Ziegenserum in der entsprechenden Konzentration. Inkubieren Sekundärantikörper in der gleichen Weise wie in Schritt 3,4, bei Raumtemperatur für 1 Stunde, vor Licht geschützt.
7. Wash Deckgläser eine weitere 3x 15 Minuten in PBS.
8. Berg Deckgläser auf Standard-Mikroskop-Objektträger mit ProLong Gold-Antifade Reagenz (Invitrogen).

5. Quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien

Wir erhalten konfokalen Bildern von Einzel-und Doppelzimmer-gefärbten Neuronen (Zellen, die GFP und konstruieren oder endogene Protein von Interesse) mit einem Zeiss LSM5 Pascal konfokalen Mikroskop. Für alle bildgebenden Experimenten Auswahl gesunder Pyramidenneuronen abzubildenden und in die nachfolgende Analyse verwendet werden. Gesunde Neuronen sind Zellen, die nicht zeigen Anzeichen von Blasenbildung oder Unbehagen aufgrund der Behandlung oder Fixierung und dass eine vollständige, ununterbrochene dendritischen Dorn enthalten.

1. Erwerben Sie Bilder von Neuronen mit einem 63x Öl-Immersions-Objektiv (Zeiss) mit einer NA (numerical Blende) von 1,4, wie ein Z-Serie von 3-8 Bildern, gemittelt 4-fach, mit 0,37 um Intervalle, 1024x1024 Pixeln bei einer Scangeschwindigkeit von 2,5 Sekunden pro Abschnitt. Kulturen, die direkt miteinander verglichen werden sollen, müssen mit der gleichen Aufnahme-Parameter abgebildet werden. 10-20 Neuronen / Zustand, die jeweils 3 bis 5 separaten Experimenten, und 2 Dendriten von 100 um pro Neuron analysiert werden sollten. Experimente ist zu tun, blind und auf Schwester Kulturen. Passen Detektor Gain und Offset noch schwach fluoreszierenden dünnen Dornen, ohne einen Heiligenschein um den Dendriten, so dass der Übergang zwischen dem Fluoreszenzsignal in der Wirbelsäule und der Hintergrund scharf ist, so dass eine präzise Quantifizierung gehören. Halten Sie die Aufnahme-Parameter das gleiche für alle Scans im gleichen Experiment.
2. GFP Bilder können erworben mit einem Argon-Laser-Linie, spannend bei 488 nm und das Sammeln mit einem Bandpassfilter bei 505-530 nm werden. Bilder von überexprimierten Proteinen oder endogene Proteine ​​immungefärbt mit einem Alexa 568 Sekundär-Antikörper (Invitrogen) kann unter Verwendung eines HeNe-Laser spannend bei 543 nm, und das Sammeln mit einem langen Pass-Filter bei 560 nm. Keep Laserleistungen auf ein Minimum zu vermeiden Bleichen von Proben.
3. Mit MetaMorph Software (Molecular Devices, Inc.), zwei-dimensional, Hintergrund-subtrahiert, maximale Projektion Rekonstruktionen von Z-Serie Bilder sind für morphometrische Analyse und Quantifizierung verwendet. Um die Morphologie der dendritischen Dornen zu untersuchen, Kollaps Z-Serie Bilder, kalibrieren Sie den nötigen Abstand, und dann Schwellenwert für alle Stacheln in einer Art und Weise beinhalten, dass der Schwellenwert entspricht exakt der Kontur des Stacheln (Abb. 2E, F). Nur Stacheln auf sekundären und tertiären Dendriten (Gesamtlänge von 100 um pro Neuron) zu messen, um die Variabilität zu reduzieren, und Messungen der Segmente müssen zwischen Verzweigungsstellen werden. Manuelles Umriss jedes Wirbelsäule, so dass es einen geschlossenen Perimeter (Abb. 2G) wird.
4. Messen Sie die folgenden Wirbelsäule Parameter automatisch in MetaMorph: Rückenlänge, Wirbelsäule Breite, Querschnittsfläche und dendritischen Dorn lineare Dichte. Exportieren Sie die dendritischen Dorn morphometrischen Parameter in Excel zur Quantifizierung. Verwenden Sie Student ungepaarten t-Tests auf die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen beiden Gruppen zu bestimmen; one-way ANOVA können verwendet werden, um drei oder mehr Gruppen zu vergleichen, gefolgt von Tukey-b post hoc für multiple Vergleiche. Die statistische Analyse kann in Excel, GraphPad oder SPSS durchgeführt werden. Analysieren kumulierten Grundstücke mit Kolmogorov-Smirnov-Test (KS-Test) ^2,5-6.

