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Neuroscience

在培养的中枢神经系统的神经元树突棘形态分析

doi: 10.3791/2794 Published: July 13, 2011

Summary

许多最近的研究已经确定了在与大脑病症相关突触蛋白的基因突变。原代培养皮层神经元在研究这些疾病相关的蛋白质对树突棘的形态和运动的影响提供了极大的灵活性。

Abstract

树突棘是多数大脑内的兴奋连接的网站,并形成突触的突触后车厢。这些结构中的肌动蛋白丰富,并已被证明是高度动态的。在古典Hebbian可塑性以及neuromodulatory信号,树突棘可以改变形状和数量,这被认为是神经回路的细化和在大脑中的信息处理和存储的关键。树突棘之内,复杂的蛋白质网络连接允许树突棘的形态和数量的控制与肌动蛋白cyctoskeleton的细胞外信号。神经病理研究表明,从精神分裂症,自闭症谱系障碍的疾病状态,显示树突棘形态异常或数字。此外,最近的基因研究已经确定了在大量的基因编码突触的蛋白质突变,导致这些蛋白质可能会导致异常的脊柱可塑性的部分,这些疾病的病理生理基础的建议。为了研究这些蛋白质在控制树突棘形态/数量的潜在作用,培养皮层神经元的使用提供了几个优点。首先,这个系统可以在固定细胞树突棘的高清晰度成像以及时间推移活细胞成像。其次,在体外系统,这使得容易操纵蛋白质的功能表达的蛋白质,击倒的shRNA结构,或药物治疗。这些技术使研究人员开始解剖疾病相关的蛋白质的作用,并预测这些蛋白质的突变可能在体内的功能。

Protocol

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这里所描述的协议,可以用来检查任何原代培养体系的树突棘形态和动态。

1。初级皮层神经元培养的制备

  1. 准备从高密度的皮层神经元培养SD大鼠E18胚胎和胶质空调无血清培养基 1-2文化。
  2. 安乐死之一孕鼠(E18)根据ACUC程序,迅速取出子宫中的胎儿,在100毫米的Petri冰盘地方。
  3. 剖开子宫和羊膜,胎儿颈部举行(脐带完好)用一个镊子,用另一个镊子剥头皮从后到前,用锋利的钳沿中线从后到前提示和狭缝打开颅骨。
  4. 取出一个弯钳(瓢议案)和地点在100毫米培养皿含有10毫升的冰冷钙 +全脑- Mg 2 +的HBSS 。
  5. 握住一钳,与另一个钳分开半球,取出海马和纹状体,独立的皮质和仔细剥离皮层组织从脑膜脑梗。
  6. 池解剖皮质组织,直言不讳地短暂转移到管内含有4毫升15毫升预热胰蛋白酶/ EDTA(0.25%胰蛋白酶,0.53毫米EDTA; HYQ自Hyclone SH30042.01胰蛋白酶);在37℃水浴孵育~~ 15分钟,去除胰蛋白酶/ EDTA,尽可能用一次性塑料吸管,加入1.5 ml的神经介质。
  7. 游离于5毫升吸管(〜10招,避免产生气泡)轻柔吹打消化组织机械,加2毫升培养基,让定居30秒,然后转移到2 ml上清液15毫升管。
  8. 重复第6步的两倍(约〜15分的总)应采取。
  9. 2分钟,在200克旋转的细胞悬液。
  10. 取出上清液(5毫升吸管 - 没有真空吸);松开手指翻转对底部沉淀,悬浮细胞沉淀在5毫升培养基,并通过一个40微米到50毫升管细胞过滤器过滤。
  11. 混合10μL细胞悬液,台盼蓝10μL;与hematocytometer(台盼蓝拒)活菌计数。
  12. 典型的息率:5 × 10 6细胞/脑;稀释至所需的密度电镀(如1.5 × 10 6细胞/毫升)。
  13. 填写含有18毫米的圆形或22x22毫米平方盖玻片培养板,电镀媒体(Neurobasal媒体用2%B27,0.5毫米谷氨酰胺和1%青霉素的补充:stretomycin)(总体积减去电镀卷),涂层聚- D -赖氨酸( 0.2毫克/毫升,Sigma公司)溶解在0.1 M硼酸盐缓冲液(3.1克/ L,硼酸,4.8克/ L硼砂,pH值8.5,过滤灭菌);总量= 0.8毫升/ 12孔板。
  14. 在下一步中提供的密度板材神经元;细胞均匀分散,由温和的摇摆/攻牙。
  15. 对于12孔板(3.5厘米2 /孔):(高密度3 × 10 5 /孔= 857/mm 2)(中密度1.5 × 10 5 /孔= 430/mm 2),6孔板(2 /9.6厘米):(您好密度9 × 10 5 /孔= 624/mm 2)(中密度4.5 × 10 5 /孔= 312/mm 2)。
  16. 电镀后1小时,更换新鲜培养基(含2%B27,0.5毫米谷氨酰胺​​和1%青霉素Neurobasal媒体:stretomycin)的所有介质。由于细胞碎片倾向于定居在中间的井,旋流板,以方便清除杂物;要小心不要让随时干细胞。
  17. 更改半中期以后每星期两次(删除〜300-350μL,从每孔加400μL回暖食喂养中型,每口井)。
    可选:在格4,添加200μM,L -氨基酸phosphonovalerate酸(D,L - APV的,科学的Ascent)喂养中等D,文化神经元在2%B27,0.5毫米和1%的谷氨酰胺青霉素为辅的Neurobasal培养基:stretomycin 200微米APV的。
  18. 成长为24-28天,在体外(DIV),在这个时间点的树突棘皮层神经元的原代培养,显示了成熟的形态(即它们形成与突触前伙伴的连接,并有一个清醒的头脑状结构)和对应在啮齿类动物的青春期提前 3-4 。可以tranfected和治疗神经元生长在18毫米圆形盖玻片,药理学,前被固定,免疫染色,并使用激光共聚焦显微镜成像和用于详细morphometeric树突棘分析。 22x22毫米的方形盖玻片上培养的细胞,然后可以使用的时间推移成像实验研究树突棘动力学。

