Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen

doi: 10.3791/2794 Published: July 13, 2011

Summary

Tal van recente studies hebben aangegeven mutaties in synaptische eiwitten in verband met de hersenen pathologieën. Primaire gekweekte corticale neuronen bieden een grote flexibiliteit in het onderzoeken van de effecten van deze ziekte-geassocieerde eiwitten op dendritische rug morfologie en beweeglijkheid.

Abstract

Dendritische stekels zijn de websites van de meerderheid van prikkelende verbindingen in de hersenen, en vormen de post-synaptische compartiment van synapsen. Deze structuren zijn rijk aan actine en is aangetoond dat zeer dynamisch. In reactie op de klassieke Hebbian plasticiteit evenals neuromodulatory signalen, kan dendritische spines van vorm veranderen en het aantal, waarvan wordt gedacht kritisch te zijn voor de verfijning van neurale circuits en de verwerking en opslag van informatie in de hersenen. Binnen de dendritische spines, een complex netwerk van eiwitten koppelen extracellulaire signalen met het actine cyctoskeleton waardoor de controle van dendritische wervelkolom morfologie en nummer. Neuropathologische studies hebben aangetoond dat een aantal van de ziekte staten, variërend van schizofrenie tot autisme spectrum stoornissen, abnormale dendritische ruggegraat morfologie of cijfers weer te geven. Bovendien hebben recente genetische studies geïdentificeerd mutaties in tal van genen die eiwitten coderen synaptische, wat leidt tot suggesties dat deze eiwitten kunnen bijdragen aan afwijkende wervelkolom plasticiteit die voor een deel ten grondslag liggen aan de pathofysiologie van deze aandoeningen. Met het oog op onderzoek naar de mogelijke rol van deze eiwitten in het controleren van dendritische wervelkolom morfologie / nummer, het gebruik van gekweekte corticale neuronen biedt verschillende voordelen. Ten eerste is dit systeem zorgt voor hoge-resolutie beeldvorming van dendritische spines in vaste cellen als time-lapse imaging van levende cellen. Ten tweede, dit in vitro systeem maakt een eenvoudige manipulatie van proteïne functie door de expressie van mutant eiwitten, knockdown door shRNA constructen, of farmacologische behandelingen. Deze technieken kunnen de onderzoekers om te beginnen met de rol van de ziekte-geassocieerde eiwitten ontleden en te voorspellen hoe de mutaties van deze eiwitten kunnen functioneren in vivo.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het protocol hier beschreven kan worden gebruikt om dendritische wervelkolom morfologie en dynamiek in een primaire gekweekte systeem te onderzoeken.