6. Quantitative Immunfluoreszenz (IF)

Die Quantifizierung der Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen bestimmte synaptische Proteine, visualisiert mit einem Alexa 568 Sekundär-Antikörper (Invitrogen), können verwendet werden, um Änderungen in der Cluster-und synaptischen Lokalisation von endogenem synaptischen Proteinen zu untersuchen.

1. Erwerben Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop, wie oben beschrieben. Verwenden Sie ein Argon und einem HeNe-Laser (siehe oben) zu Bild Doppel-gefärbten Neuronen. Nur image gesunde pyramidalen Neuronen, die nicht angezeigt noch keine Anzeichen von Leiden.
2. Für Messungen der Fluoreszenzintensität, subtrahieren den Hintergrund entsprechend der dendritischen Schaft (Abb. 2I, gelbes Quadrat) zu einem "Hintergrund-Abzug" Bild (Abb. 2J) mit MetaMorph generieren. Ebenso Schwelle Bilder gehören Cluster mit Intensität von mindestens zwei fach über dem benachbarten Dendriten (Abb. 2 K). Überblick Regionen entlang Dendriten (100 um pro Neuron) mit dem "Perimeter"-Programm (Abb. 2D) und automatisch messen die lineare Dichte (Anzahl/100 um Dendriten Länge) und integrierte Intensität (insgesamt IF Intensität) der einzelnen synaptischen Cluster mit MetaMorph ^7-9.
3. Zur Messung relativer Wirbelsäule Inhalt eines synaptischen Protein, zunächst feststellen, Protein Clustering durch Binarisierung der GFP Bild Wirbelsäule Morphologie (Abb. 2E, F) mit MetaMorph bestimmen. Übertragen Sie die Regionen von Interesse, dass nur sind Stacheln, um Bilder von dem Protein von Interesse in den anderen Kanal (Abb. 2G, H) erfasst. Zählen Sie die Anzahl der Protein-Cluster und messen die Immunfluoreszenz integrierte Intensität innerhalb Stacheln an der Wirbelsäule Eiweißgehalt zu beurteilen.
4. Exportieren Sie die IF-Parameter der synaptischen Proteinen in Excel zur Quantifizierung. Verwenden Sie Student ungepaarten t-Tests auf die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen beiden Gruppen zu bestimmen; one-way ANOVA können verwendet werden, um drei oder mehr Gruppen zu vergleichen, gefolgt von Tukey-b post hoc für multiple Vergleiche. Die statistische Analyse kann in Excel, GraphPad oder SPSS durchgeführt werden.

7. Zeitraffer-Imaging

Um dendritischen Dorn Dynamik, wie Veränderungen in der Wirbelsäule Beweglichkeit oder in der Wirbelsäule Morphologie der einzelnen Stacheln, in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Krankheit assoziierten synaptischen Proteinen zu untersuchen, wachsen primären kortikalen Neuronen auf 22x22 mm ² Deckgläschen für 24-28 DIV kultiviert. Neurons kann mit GFP / mCherry Doppel-transfiziert, um Zellmorphologie zu definieren, und fluoreszenzmarkierten mutierten synaptischer Proteine ​​wie oben beschrieben. Für alle bildgebenden Experimenten, wählen Sie gesund pyramidalen Neuronen, beide Konstrukte, können diese Zellen zur pharmakologischen Behandlung unterzogen werden, abgebildet und in nachfolgenden Analysen.