2。原代培养皮层神经元的转染

  1. 皮层神经元的转染前2-3天,实验用脂质体2000(Invitrogen公司)5。
  2. 准备“H - DMEM”平衡的DMEM(贝科改良Eagle培养基的pH值;没有谷氨酰胺,Invitrogen公司11965-092)与10毫米无菌HEPES(4 - (2 -羟乙基)- 1 - piperazineethanesulfonic酸; MediaTech Cellgro 25 - 060 - CI,1M,pH值7)。加热至37 ° C。
  3. 600/1000μL(18/22x22毫米盖玻片)预热(37℃)新抗生素的培养基(Neurobasal培养基,B27,0.5毫米谷氨酰胺​​),并在饱和湿度37℃培养箱中孵育细胞,补充传输盖玻片5%CO 2 30分钟。
  4. 对于每个盖玻片,添加指定的DNA的数量(一个或多个DNA质粒,如染pEGFP纲要细胞形态和突触蛋白标记突变; 1-2微克上兴建)50μLH - DMEM,让站在5分钟。
  5. 每个盖玻片,4 / 6μL(18/22x22毫米盖玻片)脂质体2000添加50μLh - DMEM培养液,静置5分钟。
  6. 步骤1.3和1.4彻底混合管,保持在饱和湿度37 ° C培养箱辅以5%的CO 2,至少20分钟。复杂的是长达6小时的稳定,根据制造商。
  7. 添加脂质体2000/DNA的混合物,从步骤1.5滴加细胞。在饱和湿度37 ° C培养箱辅以4个小时,5%CO2,培养的细胞。
  8. 使用步骤1.1(300/600μL),预热补充喂养中型(37℃)400/800μL新鲜喂养液(18/22x22毫米盖玻片)。以下步骤1.6,转移到含有和新鲜的老喂养液介质盖玻片。
  9. 允许表达质粒继续2-3天。