1. De voorbereiding van de primaire corticale neuron culturen

  1. Bereid high-density corticale neuron culturen uit Sprague-Dawley rat E18 embryo's en cultuur in gliacellen-geconditioneerde serum-vrij medium 1-2.
  2. Euthanaseren een zwangere rat (E18) volgens ACUC procedures; snel te verwijderen baarmoeder (met foetussen erin) en plaats in een 100 mm Petrischaal op ijs.
  3. Opengesneden baarmoeder en amnionmembraan, houdt foetus door de nek (navelstreng intact) met een tang, een andere tang te schillen hoofdhuid gebruiken van achter naar voren, en de schedel te openen met een scherpe tang tip over de middellijn van achteren naar voren split.
  4. Verwijder de hele hersenen met een gebogen pincet (in een scoop beweging) en plaats in een 100 mm petrischaal met 10 ml ijskoude Ca2 + - en Mg 2 +-vrij HBSS.
  5. Houd de hersenstam met een tang, aparte hemisferen met een andere tang, verwijder hippocampus en striatum, aparte cortex en zorgvuldig verwijderen van de corticale weefsel af van hersenvliezen.
  6. Pool ontleed corticale weefsels, kort gehakt en over te dragen aan een 15 ml buis met 4 ml voorverwarmde trypsine / EDTA (0,25% trypsine, 0,53 mM EDTA; HyQ Trypsine uit Hyclone SH30042.01) incuberen in 37 ° C waterbad voor ~ 15 min, verwijder trypsine / EDTA zoveel als mogelijk met een wegwerp plastic pipet, voeg 1,5 ml neuronale medium.
  7. Mechanisch distantiëren van de verteerde weefsels door zachte pipetteren met een 5 ml pipet (~ 10 slagen, voorkomen dat er luchtbellen), voeg 2 ml medium, laten bezinken voor 30 sec, dan overdracht 2 ml supernatant in een 15 ml buis.
  8. Herhaal stap 6 keer (duurt ongeveer ~ 15 min in totaal).
  9. Spin celsuspensie bij 200 g gedurende 2 minuten.
  10. Verwijder supernatant (met een 5 ml pipet - niet vacuüm aspireren), los de pellet door flippen vingers tegen de onderkant; hersuspenderen celpellet in 5 ml medium en filtreer door een 40 um cel zeef in een 50 ml buis.
  11. Mix 10 pi celsuspensie en 10 ul trypan blauw; Count levensvatbare cellen (trypan blauw uitsluiting) met een hematocytometer.
  12. Typische opbrengst: 5 x 10 6 cellen / hersenen; verdunnen om de gewenste dichtheid (bijvoorbeeld 1,5 x 10 6 cellen / ml) voor plating.
  13. Vul kweekplaten met plating media (Neurobasal media aangevuld met 2% B27, 0,5 mM glutamine en 1% penicilline: stretomycin) (totaal volume minus plating volume) met 18 mm rond of 22x22 mm vierkant dekglaasjes, bekleed met poly-D-lysine ( 0,2 mg / ml, Sigma) opgelost in 0,1 M boraatbuffer (3,1 g / L Boorzuur, 4,8 g / L borax, pH 8,5, filter gesteriliseerd), totaal volume voor 12-well plaat = 0,8 ml / putje.
  14. Plaat neuronen in de dichtheid die in de volgende stap; gelijkmatig verspreiden cellen door zachte wiegen / tikken.
  15. Voor de 12-well platen (3,5 cm 2 / putje): (hi-density 3 x 10 5 / goed = 857/mm 2) (mid-dichtheid 1,5 x 10 5 / goed = 430/mm 2), 6-well platen (9,6 cm 2 / putje): (hi-density 9 x 10 5 / goed = 624/mm 2) (mid-dichtheid 4,5 x 10 5 / goed = 312/mm 2).
  16. Een uur na plating, de plaats van alle medium met vers medium (Neurobasal media aangevuld met 2% B27, 0,5 mM glutamine en 1% penicilline: stretomycin). Omdat celresten hebben de neiging om zich te vestigen in het midden van de put, krul de platen eerst verwijderen van puin te vergemakkelijken; Zorg dat er geen cellen drogen te allen tijde worden.
  17. Verandering ½ medium Twee keer per week daarna (~ 300-350 ui te verwijderen uit elk putje, en voeg 400 ul voorverwarmde verse voeding medium aan elk putje).
    Optioneel: DIV 4 toe te voegen 200 uM D, L-amino-acid phosphonovalerate (D, L-APV, Ascent Scientific) het voeden van medium, cultuur neuronen in Neurobasal medium aangevuld met 2% B27, 0,5 mM glutamine en 1% penicilline: stretomycin + 200 uM APV.
  18. Grow primaire culturen van corticale neuronen voor 24-28 dagen in vitro (DIV), zoals in deze tijd-point dendritische spines weer een volwassen morfologie (dat wil zeggen vormen ze verbindingen met pre-synaptische partners, en hebben een helder hoofd-achtige structuur) en de komen overeen met de vroege adolescentie bij knaagdieren 3-4. Neuronen gekweekt op 18 mm ronde dekglaasjes kunnen worden tranfected en behandeld farmacologisch, voordat hij vast, immunostained en beeld gebracht met behulp van een confocale microscoop en wordt gebruikt voor gedetailleerde morphometeric analyse van de dendritische spines. Cellen gekweekt op 22x22 mm vierkant dekglaasjes kan vervolgens worden gebruikt in de time-lapse imaging experimenten om dendritische wervelkolom dynamiek te onderzoeken.

2. Transfectie van primaire gekweekte corticale neuronen

  1. Corticale neuronen worden getransfecteerd 2-3 dagen voor experimenten met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5.
  2. Bereid "h-DMEM" door het balanceren van de pH van DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, geen glutamine,Invitrogen 11965-092) met 10 mM steriele HEPES (4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur; Mediatech Cellgro 25 tot 060-CI, 1M, pH 7). Warm tot 37 ° C.
  3. Overdracht coverslips naar 600/1000 ui (18/22x22 mm dekglaasjes) voorverwarmde (37 ° C) nieuw antibioticum-vrij medium (Neurobasal medium, B27, 0,5 mM glutamine), en incubeer cellen in een vochtige 37 ° C incubator, aangevuld met 5% CO 2 gedurende 30 minuten.
  4. Voor elke dekglaasje, voeg aangewezen hoeveelheid DNA (een of meerdere DNA plasmiden, bijvoorbeeld pEGFP naar cel morfologie en tagged-mutant synaptic eiwit schetsen; 1-2 microgram afhankelijk van de te bouwen) om 50 ul van de h-DMEM, laat staan ​​5 minuten.
  5. Voor elke dekglaasje, voeg 4 / 6 pl (18/22x22 mm dekglaasjes) Lipofectamine 2000 tot 50 h-ul DMEM, laat staan ​​voor 5 minuten.
  6. Meng grondig buizen van de stappen 1.3 en 1.4, gedurende ten minste 20 minuten in een vochtige 37 ° C incubator, aangevuld met 5% CO 2. Complex is stabiel tot 6 uur volgens de fabrikant.
  7. Voeg Lipofectamine 2000/DNA mengsel van stap 1.5 druppelsgewijs aan cellen. Incubeer cellen in een vochtige 37 ° C incubator, aangevuld met 5% CO2, voor 4 uur.
  8. Met behulp van het voeden medium van stap 1.1 (300 / 600 pl), aan te vullen met voorverwarmd (37 ° C) 400 / 800 ul verse voeding medium (18/22x22 mm dekglaasjes). Volgende stap 1.6, transfer dekglaasjes in medium met oude en verse voeding medium.
  9. Laat uiting van plasmiden om verder te gaan voor 2-3 dagen.