1. Pre-Inkubation Neuronen auf 22x22 mm Deckgläschen in 1,5 ml ACSF gewachsen für 30-60 Minuten in einer feuchten 37 ° C Inkubator mit 5% CO ₂ ergänzt. Zellen können auch mit Drogen in dieser Phase als auch vorbehandelt werden. Nach pre-incubation/treatment, Transfer-Zellen zu einem geschlossenen Abbildungsstufe Kammer (Warner, RC-30HV). Achten Sie auf eine Temperatur von 37 ° C mit einer Steuereinheit (Warner, TC-344B) ^2,5-6,10.
2. Um Wirbelsäule Beweglichkeit, pre-treat-Zellen mit Drogen-oder Fahrzeug für bis 30-60 Minuten vor der Übertragung der Zellen an die Bildgebung Kammer zu prüfen. Dies ermöglicht die genügend Zeit für das Medikament / Fahrzeug second messenger Wege innerhalb der Nervenzelle zu initiieren. Erwerben Sie Bilder durch einen 63X Objektiv (Ziess, NA 1,4) mit 2X durchschnittlich bei 10 Minuten-Takt. Wählen Sie gesunde Neuronen mit insgesamt pyramidal Morphologien, die GFP / mCherry oder Fluoreszenz-markierte Protein. Zur Minimierung von Lichtschäden, reduzieren Laserleistung auf 0.5-1%. Vergleiche gegen Drogen-behandelten Zellen Vehikel-behandelten demonstrieren Veränderungen in der Wirbelsäule Beweglichkeit. Alternativ kann der Wirbelsäule Beweglichkeit vor und nach der Behandlung beurteilt werden, durch Perfusion von Drogen / Fahrzeug (siehe unten). Sammeln Sie Z-Stapel zu jedem Zeitpunkt.
3. Um Änderungen in dendritischen Dorn Morphologie im Laufe der Zeit, Bild Deckgläser für 1 Stunde Weg zur Grundlinie Veränderungen in der Morphologie zu etablieren. Zu dieser Zeit versorgen die Droge / Fahrzeug in der Imaging-Kammer unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe (Gilson, Minipuls 3) und Bild Neuron für eine weitere Stunde. Erwerben Sie konfokalen Z-Stapel mit einem 63X Öl-Objektiv (Ziess, NA 1,4), mit 2X durchschnittlich alle 10 Minuten. Reduzieren Laserleistung auf 0.5-1% auf Lichtschäden zu minimieren.
4. Am Ende jeder Bildgebungssitzung, erhalten eine 20X Bild des gesamten Neuron zu prüfen, Niveau Lichtschäden. Alle Neuronen Anzeichen von Leiden sollen aus Quantifizierung verzichtet werden. Z-Stapel von jedem Punkt sollte in 2D-Projektionen in Metamorph reduziert werden. Je nach Bildqualität und die Höhe der Transfektion, einer medianen-Pass-Filter oder Hintergrund-Subtraktion kann in Metamorph angewendet werden, um klare Bilder für die Analyse zu produzieren.
5. Zur Beurteilung der Wirbelsäule Morphing und Motilität, sollten die Bilder am Anfang, Mitte und Ende der 100 Minuten Imaging-Sitzung genommen werden farblich gekennzeichnet und überlagert in MetaMorph. Mindestens 100 um Dendriten pro Zelle analysiert werden müssen. Die gesamte Wirbelsäule Beweglichkeit Fraktion wird als die Gesamtzahl der Motilität Ereignisse, dh Verlängerung, Widerruf, Leiter Morphing oder protrusiven Beweglichkeit normalisiert, um Wirbelsäule Zahl ^6,11 definiert. Diese Methode misst die Häufigkeit von Ereignissen, ohne Rücksicht auf ihre Größe, sondern bündelt alle Arten von Veranstaltungen und ist eine allgemeine Schätzung der gesamten Beweglichkeit. Ein protrusive Ereignis gilt als die Erscheinung einer neuen, vorübergehenden Vorsprung von einer Wirbelsäule Kopf oder dendritische Welle definiert. Ein Rückzug Veranstaltung ist als das Verschwinden eines bestehenden oder transiente Vorsprung auf einen Rücken Kopf oder dendritische Welle befindet definiert. Die Summe des Vorsprungs und Erweiterung Ereignisse werden durch die Gesamtzahl der Stacheln in der Region Dendriten, die quantifiziert wird geteilt.
6. Um zu beurteilen, Veränderungen in einzelnen Wirbelsäule Morphologie in Ansprechen auf medikamentöse Behandlung, messen Sie die Querschnittsfläche der dendritischen Dornen oder dendritischen Dorn lineare Dichte zum Zeitpunkt -1 Stunde (1 Stunde vor Perfusion), unmittelbar vor der Behandlung und zu jedem Zeitpunkt folgende Behandlung. Normalize jedem Zeitpunkt auf die 1 Stunde vor-to-Behandlung Zeitpunkt. Um zu bestimmen, dass Veränderungen in dendritischen Dorn Morphologie oder lineare Dichte nicht durch Lichtschäden, analysieren Neuronen mit Fahrzeug perfundiert. Unterschiede in den Mitteln kann durch den Student ungepaarten t-Tests oder eine Stichprobe t-Test bestimmt werden.