3。治疗原代培养皮层神经元生长在18毫米盖玻片

18毫米盖玻片,以前转生长的神经元,也可以很容易受到药物治疗。

  1. 准备学联(人工脑脊液(毫米):125氯化钠,2.5氯化钾,26.2碳酸氢钠3,1的NaH 2 PO 4,11葡萄糖,5 HEPES 氯化钙 ,2.5和1.25用200μMMgCl 2的 D,L - APV)。加热至37 ° C。预孵化盖玻片,在900μL30-60分钟的热烈学联。与抑制剂治疗前,在这段时间内可以执行。
  2. 准备从库存解决方案,以10倍的工作浓度药理代理/辆;在学联的解决方案执行稀释。小心地添加代理/车辆细胞(终体积为1000μL,终浓度的1X代理/车辆),并允许治疗所需的时间5。
  3. 治疗后(S),修复immunocytohistochemistry细胞的过程。

4。固定和immunocytohistochemistry(ICC)

  1. 修复神经元在任4%甲醛/ 4%的蔗糖PBS(800μL)在室温下20分钟,或在4%多聚甲醛/ 4%的蔗糖PBS(800μL)在室温下10分钟,由2X在PBS洗,其次是10分钟预冷(-20 ° C)的甲醇(800μL)固定在4 ° C。甲醇固定的工作原理是蛋白质变性和沉淀。此过程会导致在突触后密度(PSD)的蛋白质,以及揭露脂质丰富的地区。
  2. 盖玻片在PBS(800μL),2X,每次10分钟洗净。
  3. 通透,并同时阻止细胞PBS中含有2%正常山羊血清和0.1%TRITON - X - 100(800μL)在室温下1小时。
  4. 提出对绿色荧光蛋白,抗原表位标记的抗体(如他,MYC,V5)或内源性蛋白,以PBS含有适当浓度的2%正常山羊血清。以一个15厘米的菜,划分成正方形,数量,并用封口膜盖。加入80μL以封口膜抗体和块的混合物(每平方米下降),和抗体/块组合盖玻片细胞朝下。在4℃孵育过夜。
  5. 在PBS洗涤盖玻片,每次15分钟的3倍。
  6. 含有适当浓度的2%正常山羊血清的PBS稀释Alexa的共轭(Invitrogen)的抗体。二级抗体在室温下,在相同的方式,在步骤3.4孵育1小时,避光。
  7. 在PBS洗涤盖玻片进一步3X 15分钟。
  8. 山到标准显微镜的盖玻片幻灯片使用延长Gold抗淬灭试剂(Invitrogen)。

5。脊柱形态的定量分析

我们获得的单,双染神经元,使用蔡司LSM5帕斯卡尔共聚焦显微镜(细胞表达GFP和建造或内源性蛋白的利益)的共聚焦图像。对于所有的成像实验成像,并在随后的分析,选择健康的锥体神经元。健康的神经元细胞没有显示出泡或遇险,由于治疗或固定的迹象,并包含一个完整的,不间断的树突状乔木。

  1. 获取图像的神经元,用一个63X的油浸物镜(蔡司)与NA(NUMerical光圈1.4),作为Z系列3-8图像,平均4倍,0.37微米的间隔,1024 × 1024像素的分辨率在每节2.5秒的扫描速度。直接比较的文化,需要用相同的采集参数成像。 10-20神经元/的条件下,从3-5个独立的实验,和2 100μm的每个神经元的树突每个应分析。实验应该做的盲人和文化上的妹妹。调整探测器的增益和失调,包括周围的枝蔓,在脊柱的荧光信号和背景之间的过渡是尖锐的,允许精确量化的光环,甚至依稀荧光薄刺。保持的采集参数,在相同的实验中所有扫描相同。
  2. GFP的图像可以使用氩激光线,在488 nm的令人兴奋的收购,并收集在505-530 nm的带通滤波器。高表达的蛋白质或内源性蛋白的免疫染色与一个Alexa 568二级抗体(Invitrogen)的,可以使用一个令人兴奋的在543 nm的氦氖激光的收集,并收集在560 nm长通滤波器的图像。激光功率保持到最低限度,以避免样品漂白。
  3. 使用MetaMorph软件(分子器件,公司),二维,背景消减,最大的Z系列图像投影重建形态分析和定量使用。要检查的树突棘形态,塌陷Z系列的图像,校准所需的距离,然后阈值的方式,包括所有的刺,完全对应刺的轮廓(图2E,F)的门槛。只有二​​级和三级的树突(总长度100μm的每个神经元)刺来衡量,以减少可变性,和段的测量需要分支点之间。手动大纲每个脊柱,使其成为一个封闭的周长(图2G)。
  4. 测量脊柱以下的参数,自动在MetaMorph:脊柱的长度,脊柱广度,截面积,和树突棘的线性密度。定量导出到Excel的树突棘的形态学参数。使用学生的配对t检验,以确定两组之间的差异有统计学意义;单向ANOVA可以被用来比较三个或以上的团体,由杜克- B后多重比较特别。可以在Excel中,GraphPad或SPSS统计分析。分析累计使用Kolmogorov - Smirnov检验(KS检验)2,5-6地块。