3. Behandeling van primaire gekweekte corticale neuronen gekweekt op 18-mm coverslips

Neuronen gekweekt op 18 mm dekglaasjes, voorheen getransfecteerd, kan ook eenvoudig worden onderworpen aan farmacologische behandelingen.

  1. Bereid ACSF (kunstmatige hersenvocht, in mm: 125 NaCl, KCl 2,5, 26,2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glucose, 5 HEPES, 2,5 CaCl 2 en 1,25 MgCl 2 met 200 uM D, L-APV). Warm tot 37 ° C. Pre-incubeer dekglaasjes in 900 ul warm ACSF gedurende 30-60 minuten. Voorbehandeling met remmers kan uitgevoerd worden tijdens deze periode.
  2. Bereid farmacologische middelen / voertuig uit voorraad oplossingen voor een 10x werkende concentratie; voeren verdunningen van oplossingen in ACSF. Voeg voorzichtig agent / voertuig aan cellen (eindvolume van 1000 pi, tot een uiteindelijke concentratie van 1X agent / auto), en laat de behandeling om door te gaan voor de gewenste tijd 5.
  3. Na de behandeling (en), fix cellen en proces voor immunocytohistochemistry.

4. Fixatie en immunocytohistochemistry (ICC)

  1. Fix neuronen in een van beide 4% formaldehyde / 4% sucrose PBS (800 ul) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, of in 4% formaldehyde / 4% sucrose PBS (800 ul) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door 2x wassen in PBS , gevolgd door 10 minuten fix met pre-gekoelde (-20 ° C) methanol (800 pl) bij 4 ° C. Methanol fixatie werkt door het denatureren en het neerslaan van eiwitten. Deze procedure leidt tot een ontmaskering van de eiwitten in de post-synaptische vermogensdichtheid (PSD), alsmede in lipide-rijke gebieden.
  2. Was dekglaasjes in PBS (800 pl), 2x, voor 10 minuten elk.
  3. Permeabilize en tegelijkertijd blok cellen in PBS met 2% normaal geit serum en 0,1% Triton-X-100 (800 ul) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Voeg primaire antilichamen opgewekt tegen GFP, epitoop-tag (bv. Zijn, myc, V5) of endogene eiwitten, aan PBS met 2% normaal geit serum op de juiste concentratie. Neem een ​​15 cm schotel, het op te delen in vierkanten, nummer ze, en bedek met parafilm. Voeg ongeveer 80 ul van antilichamen en blok mengsel aan parafilm (een druppel per vierkant), en plaats dekglaasje op antilichaam / blok mix met cellen naar beneden. 'S nachts geïncubeerd bij 4 oC.
  5. Was dekglaasjes in PBS, 3x 15 minuten elk.
  6. Verdunnen Alexa-geconjugeerde secundaire antilichamen (Invitrogen) in PBS met 2% normaal geit serum op de juiste concentratie. Incubeer de secundaire antilichamen op dezelfde wijze als in stap 3.4, bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, beschermd tegen licht.
  7. Was coverslips nog 3x 15 minuten in PBS.
  8. Mount coverslips op standaard objectglaasjes met behulp van ProLong Gold antifade reagens (Invitrogen).

5. Kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologieën

We krijgen confocale beelden van enkel-en dubbel-gekleurde neuronen (cellen die GFP en bouwen of endogene eiwit van belang) met behulp van een Zeiss LSM5 Pascal confocale microscoop. Voor alle grafische experimenten kiezen voor een gezonde piramidale neuronen te worden afgebeeld en gebruikt in de latere analyse. Gezonde neuronen zijn cellen die niet weergegeven enig teken van blebbing of nood als gevolg van behandeling of fixatie en dat een volledige, ononderbroken dendritische prieel bevatten.