8. Alternative Ansätze und Schlüssel zum Erfolg

1. Wir haben Kultivierung kortikalen Neuronen in Gegenwart von D beschrieben, L-APV, einem NMDA-Rezeptor-Inhibitor, vom DIV 4 bis zur Fälligkeit (DIV24-28). Anzumerken ist, dass während Kultivierung kortikalen Neuronen in Gegenwart von D, L-APV Nutzen der Erhaltung der Gesundheit der kortikalen neuronalen Kulturen langfristig die Anwesenheit von D, L-APV kann Synapse Entwicklung beeinflussen werden. Als eine solche Alternative ist es, Kultur Neuronen in der Abwesenheit von D, L-APV ^2,5. Wenn Kultivierung Neuronen in der Abwesenheit von D, sollte L-APV besonderes Augenmerk auf die allgemeine Gesundheit der Kulturen geschenkt werden, da es zu einer Erhöhung Chance Zelltod durch zu hohe Ca2 + Zytotoxizität über überaktiv NMDA-Rezeptor-Aktivierung.
2. Die neuronalen Kulturen in diesem Protokoll beschriebenen verwendet werden, um Mechanismen, die relevant sind für die Regulierung der dendritischen Dorn Morphologie und Motilität der dendriti untersuchenc Stacheln Anzeige einer reifen Morphologie (dh sie bilden Verbindungen mit präsynaptischen Partner und haben einen klaren Kopf-ähnliche Struktur) 2,4,5. Alternativ Kulturen nutzen bereits zu einem früheren Zeit-Punkt kann zB DIV11-16, besser geeignet sein, um Fragen relevant für dendritischen Dorn Bildung oder Regulierung von dendritischen Dornen während der frühen Entwicklung zu begegnen.
3. Eine Alternative zur Verwendung der konfokalen Mikroskopie ist es, wide-field Auflicht-Fluoreszenz zu verwenden, um Bilder von behandelten kultivierten kortikalen Neuronen zu erwerben. In Kombination mit geeigneten Dekonvolutionsalgorithmen können detaillierte morphometrische Analyse der Stacheln in festen oder lebenden Zellen hergestellt werden. Darüber hinaus ist es möglich, alternative Software, wie ImageJ (Verwendung http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) oder Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns . html ), die freie Software, für die Analyse von dendritischen Dorn Morphologie.
4. Bei der Prüfung dendritischen Dorn Motilität / Morphing mit Zeitraffer-Imaging, darauf hinzuweisen, dass die Verwendung von kürzeren Time-Lapse Abständen, z. B. 5-10 Minuten, kann eine viel genauere Analyse der dendritischen Dorn turnover2, 5 liefern. Verwendung von kürzeren Zeitabständen auch identifizieren kann schneller Formen der Wirbelsäule Morphing, die nicht erkannt würden mit größeren Zeitabständen werden.
5. Die Verwendung von kultivierten kortikalen Neuronen hat eine Reihe von Nachteilen und Bedenken, die berücksichtigt werden müssen. Erstens ist ein Anliegen der Verwendung von kultivierten kortikalen Neuronen, dass es möglicherweise Variabilität zwischen den Kulturen, die Parameter wie dendritischen Dorn Dichte auswirken können. Als solches ist es wichtig, dass die folgenden Punkte sorgfältig eingehalten werden, um die geringste Menge an Variabilität zu gewährleisten. Erstens sollte Kultivierung Parameter und Reagenzien gehalten so konsistent wie möglich zusätzlich zu einer guten Kultivierung Praktiken werden, dies wird erheblich reduziert die Höhe der Variabilität zwischen den Kulturen. Zweitens ist es wichtig, dass alle Versuche zur gleichen Zeit-Punkt durchgeführt werden, und auf Schwester Kulturen. Neben der Zeit-Punkt, an dem Experimente durchgeführt werden sollten sorgfältig ausgewählt werden, damit der Experimentator die entsprechenden Fragen zu stellen (siehe Punkt 2 oben). Schließlich ist es wichtig, dass entsprechende Kontrollen in allen Experimenten verwendet werden, so dass die Behandlung Bedingungen immer untersucht werden relativ zu diesen internen Kontrollen. Dieses Programm wird alle Anliegen der Variabilität zwischen den Kulturen.
6. Die Verwendung von kultivierten kortikalen Neuronen ist ein mächtiges Werkzeug in die Forscher kritisch zu untersuchen die Mechanismen, die für die Regulierung der dendritischen Dorn Morphologie und Motilität sind. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Kulturen nicht rekapitulieren einer in vivo-Situation, und Komponenten wie kortikale Organisation und die Wirkung von anderen Zelltypen, wie zB Gliazellen, auf Synapsenbildung nicht in dem oben beschriebenen System angesprochen werden. Dennoch kann ein solches System verwendet werden, um potenziell entscheidenden Mechanismen der Regulation der dendritischen Dorn Morphologie und Motilität zu identifizieren.