6。定量免疫荧光(IF)

使用针对特定突触蛋白的免疫荧光抗体定量,可视化使用一个Alexa 568二级抗体(Invitrogen)的,可用于研究在集群和突触突触内源性蛋白定位的变化。

  1. 如上所述,使用共聚焦显微镜采集图像。使用氩气和一个氦氖激光图像双染神经元(见上文)。只有形象健康的锥体神经元,不显示任何遇险的迹象。
  2. 对于荧光强度测量,减去相应的背景树突状轴(图2i,黄色方形),生成“背景减去”形象(图2J)使用MetaMorph。同样的阈值图像,包括强度至少有两个以上相邻的枝晶(图2K)倍集群。沿着树突使用MetaMorph使用的“周边”实用程序(图2D)和自动测量的线性密度(number/100微米枝蔓长度),和整合力度,每个突触集群(总IF强度)每个神经元(100微米)的大纲地区7-9。
  3. 要衡量一个突触蛋白的相对脊柱内容,首先要确定蛋白GFP的图像阈值,以确定脊柱形态(图2E,F)的使用MetaMorph集群。传送感兴趣的区域,只有包括蛋白质在其他渠道(图2G,H)的捕获利息的图像刺。计数蛋白集群数量和衡量免疫内刺的整合力度,以评估脊柱蛋白质含量。
  4. 如果到Excel中突触蛋白定量的导出参数。使用学生的配对t检验,以确定两组之间的差异有统计学意义;单向ANOVA可以被用来比较三个或以上的团体,由杜克- B后多重比较特别。可以在Excel中,GraphPad或SPSS统计分析。

7。时移成像

要研究树突棘的存在或缺乏疾病相关的突触蛋白质,在脊柱运动的或个别刺在脊椎形态的变化,如动态,增长24-28格22x22毫米平方米盖玻片的原代培养皮层神经元。 Neur项可双转染GFP / mCherry定义细胞形态和荧光标记的突变突触蛋白如上所述。对于所有的成像实验,选择健康的锥体神经元表达两个构造,这些细胞可以接受药物治疗,成像和用于后续分析。