  1. Acquire beelden van neuronen met behulp van een 63x olie-immersie objectief (Zeiss) met een NA (numerical diafragma) van 1.4, als een Z-serie van 3-8 beelden, gemiddeld 4 keer, met 0,37 micrometer intervallen, 1024x1024 pixel resolutie op een scansnelheid van 2,5 seconden per sectie. Culturen die direct worden vergeleken moeten worden afgebeeld met dezelfde acquisitie parameters. 10-20 neuronen / conditie, die elk drie tot vijf verschillende experimenten, en 2 dendrieten van 100 micrometer per neuron moeten worden geanalyseerd. Experimenten gedaan moet worden blind en op zus culturen. Pas de detector te krijgen en te compenseren om zelfs zwak fluorescerende dunne stekels zijn zonder dat er een halo rond de dendriet, zodanig dat de overgang tussen de tl-signaal in de wervelkolom en de achtergrond scherp is, het mogelijk maakt exacte kwantificering. Houd de acquisitie parameters gelijk zijn voor alle scans binnen hetzelfde experiment.
  2. GFP beelden kunnen worden verkregen met behulp van een argon laser lijn, opwindend bij 488 nm en het verzamelen met een band-pass filter op 505 tot 530 nm. Beelden van overexpressie gebracht eiwitten of endogene eiwitten immunostained met een Alexa 568 secundair antilichaam (Invitrogen) kunnen worden verzameld met behulp van een laser HeNe spannend 543 nm, en verzamelen met behulp van een lange-pass filter bij 560 nm. Houden laser bevoegdheden tot een minimum om te voorkomen dat fotobleken van monsters.
  3. Met behulp van Metamorph software (Molecular Devices, Inc), twee-dimensionale, achtergrond-gecorrigeerde, maximale projectie reconstructies van Z-serie beelden worden gebruikt voor morfometrische analyse en kwantificering. Om de morfologie van de dendritische spines te onderzoeken, instorten Z-serie opnamen, kalibreren van de gewenste afstand, en daarna drempel om alle stekels ook op een manier die de drempel exact overeenkomt met de omtrek van de stekels (fig. 2E, F). Alleen stekels op secundaire en tertiaire dendrieten (totale lengte van 100 micrometer per neuron) moet worden gemeten variabiliteit te verminderen, en metingen van segmenten moeten worden gemaakt tussen de branche punten. Handmatig schets elke rug, zodat het een gesloten omtrek (Fig. 2G) te worden.
  4. Automatisch maatregel de volgende wervelkolom parameters in Metamorph: ruglengte, wervelkolom breedte, doorsnede, en dendritische wervelkolom lineaire dichtheid. Exporteer de dendritische wervelkolom morfometrische parameters in Excel voor de kwantificering. Gebruik Student's ongepaarde t-toetsen om de statistische significantie van de verschillen tussen twee groepen te bepalen; one-way ANOVA kan worden gebruikt om drie of meer groepen te vergelijken, gevolgd door een Tukey-b post hoc voor meerdere vergelijkingen. Statistische analyse kan worden uitgevoerd in Excel, GraphPad of SPSS. Analyseer cumulatieve plots met behulp van Kolmogorov-Smirnov test (KS test) 2,5-6.

6. Kwantitatieve immunofluorescentie (IF)

Kwantificering van immunofluorescentie met behulp van antilichamen tegen specifieke synaptische proteïnen, gevisualiseerd met behulp van een Alexa 568 secundair antilichaam (Invitrogen), kan worden gebruikt om veranderingen in de clustering en synaptische lokalisatie van endogene synaptische proteïnen te onderzoeken.

  1. Acquire beelden met behulp van een confocale microscoop zoals hierboven beschreven. Gebruik een argon en een HeNe laser (zie hierboven) om de afbeelding dubbel glas neuronen. Alleen image gezonde piramidale neuronen die niet tonen geen tekenen van nood.
  2. Voor de fluorescentie-intensiteit metingen, trekt u de achtergrond die overeenkomt met de dendritische as (fig. 2I, geel vierkant) om een ​​"background-afgetrokken" beeld (Fig. 2J) met behulp van Metamorph te genereren. Even drempel afbeeldingen naar clusters met een intensiteit van ten minste twee maal boven de aangrenzende dendriet (Fig. 2K) op te nemen. Schets de regio's langs de dendrieten (100 micrometer per neuron) met behulp van de "perimeters" utility (fig. 2D) en automatisch te meten van de lineaire dichtheid (number/100 um dendriet lengte), en de geïntegreerde intensiteit (totaal IF intensiteit) van elke synaptische cluster met behulp van Metamorph 7-9.
  3. Voor het meten van relatieve rug inhoud van de synaptische eiwit, eerst bepalen eiwit clustering door drempeling de GFP afbeelding om de wervelkolom morfologie (fig. 2E, F) met behulp van Metamorph te bepalen. Breng de regio's van belang dat alleen maar onder andere stekels om beelden van het eiwit van belang gevangen in het andere kanaal (fig. 2G, H). Tel het aantal eiwitten clusters en meet de immunofluorescentie geïntegreerde intensiteit binnen stekels aan de wervelkolom eiwitgehalte te beoordelen.
  4. Exporteer de IF parameters van synaptische eiwitten in Excel voor de kwantificering. Gebruik Student's ongepaarde t-toetsen om de statistische significantie van de verschillen tussen twee groepen te bepalen; one-way ANOVA kan worden gebruikt om drie of meer groepen te vergelijken, gevolgd door een Tukey-b post hoc voor meerdere vergelijkingen. Statistische analyse kan worden uitgevoerd in Excel, GraphPad of SPSS.

7. Time-lapse imaging

Om dendritische wervelkolom dynamiek, zoals veranderingen in de wervelkolom motiliteit of in de wervelkolom morfologie van individuele stekels, in de aanwezigheid of afwezigheid van ziekte-geassocieerde synaptische proteïnen te onderzoeken, te groeien primaire corticale neuronen gekweekt op 22x22 mm vierkant dekglaasjes voor 24-28 DIV. Neurons kan worden dubbel-getransfecteerd met GFP / mCherry naar cel morfologie te definiëren en fluorescent gelabelde mutant synaptische proteïnen zoals hierboven beschreven. Voor alle grafische experimenten, kiezen voor een gezonde piramidale neuronen die beide constructen, deze cellen kunnen worden blootgesteld aan farmacologische behandeling, afgebeeld en gebruikt in de daaropvolgende analyses.