9. Repräsentative Ergebnisse

Die oben beschriebenen Assays wurden entwickelt, um Veränderungen in dendritischen Dorn Morphologie, Anzahl und die Beweglichkeit in Reaktion auf pharmakologische Behandlungen und / oder genetische Manipulationen der Funktion von Proteinen in vitro zu untersuchen. In unserem Labor haben wir diese Techniken genutzt werden, um die Rolle des synaptischen Proteinen, die das Aktin-Zytoskelett in dendritischen Dornen regulieren zu charakterisieren, so verändern ihre Struktur ^2,9. Darüber hinaus haben wir diesen Test verwendet werden, um festzustellen, wie neuroaktiven Verbindungen, wie Neuromodulatoren können Änderungen in dendritischen Dorn Morphologie, Anzahl oder Form, entweder allein ^4,6,10, oder in Gegenwart von Aktivitäts-abhängigen Stimuli ^5-Laufwerk.

Zur Abschätzung der Genauigkeit unserer Messungen von 1D-oder 2D-Parameter, messen wir den Durchmessern und Flächen von fluoreszierenden Latex-Mikrosphären (Duke Scientific) mit bekannten Abmessungen (0,2, 0,52, 1,0 &mgr; m) in den gleichen Bedingungen wie die Neuronen im Verlauf der Studie montiert. Mit der gleichen Aufnahmebedingungen wie für Wirbelsäule-Messungen (63X NA = 1,4 Ölimmersionsobjektiv, LSM 5 Pascal) haben wir abgebildet die Mikrosphären, und dann festgestellt, deren Durchmesser und Flächen in Metamorph, ähnlich wie mit unserer Wirbelsäule Messungen. Wir haben dann die eigentlichen Messungen mit den bekannten Abmessungen der Mikrosphären im Vergleich.

Der Graph in Abbildung 1 (Abb. 1) zeigt, dass wir genau messen den Bereichen Mikrosphären von 0,52 und 1,0 um (Bereiche = 0,21 um ² und 0,78 um ² bzw.) (gemessen Standardabweichung ~ 15%; Hersteller ermittelten Standardabweichung ~ 9%). Selbst für den 0,2 mu m Mikrosphären unsere Messungen wurden relativ zu den tatsächlichen Abmessungen der Nähe (aber mit großen SD). Dies steht im Einklang mit den berechneten seitlichen Resol ution unserer konfokalen Mikroskop mit diesem Ziel, 0,3 um (mit der Gleichung Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) ^12. Dies ist deutlich besser als die axiale Auflösung, die bekanntermaßen für die konfokale und 2-Photonen-Mikroskop schlecht ist. Darüber hinaus haben wir experimentell bestimmt die seitliche (x / y-Achse) point spread function (PSF) durch Messung grün fluoreszierenden Mikrosphären von 200 nm Durchmesser (Duke Scientific) zu ~ 0,5 um. Diese Einschätzung wurde mit der Lochkamera offen durchgeführt, und es kann daher davon ausgegangen, dass, wenn das Loch geschlossen wird, dass die PSF tatsächlich kleiner sein werden. Dennoch, dieser wiederum bedeutet, dass wir in der Lage genau zu messen Bereichen größer als 0,196 &mgr; ² (Durchmesser = 0,5 mu m) werden. Ein Hinweis auf die tatsächliche seitliche PSF ist in (Svoboda et al.) 13 als "nicht viel weniger als 0,4 um, die auf einer Fläche von 0,16 &mgr; m ² ergeben würde." Diese Vergleiche und theoretische Überlegungen zeigen, dass wir genau messen Bereiche von Objekten ähnlicher Größe wie Stacheln, da die Abmessungen der Stacheln messen wir waren größer als diese Auflösungsgrenze (> 0,25 um ^2). Für solche Bedingungen "klassischen morphometrischen Techniken sind quantitative" ^13, was darauf hinweist, dass wir zuverlässig messen Wirbelsäule Bereichen, und genau zu vergleichen Wirbelsäule Morphologien in verschiedenen Behandlungsbedingungen.