  1. 预孵育的神经元,增长1.5毫升学联22x22毫米盖玻片在饱和湿度37℃培养箱中培养30-60分钟补充5%的CO 2 。细胞也可以预先在这个阶段的药物,以及治疗。以下pre-incubation/treatment,细胞转移到一个封闭的成像阶段室(华纳,RC - 30HV)。保持温度37℃,控制器单元(时代华纳,TC - 344B)2,5-6,10。
  2. 要检查脊椎的蠕动,预先处理的细胞与药物或车辆长达30-60分钟,然后转移细胞成像室。这使得药物/车辆有足够的时间来启动神经元内的第二信使途径。获得通过63X 2X平均在10分钟的时间间隔(Ziess,NA 1.4)的目标图像。选择与整体锥体形态,表达GFP / mCherry或荧光标记的蛋白质健康的神经元。为了尽量减少光损伤,降低激光功率的0.5-1%。车辆治疗与药物治疗的细胞进行比较,将展示在脊柱运动的变化。另外,脊柱运动可以评估治疗前后,灌注药物/车辆(见下文)。收集各时间点的Z -堆叠。
  3. 要跟踪树突棘形态的变化,随着时间的推移,持续1小时的影像盖玻片建立基线的变化形态。此时,灌注成像室的药物/车辆使用进一步小时蠕动泵(吉尔森,Minipuls 3),和图像的神经元。收购焦ž堆栈使用一个63X的石油目标(Ziess NA 1.4)2倍平均每10分钟,。激光功率降低到0.5-1%,以尽量减少光损伤。
  4. 每个成像会议结束,获得了整个神经元的20X图像的光损伤程度确定。从量化应该省略任何神经元的参展遇险的迹象。每个时间点的Z -堆栈应该被折叠成Metamorph 2D预测。根据转染的图像质量和水平,中位数通滤波器或背景减法可以应用在Metamorph产生清晰的图像进行分析。
  5. 要评估脊柱变形和运动,在100分钟的影像会议的开始,中间和结束拍摄的图像,颜色编码和覆盖在MetaMorph。每个单元至少有100微米的枝蔓需要加以分析。全脊柱的蠕动分数的定义为总数的动力事件,即扩展,回缩,头部变形或前伸运动的规范化脊柱 6,11 。这种方法措施的事件的发生频率,不考虑他们的程度,它集合所有类型的事件,是一个整体运动的一般估计。一个前伸的事件被定义为一个新的外观,从脊柱头或树突状轴的瞬时突。一个回缩的事件被定义为脊椎头或树突状轴位于一个现有的或短暂的突失踪。突和扩展事件的总和除以总数刺的枝蔓地区是量化。
  6. 要评估药物治疗,在个别的脊柱形态的变化,测量的树突棘的截面积,或树突棘密度在时间点-1小时(1小时前灌注)的线性,紧接治疗,在每个时间点以下治疗。规范化每次点到1小时前到治疗的时间点。要确定树突棘形态或线密度的变化,不因光损伤,分析与车辆灌注神经元。可以由学生的配对t检验或单样本t检验手段的差异。

8。替代的方法和成功的关键

  1. 我们已经描述了培养皮层神经元中存在的D,L - APV,NMDA受体抑制剂,DIV直至到期日(DIV24 - 28)4。应该指出,同时培养皮层神经元中存在的D,L - APV有利于保持良好的卫生皮层神经元的文化长期存在的D,L - APV的可能影响突触发育。由于这种另类文化的神经元在D,L - APV的2,5的情况下。当培养的神经元在D的情况下,应支付L - APV的格外重视文化的整体健康,因为是由于过量钙的细胞死亡的增加机会通过过度活跃的NMDA受体激活+细胞毒性。
  2. 在本议定书中所描述的神经元文化,可以用来检查机制,是调节树突棘形态和活力的dendriti的相关彗星棘显示一个成熟的形态(即它们的形式与突触前伙伴的连接,并有一个清晰的头状结构)2,4,5。另外,文化在一个较早的时间点使用,例如DIV11 - 16,可能更适合于解决问题,树突棘的形成,或在早期发育过程中的树突棘的调控有关。
  3. 共聚焦显微镜的使用替代品,是使用宽视场落射荧光,获得治疗的培养皮层神经元的图像。详细棘的形态学分析结合适当的反卷积算法,可以在固定或活细胞。此外,它还可以使用其他软件,如ImageJ(, http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html )或Neuronstudio( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns 。HTML ),这是自由软件,树突棘形态的分析。
  4. 当研究树突棘蠕动/变形使用时间推移成像,应该指出的是,使用更短的间隔时间推移,如5-10分钟,可提供一个更详细的分析,树突棘turnover2,5。使用更短的时间间隔也可能找出更快速的脊柱变形使用较长的时间间隔,将不会被检测的形式。
  5. 培养皮层神经元的使用有许多的缺点和问题需要考虑。首先,使用培养的皮层神经元的关注,有可能是不同文化之间的变异可能影响树突棘密度等参数。因此,它是必不可少的,以下几点是认真坚持,以确保最少量的变异。首先,培养参数和试剂应保持尽可能一致,除了良好的养殖实践,这将大大降低文化之间的可变性水平。其次,它是必不可少的,在同一时间点进行,所有的实验,和妹妹文化。此外,在实验进行的时间点应慎重选择,让实验者问适当的问题(见上述第2点)。最后,它是至关重要的,适当控制是在所有实验中使用的治疗条件,使总是相对于这些内部控制研究。这将删除任何变异文化之间的关注。
  6. 培养皮层神经元的使用是一个强大的工具使研究人员能够认真审视必不可少的树突棘的形态和运动的调节机制。但是,它是重要的,以注意,这些文化做不复述在体内的情况一个组件,如皮质层组织和其他细胞类型,如神经胶质细胞突触的形成,,效果可以不被在上面描述的系统处理。然而,这样一个系统可以被用来确定潜在的关键底层树突棘的形态和运动的调节机制。