  1. Pre-incubeer neuronen gekweekt op 22x22 mm dekglaasjes in 1,5 ml ACSF gedurende 30-60 minuten in een vochtige 37 ° C incubator, aangevuld met 5% CO 2. Cellen kunnen ook vooraf worden behandeld met medicijnen op dit moment ook. Na pre-incubation/treatment, transfer cellen tot een gesloten imaging stadium kamer (Warner, RC-30HV). Handhaaf een temperatuur van 37 ° C met een controller unit (Warner, TC-344B) 2,5-6,10.
  2. Om rug motiliteit, behandel cellen met drugs-of voertuig met een maximumcapaciteit 30-60 minuten voor de overdracht van de cellen naar de beeldvorming kamer te onderzoeken. Dit geeft de voldoende tijd voor het medicijn / voertuig naar de tweede messenger pathways te starten binnen het neuron. Acquire beelden door middel van een 63x objectief (Ziess, NA 1.4) met 2X gemiddeld van 10 minuten. Kiezen voor een gezonde neuronen met de algemene piramidale morfologie uiten GFP / mCherry of TL-gelabeld eiwit. Te minimaliseren zonbeschadigde, te verminderen laservermogen tot 0,5-1%. Vergelijkingen van het voertuig-behandelde versus drug-behandelde cellen zal aantonen veranderingen in de wervelkolom motiliteit. Als alternatief kan de wervelkolom beweeglijkheid worden beoordeeld voor en na de behandeling, door de doorbloeding van drugs / voertuig (zie hieronder). Verzamel Z-stacks op elk tijdstip.
  3. Op veranderingen in de dendritische wervelkolom morfologie loop van de tijd, beeld dekglaasjes voor een uur weg om baseline veranderingen vestigen in morfologie. Op dit moment perfuseren de drug / voertuig in de imaging-kamer met behulp van een peristaltische pomp (Gilson, Minipuls 3), en beeld neuron voor nog een uur. Acquire confocale Z-stacks met behulp van een 63x olie doelstelling (Ziess, NA 1.4), met 2X gemiddeld elke 10 minuten. Verminder laservermogen tot 0,5-1% voor zonbeschadigde te minimaliseren.
  4. Aan het einde van elke sessie beeldvorming, het verkrijgen van een 20X beeld van de gehele neuron om vast te stellen niveau van zonbeschadigde. Elke neuronen vertonen tekenen van nood moet worden weggelaten uit kwantificering. Z-stacks van elk tijd-punt moet worden samengebracht in 2D-projecties in Metamorph. Afhankelijk van de beeldkwaliteit en het niveau van transfectie, een mediaan-pass filter of achtergrond aftrek kan worden toegepast in Metamorph om duidelijke beelden voor analyse te maken.
  5. Te evalueren rug morphing en beweeglijkheid, moet beelden die bij het begin, midden en einde van de 100 minuten imaging sessie worden een kleurcode en overlay in Metamorph. Minstens 100 micrometer van dendriet per cel moeten worden geanalyseerd. De totale wervelkolom motiliteit fractie wordt gedefinieerd als het totale aantal van de beweeglijkheid van gebeurtenissen, dat wil zeggen uitbreiding, terugtrekken, hoofd morphing of stuwend beweeglijkheid genormaliseerd naar wervelkolom nummer 6,11. Deze methode meet de frequentie van gebeurtenissen, zonder rekening te houden hun grootheden, het zwembad alle soorten evenementen, en is een algemene schatting van de totale motiliteit. Een stuwend event wordt gedefinieerd als de verschijning van een nieuwe, tijdelijke uitsteeksel van een rug hoofd of dendritische as. Een retractie event wordt gedefinieerd als het verdwijnen van een bestaande of voorbijgaande uitsteeksel zich op een rug hoofd of dendritische as. De som van uitsteken en uitbreiding evenementen worden gedeeld door het totale aantal stekels in de regio van dendriet dat wordt gekwantificeerd.
  6. Voor de beoordeling van veranderingen in individuele wervelkolom morfologie in reactie op medicamenteuze behandeling, het meten van de doorsnede van de dendritische spines, of dendritische wervelkolom lineaire dichtheid op het moment punt -1 uur (1 uur voor perfusie), onmiddellijk voorafgaand aan de behandeling en op elk tijdstip na behandeling. Normaliseren elk tijdstip naar de 1 uur voor-tot-behandeling tijdstip. Om vast te stellen dat de veranderingen in dendritische wervelkolom morfologie of lineaire dichtheid niet te wijten waren aan zonbeschadigde, analyseren neuronen geperfuseerd met voertuig. Verschillen in middelen kunnen worden bepaald door ongepaarde Student's t tests of one-sample t-toets.