Um genau zu messen dendritischen Dorn Morphologie, haben wir transfizierten DIV 23 kortikalen Neuronen mit einem EGFP Konstrukt für 2 Tage. Nach der Transfektion können Zellen auf die Behandlung unterworfen werden, und sind fixiert und für die ICC, wo der GFP-Signal verbessert, um für eine gleichmäßige Verteilung über die Dendriten (oder Neuron) zu ermöglichen. Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Bild der kortikalen Neuronen mit GFP transfiziert, aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63X Objektiv (NA 1,4) (Abb. 2A). Dies ermöglicht eine detaillierte, hochauflösende Bilder von dendritischen Dornen (Abb. 2B). Detaillierte morphometrische Analysen der dendritischen Dornen sind in unserem Labor mit der Metamorph-Programm durchgeführt. Dieses Programm erlaubt es uns nicht nur auf dendritischen Dorn Morphologie zu messen, sondern auch für die Lokalisierung von körpereigenen Proteinen zu untersuchen. Ein Überblick darüber, wie wir diese Analyse ist in Abbildung 2 (Abb. 2C-G) zur Verfügung gestellt.

Eine gut charakterisierte Wirkung von Aktivitäts-abhängigen Stimuli ist eine Erhöhung der dendritischen Dorn Größe ^2. Abbildung 3 zeigt repräsentative Zeitraffer-Bildgebung einen dendritischen Dorn eines DIV 24 kortikalen Neuronen exprimiert EGFP, 30 Minuten vor und nach einer Aktivitäts-abhängigen Stimulus abgebildet. Das Zeitraffer-Experiment bestätigt, dass Aktivitäts-abhängigen Stimuli dendritischen Dorn Größe zunehmen (Abb. 3A, B). Um zu untersuchen, basal Wirbelsäule Beweglichkeit wurden Bilder zu den Zeitpunkten 0, 50 und 100 Minuten erworben, und der Wirbelsäule Erweiterungen, Einziehungen, protrusive Motilität und Kopf Morphing wurden separat gemessen und kombiniert als Gesamt-Motilität. 3C-D bestätigt, dass auch unter basalen Bedingungen, dendritischen Dornen von kortikalen Neuronen ein gewisses Maß an Beweglichkeit anzuzeigen.

Abb.. 1. Vergleich der gemessenen und tatsächlichen Flächen von fluoreszierenden Mikrosphären. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der gemessenen Bereichen. Bilder von Mikrosphären von 0,2 um, 0,52 um und 1 um. Balken = 5 um.

Abb.. 2. Die Quantifizierung der Wirbelsäule Morphologie und IF. A. Bild von DIV 25 EGFP-exprimierenden kultivierten kortikalen Neuronen. B. hohe Vergrößerungen von typischen dendritischen Dorn Morphologie auf kortikalen Neuronen gefunden. C. EGFP und endogenes Protein (GluR1) zu überlagern. D. Collapsed Z-Serie eines EGFP-transfizierte pyramidal cell;. die Trennung zwischen Welle und Stacheln wird manuell verfolgt E. Deutlich, superthreshold Regionen werden dann von Metamorph beschrieben und quantifiziert F. Hand-zurückverfolgen Neuronen zur Wirbelsäule Länge, Breite und Querschnitt bestimmen G. Regionen bestimmt.. von Metamorph, dass entsprechen Stacheln. H. Spine skizziert werden, um den roten Kanal Bild (endogenes Protein) an der Wirbelsäule-spezifische Signal quantifizieren übertragen werden. IK. Um Rezeptor oder Synaptic Protein-Cluster zu quantifizieren IF, Projektionsbilder Z-Serie verwendet werden. I. Dendritische Welle Hintergrund IF (gelbes Quadrat) subtrahiert, um ein "Hintergrund-Abzug" Bild zu erzeugen. J. Dieses Bild wird dann Schwellenwert und das Programm automatisch Maßnahmen Cluster-Bereich, lineare Dichte und insgesamt Grauwert (IF Intensität) K. Schwellenwert Bild von H. Waage Bars, A = 15 m, B = 1 um.