9。代表性的成果

上文所述的检测,旨在探讨在药物治疗和/或蛋白质在体外的功能基因操作的树突棘的形态,数量和活力的变化。在我们的实验室,我们利用这些技术的特点突触蛋白,调节树突棘肌动蛋白细胞骨架的作用,从而改变其结构 2,9 。此外,我们已经使用了这个实验,以确定如何neuroactive化合物,如神经调质,可驱动树突棘的形态,数量或形状的变化单独4,6,10,或在活动依赖刺激5存在。

要估计1D或2D参数测量的准确度,我们测得的已知尺寸的荧光乳胶微球(公爵科学)(0.2,0.52,1.0微米)的直径和安装在整个研究过程中的神经元在同等条件的地区。我们使用相同的成像条件为脊柱测量(63X NA = 1.4油浸目标,LSM 5帕斯卡)成像的微球,然后确定它们的直径和地区在Metamorph同样与我们的脊柱测量,。然后,我们比较了微球的已知尺寸的实际测量。

在图1(图1)图中可以看出,我们可以准确地测量0.52和1.0微米的微球(= 0.21微米和0.78 微米 2分别)(测量的标准偏差〜15%;制造商确定的标准差〜 9%)。即使为0.2微米的微球,我们的测量,比较接近实际尺寸(但是大的SD)。这是与计算的横向resol是一致的 ution我们共聚焦显微镜使用这个特定的目标,Δxcf0.3微米(使用公式=(0.61/v2)√/ NA)12。这是明显高于轴向分辨率,这是众所周知的共聚焦和双光子显微镜的贫穷更好。此外,我们试验确定横向(X / Y轴)点传播绿色荧光微球的直径为200纳米(公爵科学)是〜0.5微米,通过测量函数(PSF)。这估计是针孔开放,因此可以假设针孔关闭时,PSF的实际较小。不过,这再次表明,我们能够准确地测量面积大于0.196微米(直径为0.5微米)。实际横向涤纶短纤的一个迹象是在( 斯沃博达)13“并不比0.4微米,这将导致在面积的0.16 微米 2” 。这些比较和理论表明,我们可以准确地测量物体的大小类似刺的地方,因为我们测得的刺的尺寸大于本决议的限制(> 0.25 微米 2) 。对于这样的条件下,“经典形态的技术 定量 ”13,这说明,我们可以可靠地测量脊柱地区,并准确地比较不同的治疗条件的脊椎形态。

为了准确地测量树突棘的形态,我们已经转DIV的23皮层神经元,2天的EGFP的构建。以下转染,细胞可以治疗,是固定的,为国际刑事法院处理,其中GFP信号增强,使得整个枝蔓(或神经元)的均匀分布。图2显示了与绿色荧光蛋白转的皮层神经元的形象代表,一个63X的目标(NA 1.4)(图2A)使用共聚焦显微镜成像。这使得树突棘(图2B)详细的高分辨率图像。在我们的实验室使用的Metamorph程序进行详细的树突棘的形态分析。这个程序允许我们不仅要衡量树突棘形态,而且要考察的内源性蛋白的本地化。概述我们如何进行这种分析是在图2(图2C - G)的提供。