8. Alternatieve benaderingen en sleutels tot succes

  1. We hebben beschreven het kweken van corticale neuronen in de aanwezigheid van D, L-APV, een NMDA receptor remmer, van DIV 4 tot einde looptijd (DIV24-28). Opgemerkt moet worden dat, terwijl het kweken van corticale neuronen in de aanwezigheid van D, L-APV heeft het voordeel van het handhaven van een goede gezondheid van de corticale neuronale culturen op lange termijn, de aanwezigheid van D, L-APV kan synaps ontwikkeling beïnvloeden. Als zodanig een alternatief is om de cultuur neuronen in de afwezigheid van D, L-APV 2,5. Bij het kweken van neuronen in de afwezigheid van D, L-APV moet extra aandacht worden besteed aan de algemene gezondheid van culturen, want er is een toename kans op celdood als gevolg van overmatige Ca2 + cytotoxiciteit via over-actieve NMDA receptor activering.
  2. De neuronale culturen beschreven in dit protocol kan worden gebruikt om de mechanismen die relevant zijn voor het reguleren van dendritische wervelkolom morfologie en de beweeglijkheid van de dendriti te onderzoekenc stekels het weergeven van een volwassen morfologie (dat wil zeggen vormen ze verbindingen met pre-synaptische partners, en hebben een helder hoofd-achtige structuur) 2,4,5. Subsidiair, van culturen gebruiken op een eerder tijdstip-point, kan bijvoorbeeld DIV11-16, meer geschikt om vragen die relevant zijn voor dendritische wervelkolom vorming, of regulering van de dendritische spines tijdens de vroege ontwikkeling adres.
  3. Een alternatief voor het gebruik van confocale microscopie, is wide-field epi-fluorescentie te gebruiken om beelden van de behandelde gekweekte corticale neuronen te verwerven. In combinatie met de juiste deconvolutie algoritmen, kan gedetailleerde morfometrische analyse van de stekels gemaakt worden in vaste of levende cellen. Verder is het mogelijk om gebruik maken van alternatieve software, zoals ImageJ ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) of Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns . html ) die vrije software, voor de analyse van dendritische wervelkolom morfologie.
  4. Bij de behandeling van dendritische ruggengraat beweeglijkheid / morphing met behulp van time-lapse imaging, dient te worden opgemerkt dat het gebruik van een kortere time-lapse intervallen, bijvoorbeeld 5-10 minuten, kan een veel meer gedetailleerde analyse van dendritische wervelkolom turnover2, 5 te geven. Het gebruik van kortere tussenpozen mag zich ook snellere vormen van de ruggengraat morphing die niet worden gedetecteerd met behulp langere tijdsintervallen.
  5. Het gebruik van gekweekte corticale neuronen heeft een aantal nadelen en problemen die moeten worden gehouden. In de eerste plaats een zorg van het gebruik van gekweekte corticale neuronen is dat er misschien variabiliteit tussen culturen die van invloed kan zijn parameters zoals dendritische wervelkolom dichtheid. Als zodanig is het essentieel dat de volgende punten zorgvuldig in acht worden genomen de minste hoeveelheid variabiliteit te verzekeren. Ten eerste moet het kweken van parameters en reagentia worden bewaard zo consistent mogelijk in aanvulling op het kweken van goede praktijken, dit zal sterk verminderen van de mate van variabiliteit tussen culturen. Ten tweede is het essentieel dat alle experimenten worden uitgevoerd op hetzelfde tijdstip-punt, en op de zus culturen. Daarnaast heeft de time-punt waar experimenten worden uitgevoerd moet zorgvuldig worden gekozen, zodat de experimentator om de juiste vragen te stellen (zie punt 2 hierboven). Tot slot is het essentieel dat de nodige controles worden gebruikt in alle experimenten, zodat de behandeling voorwaarden altijd worden onderzocht ten opzichte van deze interne controles. Dit zal enige zorg van variabiliteit tussen culturen.
  6. Het gebruik van gekweekte corticale neuronen is een krachtig instrument in staat te stellen onderzoekers kritisch te onderzoeken de mechanismen die essentieel zijn voor de regulatie van dendritische wervelkolom morfologie en beweeglijkheid. Het is echter belangrijk te weten dat deze culturen niet een recapituleren in vivo situatie, en componenten, zoals corticale laag organisatie en de werking van andere celtypen, zoals gliacellen, op synapsvorming kunnen niet worden aangepakt in het systeem zoals hierboven beschreven. Niettemin kan een dergelijk systeem gebruikt worden om mogelijk belangrijke mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van dendritische wervelkolom morfologie en beweeglijkheid te identificeren.

9. Representatieve resultaten

De hierboven beschreven testen zijn ontworpen om veranderingen in de dendritische wervelkolom morfologie, het aantal en de beweeglijkheid te onderzoeken in reactie op farmacologische behandelingen en / of genetische manipulaties van eiwitfunctie in vitro. In ons lab hebben we gebruik gemaakt van deze technieken om de rol van synaptische eiwitten die het actine cytoskelet in dendritische spines reguleren karakteriseren, waarmee zij afweken van hun structuur 2,9. Verder hebben we gebruik gemaakt van deze test om te bepalen hoe neuroactive verbindingen, zoals neuromodulatoren kunnen veranderingen in de dendritische wervelkolom morfologie, het aantal of de vorm, hetzij alleen 4,6,10, of in aanwezigheid van de activiteit-afhankelijke stimuli 5 rijden.

Voor een schatting van de nauwkeurigheid van onze metingen van 1D-of 2D-parameters, we meten de diameters en gebieden van tl-latex microsferen (Duke Scientific) met bekende afmetingen (0,2, 0,52, 1,0 micrometer), gemonteerd in dezelfde voorwaarden als de neuronen gedurende het onderzoek. Met dezelfde voorwaarden als voor de beeldvorming wervelkolom metingen (63x NA = 1,4 olie-immersie objectief, LSM 5 Pascal) hebben we afgebeeld de microsferen, en vervolgens bepaald hun diameters en gebieden in Metamorph, eveneens met onze ruggengraat metingen. Vervolgens hebben we ten opzichte van de feitelijke metingen met de bekende afmetingen van de microsferen.