g "alt =" Bild 3 "/>
Abb.. 3. Activity-abhängigen Veränderungen in der Wirbelsäule Morphologie und Motilität der basalen dendritischen Dornen. A. Zeitraffer-Imaging einer repräsentativen dendritischen Dorn vor und nach Zugabe eines Aktivitäts-abhängigen Stimulus. Activity-abhängige Stimuli wurden durch Einschalten der experimentellen Medien aus ASCF mit Mg2 ⁺ und APV zu ACSF ohne Mg2 + und APV, aber mit 10 um Glycin B. Quantifizierung der dendritischen Dorn (Format), normiert auf -30 Minuten-Zeitpunkt (30 induzierte Minuten vor der Perfusion). C. Repräsentative Bilder von 0, 50 und 100 Minuten Zeit, Punkte dendritischen Dorn Motilität. Top Bilder zeigt Überlagerung von 0 (rot), 50 (grün) und 100 (blau) Minute Zeitpunkten, während Bilder unter jedem Zeitpunkt separat. Asterisk bezeichnet Wirbelsäule gestreckt; weißer Pfeil bezeichnet Wirbelsäule Rückzug; grüne Pfeilspitze bezeichnet protrusive Motilität, offene gelbe Pfeilspitze bezeichnet Wirbelsäule Kopf Morphing D. Quantifizierung der dendritischen Dorn Motilität Parameter und insgesamt Motilität E. 20X Bild von kortikalen Neuronen exprimiert EGFP folgende Abbildung.. Sitzung für die Gesundheit der Zelle zu bestimmen.

Discussion

Die oben beschriebenen Techniken für die detaillierte quantitative Analyse der dendritischen Dorn Morphologie, lineare Dichte und Beweglichkeit in fester oder leben primären kortikalen Neuronen sind auf das Verständnis der Auswirkungen der postsynaptischen Mechanismen, die zu Neuropathologien beitragen können konzentriert. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden, um Wirbelsäule Morphologie und Motilität in allen stacheligen Neuron, einschließlich Hippocampus pyramidal, Purkinje, oder mittlere stachelige Neuronen zu quantifizieren.

Die hier beschriebene Protokoll angepasst, um die grundlegenden Eigenschaften der synaptischen Proteinen und / oder die Auswirkungen der pharmakologischen Behandlungen auf dendritischen Dornen aussehen. Darüber hinaus kann es verwendet werden, um Veränderungen in der Lokalisation von endogenem synaptischer Proteine ​​von Gerüstproteine ​​an Rezeptoren Glutamat zu beurteilen. Darüber hinaus ermöglicht es nicht nur detaillierte morphometrische Analyse von festen Stacheln, sondern auch die Messung der Auswirkungen von synaptischer Proteine ​​oder pharmakologischen Behandlung auf dendritischen Dorn Motilität. Diese Zeitraffer-Imaging-Techniken können auch geändert werden, um den Handel mit Proteinen zu untersuchen, mit oder ohne gleichzeitige Prüfung dendritischen Dorn Morphologie.

Detaillierte Analyse der dendritischen Dorn Morphologie und Motilität ist ein wesentliches Instrument für die Untersuchung der möglichen Auswirkungen des mutierten synaptischen Proteinen, und wie Mutationen in diesen Krankheits-assoziierten synaptischen Proteine ​​können Synapse Struktur und Funktion beeinflussen und damit einen Beitrag zur Pathophysiologie einer Reihe von Erkrankungen des das Gehirn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5	Warner Instruments	64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5	Warner Instruments	64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P-0899	MW 70~150 Kda
Neurobasal Media	Invitrogen	21103049
B27	Invitrogen	17504044
Glutamine	Invitrogen	21051024
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140148
D,L-APV (AP-5)	Ascent Scientific	Asc-004
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
DMEM	Invitrogen	11965092
HEPES	Mediatech, Inc.	25-060-C 1	1M, pH 7
Formaldehyde Solution	EMD Millipore	FX0415-5	36%, Histology grade
Normal Goats Serum	VWR international	100188-514	Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100	Fisher Scientific	AC21568-2500	Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed	Invitrogen	A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed*	Invitrogen	A-11034
ProLong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36934	Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber	Warner Instruments	RC-30HV
Temperature controller unit	Warner Instruments	TC-344B
MetaMorph	Universal Imaging