一个很好的特点的活动依赖于刺激的效果是增加树突棘的大小 2 。图3显示了具有代表性的一个DIV 24皮层神经元表达EGFP的树突棘,30分钟之前和之后的活动依赖刺激,成像的时间推移成像。这时间推移实验证实,活性依赖的刺激增加树突棘的大小(图3A,B)。要检查脊柱运动的基础,获得的图像在时间点0,50和100分钟,和脊椎扩展,撤消,前伸运动和头部变形测量分别为总动力相结合。图3C - D证实,即使在基础条件下,皮层神经元的树突棘显示一定程度的蠕动。

图1
图1。荧光微球。误差棒的测量值和实际的领域比较测量领域的标准偏差。 0.2微米的微球的图片,0.52微米,1微米。比例尺= 5微米。

图2
图2。脊柱形态的定量和IFA.图像息25 EGFP的表达培养皮层神经元的发现典型的皮层神经元的树突棘形态B.高放大倍率。C. EGFP和内源性蛋白(GluR1)覆盖。D.折叠EGFP转染锥体的Z -系列细胞树突;轴和刺之间的分工是追查手动 E.分明,superthreshold地区,然后概述Metamorph和量化楼手跟踪 G.用于确定脊柱的长度,宽度和横截面积的神经元地区确定。。 Metamorph,对应刺。H.脊柱轮廓将被转移到红色通道图像(内源性蛋白)量化脊柱特定的信号。“IK。为了量化受体或突触蛋白集群,Z系列的投影图像。减去 ,树突状轴背景IF(黄色平方米),生成“背景消减”的形象。J.该图像,然后阈值和程序自动措施集聚区,线密度,总灰度值(中频强度 K H.标尺,A = 15微米的阈值图像,B = 1微米。

G“ALT =”图3“/>
图3。活动依赖的脊柱形态的变化,和树突棘的基础动力。 A.定时成像一个有代表性的树突棘之前和之后的活动依赖的刺激。活性依赖的刺激诱 ​​导开关从ASCF含有离子和APV实验媒体学联无镁离子和APV,但包含10微米甘氨酸 B.量化的树突棘面积(大小),归到-30分钟的时间点(30前灌注分钟)。C.树突棘活力为0,50和100分钟的时间点代表的图像。排在前列的图像显示叠加0(红色),50(绿色)和100(蓝色)分钟的时间点,而下面的图片分别是每一个时间点。星号表示脊椎的延伸,白色的箭头表示脊椎回缩,绿色箭头表示前伸蠕动;开放的黄色箭头表示棘头变形E. D.树突棘运动参数的定量和总蠕动20X皮层神经元的形象表达EGFP以下成像。会议以确定细胞的健康。

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Discussion

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上面描述的详细定量分析树突棘形态,固定或现场初级皮层神经元的线性密度和蠕动的技术重点了解突触后的机制,可能有助于到neuropathologies影响。类似的方法可以用来量化脊柱形态或运动的任何刺的神经元,包括海马锥体,浦肯野,或中等刺神经元。

这里所描述的协议,可以适应看看突触蛋白和/或药物治疗树突棘的影响的基本性质。此外,它还可以被用来评估不等骨架蛋白,谷氨酸受体的内源性突触蛋白的本地化的变化。此外,它允许固定棘的形态学分析,不仅详细,而且还测量突触树突棘活力的蛋白质或药物治疗的效果。这些时间推移成像技术还可以被修改,以研究蛋白质贩运,或不同时研究树突棘形态。

树突棘的形态和运动的详细分析调查突变突触蛋白的潜在影响的一个必不可少的工具,如何在这些疾病相关的突触蛋白的突变可能会影响突触的结构和功能,从而导致的疾病的病理生理大脑。

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Disclosures

这项工作是支持生产MetaMorph(分子器件,公司)。

Acknowledgments

我们感谢细心的编辑凯利 - 琼斯。这项工作是支持由美国国立卫生研究院授予R01MH 071316阿尔茨海默氏症协会,全国的精神分裂症和抑郁症(NARSAD)研究联盟和全国自闭症研究联盟(NAAR)(星期三),美国心脏协会博士后奖学金(DPS);美国心脏协会Predoctoral奖学金(KMW)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

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References

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在培养的中枢神经系统的神经元树突棘形态分析
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Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

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