De grafiek in figuur 1 (fig. 1) toont aan dat we nauwkeurig kon meten op het gebied van microbolletjes van 0,52 en 1,0 micrometer (gebieden = 0,21 micrometer 2 en 0,78 um 2 respectievelijk) (gemeten standaardafwijking ~ 15%; fabrikanten bepaald standaardafwijking ~ 9%). Zelfs voor de 0,2 micrometer microsferen onze metingen waren vrij dicht bij de werkelijke afmetingen (echter met grote SD). Dit komt overeen met de berekende laterale resol ution van onze confocale microscoop met behulp van deze bijzondere doelstelling, 0,3 micrometer (met behulp van de vergelijking Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) 12. Dit is aanzienlijk beter dan de axiale resolutie, waarvan bekend is dat slecht zijn voor confocale en 2-foton microscopen. Daarnaast hebben we experimenteel bepaalde de laterale (x / y-as) punt spreiding functie (PSF) door het meten van groen fluorescerend microbolletjes van 200 nm diameter (Duke Scientific) te worden ~ 0,5 micrometer. Deze schatting werd uitgevoerd met de pinhole open, en dus kan worden aangenomen dat wanneer de pinhole gesloten is, dat de PSF eigenlijk kleiner zou zijn. Toch is dit geeft opnieuw aan dat we in staat zijn om nauwkeurig te meten gebieden groter is dan 0,196 micrometer 2 (diameter = 0,5 micrometer). Een indicatie van de werkelijke laterale PSF wordt gegeven in (Svoboda et al..) 13 als "niet veel minder dan 0,4 micrometer, wat zou resulteren in een gebied van 0,16 micrometer 2". Deze vergelijkingen en theoretische beschouwingen te geven dat we precies kunnen oppervlakten van objecten vergelijkbaar in grootte met stekels maatregel, aangezien de afmetingen van de stekels die we gemeten waren groter dan deze resolutie limiet (> 0,25 um 2). Voor dergelijke voorwaarden, "classic morfometrische technieken zijn kwantitatieve" 13, wat aangeeft dat we betrouwbaar kan ruggengraat gebieden te meten, en nauwkeurig wervelkolom morfologie te vergelijken in verschillende behandeling omstandigheden.

Om nauwkeurig te dendritische wervelkolom morfologie te meten, hebben we getransfecteerd DIV 23 corticale neuronen met een EGFP construct voor 2 dagen. Na transfectie, kunnen cellen worden onderworpen aan behandeling, en zijn vast en verwerkt voor ICC, waar het GFP-signaal is verbeterd, zodat voor een gelijkmatige verdeling over de dendriet (of neuron). Figuur 2 toont een representatief beeld van een corticaal neuron getransfecteerd met GFP, beeld gebracht met behulp van een confocale microscoop met een 63x objectief (NA 1.4) (Fig. 2A). Dit zorgt voor gedetailleerde hoge-resolutie afbeeldingen van de dendritische spines (Fig. 2B). Gedetailleerde morfometrische analyses van dendritische spines worden uitgevoerd in ons laboratorium met behulp van de Metamorph programma. Dit programma stelt ons in staat niet alleen te meten dendritische rug morfologie, maar ook om te onderzoeken de lokalisatie van endogene eiwitten. Een overzicht van hoe wij het uitvoeren van deze analyse wordt gegeven in figuur 2 (Fig. 2C-G).

Een goed gekarakteriseerd effect van activiteit-afhankelijke stimuli is een toename van de dendritische rug maat 2. Figuur 3 toont vertegenwoordiger van time-lapse beeldvorming van een dendritische rug van een DIV 24 corticaal neuron uiten EGFP, belicht gedurende 30 minuten voor en na een activiteit-afhankelijke stimulus. Deze time-lapse experiment bevestigt dat voor de activiteit afhankelijk zijn stimuli dendritische wervelkolom vergroten (Fig. 3A, B). Om te onderzoeken basale rug motiliteit, werden beelden die op de tijdstippen 0, 50 en 100 minuten, en de wervelkolom uitbreidingen, intrekkingen, stuwend beweeglijkheid en het hoofd morphing werden afzonderlijk gemeten en gecombineerd als totale beweeglijkheid. Figuur 3C-D bevestigt dat zelfs onder basale omstandigheden, dendritische spines van corticale neuronen een zekere mate van beweeglijkheid weer te geven.

Figuur 1
Fig. 1. Vergelijking van de gemeten en werkelijke gebieden van de tl-microsferen. Foutbalken geven de standaarddeviatie van de gemeten gebieden. Beelden van microsferen van 0,2 micrometer, 0.52 pm en 1 micrometer. Schaalbalk = 5 micrometer.

Figuur 2
Fig. 2. Kwantificering van de wervelkolom morfologie en IF. A. Afbeelding van DIV 25 EGFP tot expressie brengen gekweekt corticale neuronen. B. hoge vergrotingen van de typische dendritische wervelkolom morfologie gevonden op corticale neuronen. C. EGFP en endogene eiwit (GluR1) overlay. D. Collapsed Z-serie van een EGFP-getransfecteerde piramidale cel dendrieten, de scheiding tussen de as en de stekels is handmatig opgespoord E. onderscheiden, superthreshold regio's worden dan geschetst door Metamorph en gekwantificeerd F. Hand-herleid neuronen gebruikt om de wervelkolom lengte, breedte en cross-sectioneel bepaald gebied te bepalen G. Regio's... door Metamorph die overeenkomen met stekels. H. Spine contouren zal worden overgedragen aan het rode kanaal afbeelding (endogene eiwitten) aan rug-specifiek signaal te kwantificeren. IK. te receptor of synaptic eiwit cluster kwantificeren IF, projectie beelden van de Z-serie worden gebruikt. I. Dendritische as achtergrond IF (geel vierkant) wordt afgetrokken om een "background-afgetrokken" beeld te genereren. J. Dit plaatje is dan thresholded en het programma automatisch maatregelen cluster gebied, lineaire dichtheid, en de totale grijswaarde (IF intensiteit) K. Thresholded afbeelding van H. Scale bars, A = 15 micrometer, B = 1 micrometer.

g "alt =" Figuur 3 "/>
Fig. 3. Activiteit-afhankelijke veranderingen in de wervelkolom morfologie, en basale motiliteit van dendritische spines. A. Time-lapse imaging van een vertegenwoordiger dendritische ruggengraat voor en na toevoeging van een activiteit-afhankelijke stimulus. Activiteit-afhankelijke stimuli werden geïnduceerd door het inschakelen van de experimentele media van ASCF met Mg 2 + en de APV te ACSF zonder Mg2 + en APV, maar met 10 micrometer glycine B. Kwantificering van dendritische wervelkolom gebied (grootte), genormaliseerd tot -30 minuten tijd punt (30 minuten voorafgaand aan de perfusie). C. Representatieve beelden van 0, 50 en 100 minuten de tijd punten van dendritische wervelkolom motiliteit. Top beelden toont overlay van 0 (rood), 50 (groen) en 100 (blauw) minuten de tijd punten, terwijl de afbeeldingen hieronder zijn elk tijdstip afzonderlijk. Asterisk duidt wervelkolom uitbreiding; witte pijl geeft de wervelkolom terugtrekken; groene pijl geeft aan hoofd stuwend beweeglijkheid, open gele pijl duidt op het hoofd rug hoofd morphing D. Kwantificering van dendritische wervelkolom motiliteit parameters en de totale beweeglijkheid E. 20X beeld van de corticale neuronen die EGFP na beeldvorming.. sessie voor de gezondheid van de cel te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De hierboven beschreven technieken voor de gedetailleerde kwantitatieve analyse van dendritische wervelkolom morfologie, lineaire dichtheid en de beweeglijkheid in een van beide vaste of live primaire corticale neuronen zijn gericht op het begrijpen van de effecten van de post-synaptische mechanismen die kunnen bijdragen aan neuropathologieën. Een soortgelijke aanpak kan gebruikt worden om de wervelkolom morfologie of beweeglijkheid in een stekelige neuron, inclusief de hippocampus piramidale, Purkinje, of medium stekelige neuronen te kwantificeren.

Het protocol hier beschreven kan worden aangepast om te kijken naar de fundamentele eigenschappen van synaptische proteïnen en / of de effecten van farmacologische behandelingen op de dendritische spines. Bovendien kan het worden gebruikt om veranderingen in de lokalisatie van endogene synaptische proteïnen, variërend van steigers eiwitten aan receptoren glutamaat te beoordelen. Daarnaast, is het mogelijk niet alleen gedetailleerde morfometrische analyse van de vaste stekels, maar ook het meten van de effecten van synaptische proteïnen of farmacologische behandeling op dendritische rug beweeglijkheid. Deze time-lapse beeldvormende technieken kunnen ook worden aangepast om de handel van eiwitten te onderzoeken, met of zonder gelijktijdig te onderzoeken dendritische rug morfologie.

Gedetailleerde analyse van dendritische wervelkolom morfologie en de beweeglijkheid is een essentieel instrument voor onderzoek naar de mogelijke effecten van de mutant synaptische proteïnen, en hoe mutaties in deze ziekte-geassocieerde synaptische proteïnen kunnen van invloed zijn synaps structuur en functie, en aldus bijdragen tot de pathofysiologie van een aantal aandoeningen van de hersenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Productie van dit werk werd ondersteund door Metamorph (Molecular Devices, Inc.)

Acknowledgments

Wij danken Kelly Jones voor een zorgvuldige bewerking. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​R01MH 071.316, Alzheimer's Association, de Nationale Alliantie voor onderzoek naar schizofrenie en depressie (NARSAD), en de Nationale Alliantie voor Autisme Research (naar) (PP), American Heart Association Postdoctoral Fellowship (DPS), de Amerikaanse Heart Association Predoctorale Fellowship (KMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
  2. Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
  3. Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
  4. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
  5. Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
  6. Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
  7. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  8. Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
  9. Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
  10. Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
  11. Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
  12. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
  13. Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter