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Neuroscience

L'analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

doi: 10.3791/2794 Published: July 13, 2011

Summary

De nombreuses études récentes ont identifié des mutations dans les protéines synaptiques associés à des pathologies cérébrales. Primaire des cultures de neurones corticaux offrent une grande flexibilité dans l'examen des effets de ces protéines associées à la maladie sur la morphologie des épines dendritiques et la motilité.

Abstract

Épines dendritiques sont les sites de la majorité des connexions excitatrices dans le cerveau, et la forme du compartiment post-synaptique des synapses. Ces structures sont riches en actine et ont été montrés pour être très dynamique. En réponse à la plasticité Hebbien classiques ainsi que des signaux neuromodulateurs, épines dendritiques peuvent changer de forme et de nombre, ce qui est pensé pour être critique pour le raffinement des circuits neuronaux et le traitement et le stockage d'informations dans le cerveau. Dans épines dendritiques, un réseau complexe de protéines lien avec les signaux extracellulaires cyctoskeleton actine permettant un contrôle de la morphologie des épines dendritiques et le numéro. Études neuropathologiques ont montré qu'un certain nombre d'états pathologiques, allant de la schizophrénie à des troubles du spectre autistique, affichage anormal morphologie des épines dendritiques ou des chiffres. Par ailleurs, de récentes études génétiques ont identifié des mutations dans les gènes qui codent de nombreuses protéines synaptiques, conduisant à des suggestions que ces protéines peuvent contribuer à la plasticité du rachis aberrante que, en partie, sous-tendent la physiopathologie de ces troubles. Afin d'étudier le rôle potentiel de ces protéines dans le contrôle des morphologies épines dendritiques / nombre, l'utilisation de cultures de neurones corticaux offre plusieurs avantages. Premièrement, ce système permet d'imagerie à haute résolution des épines dendritiques dans les cellules fixes, ainsi que imagerie time-lapse de cellules vivantes. Deuxièmement, ce système in vitro permet de manipuler facilement la fonction des protéines par l'expression de protéines mutantes, par les constructions démontables shRNA, ou des traitements pharmacologiques. Ces techniques permettent aux chercheurs de commencer à décortiquer le rôle de la maladie de protéines associées et de prédire comment les mutations de ces protéines peuvent fonctionner in vivo.

Protocol

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Le protocole décrit ici peut être utilisé pour examiner la morphologie des épines dendritiques et de la dynamique dans tout système de cultures primaires.

1. Préparation des cultures primaires de neurones corticaux

  1. Préparer haute densité des cultures de neurones corticaux de rats Sprague-Dawley rats E18 embryons et la culture en cellules gliales conditionné milieu sans sérum 1-2.
  2. Euthanasier un rat enceintes (E18), conformément aux procédures ACUC; supprimer rapidement l'utérus (avec des fœtus à l'intérieur) et placer dans un plat de Pétri de 100 mm sur la glace.
  3. Couper l'utérus ouvert et de membrane amniotique, maintenez le foetus par le cou (cordon ombilical intact) avec une pince, utiliser une autre pince pour le cuir chevelu Peel d'arrière en avant, et de la fente du crâne ouvert avec une pince forte pointe le long de la ligne médiane de l'arrière vers l'avant.
  4. Retirer l'ensemble du cerveau avec une pince courbe (dans un mouvement de boule) et placer dans un plat de Pétri de 100 mm contenant 10 ml glacée Ca2 + - et Mg 2 + sans HBSS.
  5. Tenez tronc cérébral avec une pince, des hémisphères séparés avec une autre pince, retirer l'hippocampe et le striatum, le cortex et détachez soigneusement séparée du tissu cortical hors de méninges.
  6. Piscine disséqué tissus corticaux, émincer brièvement et transférer dans un tube de 15 ml contenant 4 ml préchauffé trypsine / EDTA (0,25% de trypsine, 0,53 mM EDTA; HyQ trypsine du HyClone SH30042.01); incubation à 37 ° C pour bain d'eau ~ 15 min, retirer la trypsine / EDTA, autant que possible avec une pipette en plastique jetable, ajouter 1,5 ml de milieu neuronal.
  7. Dissocier les tissus digérés mécaniquement par pipetage doux avec une pipette de 5 ml (~ 10 coups, éviter de créer des bulles d'air), ajouter 2 ml de milieu, laisser reposer pendant 30 sec, puis transférer 2 ml de surnageant dans un tube de 15 ml.
  8. Répétez l'étape 6 deux fois (au total devrait prendre environ ~ 15 min).
  9. Spin suspension cellulaire à 200g pendant 2 min.
  10. Retirer le surnageant (avec une pipette de 5 ml - ne pas aspirer à vide); desserrer le culot en feuilletant les doigts contre le fond; cellulaire Resuspendre le culot dans 5 ml de milieu et filtrer à travers une passoire cellule 40 um dans un tube de 50 ml.
  11. Mélanger 10 suspension cellulaire ul et 10 ul bleu trypan, le comte de cellules viables (exclusion du bleu trypan) avec un hématocytomètre.
  12. Rendement typique: 5 x 10 6 cellules / cerveau; diluer à la densité désirée (par exemple 1,5 x 10 6 cellules / ml) pour le placage.
  13. Remplir des plaques de culture avec les médias plaquage (médias Neurobasal supplémenté avec 2% B27, 0,5 mM de glutamine et 1% de pénicilline: stretomycin) (volume total moins le volume placage) contenant 18 mm rond ou de lamelles de 22x22 mm carrés, recouvertes de poly-D-lysine ( 0,2 mg / ml, Sigma) dissous dans 0,1 M de tampon borate (3.1g / l d'acide borique, 4,8 g / L borax, pH 8,5, stérilisée par filtration); volume total de 12 puits plaque = 0,8 ml / puits.
  14. Plaque neurones à la densité fournis dans la prochaine étape; disperser uniformément en douceur les cellules à bascule / taraudage.
  15. Pour plaques de 12 puits (3.5cm 2 / puits): (salut-densité 3 x 10 5 / puits = 857/mm 2) (densité moyenne de 1,5 x 10 5 / puits = 430/mm 2); plaques de 6 puits (9,6 cm 2 / puits): (salut-densité de 9 x 10 5 / puits = 624/mm 2) (densité moyenne de 4,5 x 10 5 / puits = 312/mm 2).
  16. Une heure après le placage, remplacer toutes les moyennes avec un milieu frais (médias Neurobasal supplémenté avec 2% B27, 0,5 mM de glutamine et 1% de pénicilline: stretomycin). Parce que les débris cellulaires ont tendance à s'installer dans le milieu du puits, tourbillon les premières planches pour faciliter l'enlèvement des débris; être prudent de ne pas laisser les piles sèches, à tout moment.
  17. Changer ½ moyenne deux fois par semaine par la suite (~ 300-350 retirer ul de chaque puits, et ajouter 400 ul réchauffé moyennes d'alimentation fraîche dans chaque puits).
    Facultatif: Sur DIV 4 ajouter 200 uM, D-amino-L phosphonovalérate acide (D, L-APV, Montée scientifique) à l'alimentation moyenne; neurones culture en milieu Neurobasal supplémenté avec 2% B27, 0,5 mM de glutamine et 1% de pénicilline: stretomycin + 200 uM APV.
  18. Cultivez des cultures primaires de neurones corticaux pour les 24-28 jours in vitro (DIV), comme en ce moment épines dendritiques points présentent une morphologie mature (c'est à dire qu'ils forment des connexions avec des partenaires pré-synaptique, et avoir une vision claire de tête comme la structure) et correspondent à l'adolescence au début de rongeurs 3-4. Les neurones cultivés sur des lamelles rondes 18 mm peuvent être transfectées et traitées pharmacologiquement, avant d'être fixée, immunocolorés et imagée en utilisant un microscope confocal et utilisées pour l'analyse détaillée morphometeric des épines dendritiques. Les cellules cultivées sur des lamelles de 22x22 mm carrés peuvent ensuite être utilisés dans des expériences d'imagerie time-lapse pour étudier la dynamique des épines dendritiques.

2. La transfection de cultures primaires neurones corticaux

  1. Les neurones corticaux sont transfectées 2-3 jours avant les expériences utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5.
  2. Préparer "H-DMEM" en équilibrant le pH de DMEM (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, pas de glutamine,Invitrogen 11965-092) avec 10 mM HEPES stériles (4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique; MediaTech Cellgro 25-060-CI, 1M, pH 7). Chaude à 37 ° C.
  3. Transfert des lamelles d'600/1000 pl (18/22x22 lamelles mm) pré-chauffé (37 ° C) de nouveaux sans antibiotique (milieu Neurobasal, B27, 0,5 mM de glutamine), et les cellules incuber dans un incubateur humidifié 37 ° C, complété avec 5% de CO 2 pendant 30 minutes.
  4. Pour chaque lamelle, ajouter le montant désigné de l'ADN (un ou plusieurs plasmides d'ADN, par exemple, de décrire pEGFP morphologie cellulaire et étiqueté mutant protéines synaptiques, 1-2 mg en fonction de la construction) à 50 pi de H-DMEM; laisser reposer pendant 5 minutes.
  5. Pour chaque lamelle, ajouter 4 / 6 pl (18/22x22 lamelles mm) Lipofectamine 2000 à 50 pi-h DMEM; laisser reposer pendant 5 minutes.
  6. Bien mélanger des tubes à partir des étapes 1.3 et 1.4, conservent pendant au moins 20 minutes dans un incubateur humidifié 37 ° C, complété par 5% de CO 2. Complexe est stable jusqu'à 6 heures selon le constructeur.
  7. Ajouter le mélange Lipofectamine 2000/DNA partir de l'étape 1.5, goutte à goutte pour les cellules. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié 37 ° C, complété par 5% de CO2, pendant 4 heures.
  8. L'utilisation moyenne d'alimentation de l'étape 1.1 (300/600 ul), compléter avec pré-chauffé (37 ° C) 400/800 pl de milieu d'alimentation fraîche (18/22x22 lamelles mm). Suite à l'étape 1.6, le transfert des lamelles dans un milieu contenant l'alimentation moyennes anciennes et nouvelles.
  9. Permettre l'expression des plasmides de continuer pendant 2-3 jours.

3. Traitement des cultures primaires neurones corticaux cultivés sur des lamelles de 18 mm

Les neurones cultivés sur des lamelles de 18 mm, préalablement transfectées, peuvent également être facilement soumis à des traitements pharmacologiques.

  1. Préparer ACSF (liquide céphalo-rachidien artificiel; en mM: NaCl 125, KCl 2,5, 26,2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 de glucose, 5 HEPES, 2,5 CaCl2 et MgCl2 1,25 avec 200 uM D, L-APV). Chaude à 37 ° C. Préincuber lamelles dans 900 ul ACSF chaude pendant 30-60 minutes. Pré-traitement par des inhibiteurs peut être effectuée pendant cette période.
  2. Préparer des agents pharmacologiques / véhicule de solutions de stock à une concentration 10X travail; effectuer des dilutions des solutions dans l'ACSF. Ajouter délicatement agent / véhicule pour les cellules (volume final de 1000 ul, à une concentration finale de 1X agent / véhicule), et permettre un traitement à poursuivre pour le temps désiré 5.
  3. Après le traitement (s), fixer les cellules et les processus pour immunocytohistochimie.

4. Fixation et immunocytohistochimie (CPI)

  1. Fix neurones soit 4% de formaldéhyde / 4% de saccharose PBS (800 ul) pendant 20 minutes à température ambiante, ou dans du formol à 4% / 4% de saccharose PBS (800 ul) pendant 10 minutes à température ambiante, suivie de lavages en PBS 2X , suivies de 10 minutes fixer avec pré-refroidi (-20 ° C) de méthanol (800 pi) à 4 ° C. Fixation de méthanol œuvres de dénaturation et précipitation des protéines. Cette procédure conduit à une démasquer des protéines dans la densité post-synaptique (PSD), ainsi que dans les zones riches en lipides.
  2. Lavez lamelles dans du PBS (800 pl), 2x, pendant 10 minutes chacun.
  3. Perméabiliser les cellules et bloquer simultanément dans du PBS contenant 2% de sérum de chèvre normal et 0,1% de Triton-X-100 (800 pi) pendant 1 h à température ambiante.
  4. Ajouter anticorps primaires soulevées contre la GFP, épitope tag (par exemple, Sa, myc, V5) ou des protéines endogènes, de PBS contenant 2% sérum normal de chèvre à la concentration appropriée. Prenez un plat de 15 cm, divisez-la en carrés, le nombre, et couvrir avec du parafilm. Ajoutez environ 80 pi de mélange d'anticorps et de bloquer à la parafilm (une goutte par carré), et place sur la lamelle à l'anticorps / bloc mélanger avec les cellules vers le bas. Incubé une nuit à 4 oC.
  5. Lavez lamelles dans du PBS, 3x pour 15 minutes chacun.
  6. Diluer Alexa anticorps secondaires conjugués (Invitrogen) dans du PBS contenant 2% de sérum de chèvre normal à la concentration appropriée. Incuber les anticorps secondaires de la même manière que dans l'étape 3.4, à température ambiante pendant 1 heure, protégé de la lumière.
  7. Lavez lamelles 15 autres 3x minutes dans du PBS.
  8. Lamelles sur le mont microscope standard diapositives à l'aide de réactifs Prolongez Antifade Gold (Invitrogen).

5. L'analyse quantitative des morphologies du rachis

Nous obtenons des images confocal de neurones simple et double-teint (cellules exprimant la GFP et les protéines endogènes construire ou d'intérêt) en utilisant un Zeiss LSM5 Pascal microscope confocal. Pour toutes les expériences d'imagerie choisir saine neurones pyramidaux à imager et utilisée dans une analyse ultérieure. Neurones sains sont des cellules qui ne présentent pas de signe de bourgeonnement ou de détresse en raison d'un traitement ou de fixation et qui contiennent une pleine, tonnelle dendritiques ininterrompue.

  1. Acquérir les images de neurones utilisant une huile de 63x objectif à immersion (Zeiss) avec un NA (numOuverture erical) de 1,4, comme une série Z de 3-8 des images, en moyenne 4 fois, avec des intervalles 0,37 um, 1024x1024 pixels à une vitesse de numérisation de 2,5 secondes par article. Les cultures qui doivent être directement comparés doivent être imagées avec les paramètres d'acquisition mêmes. 10-20 neurones / état, chaque 3-5 expériences séparées, et 2 de 100 um dendrites par neurone doit être analysé. Les expériences doivent être faites sur les aveugles et les cultures sœur. Ajuster le gain du détecteur et compensée pour inclure même faiblement fluorescentes épines minces sans créer un halo autour de la dendrite, tels que la transition entre le signal fluorescent dans le dos et le fond est forte, permettant une quantification précise. Gardez les paramètres d'acquisition de même pour toutes les analyses au sein de la même expérience.
  2. GFP images peuvent être acquises en utilisant une ligne de laser à l'argon, excitant à 488 nm et de collecte avec un filtre passe-bande 505-530 nm à l'. Images de protéines surexprimées ou des protéines endogènes immunocolorées avec une Alexa 568 anticorps secondaire (Invitrogen) peuvent être recueillies à l'aide d'un laser HeNe passionnante à 543 nm, et la collecte en utilisant un filtre passe-temps à 560 nm. Gardez puissances laser à un minimum pour éviter de photoblanchiment des échantillons.
  3. En utilisant le logiciel MetaMorph (Molecular Devices, Inc), en deux dimensions, fond-soustraite, les reconstructions de projection maximale de la série Z des images sont utilisées pour l'analyse morphométrique et la quantification. Afin d'examiner la morphologie des épines dendritiques, l'effondrement de la série Z d'images, de calibrer la distance requise, puis le seuil d'inclure toutes les épines d'une façon que le seuil correspond exactement au contour des épines (fig. 2E, F). Seuls les épines sur les dendrites secondaires et tertiaires (longueur totale de 100 um par neurone) doivent être mesurés afin de réduire la variabilité, et les mesures des segments doivent être faites entre les points de branchement. Manuellement le contour de chaque colonne vertébrale de sorte qu'il deviendra un périmètre fermé (Fig. 2G).
  4. Mesurer les paramètres suivants automatiquement dans la colonne vertébrale MetaMorph: longueur du rachis, de la largeur du rachis, section transversale, et la densité des épines dendritiques linéaire. Exporter les paramètres morphométriques épines dendritiques dans Excel pour la quantification. Utilisez impair de Student t tests pour déterminer la signification statistique des différences entre les deux groupes; ANOVA à un facteur peut être utilisé pour comparer trois groupes ou plus, suivie par Tukey-B post-hoc pour les comparaisons multiples. L'analyse statistique peut être effectuée dans Excel, GraphPad ou SPSS. Analyser parcelles cumulatif utilisant Kolmogorov-Smirnov (KS test) 2,5-6.

6. Quantitatives d'immunofluorescence (IF)

Quantification des anticorps par immunofluorescence en utilisant contre les protéines spécifiques synaptique, visualisées en utilisant une Alexa 568 anticorps secondaire (Invitrogen), peut être utilisé pour examiner les changements dans le regroupement et la localisation synaptique des protéines synaptiques endogènes.

  1. Acquérir des images en utilisant un microscope confocal comme décrit ci-dessus. Utilisez une atmosphère d'argon et un laser HeNe (voir ci-dessus) à l'image de double-tachés neurones. Seule l'image saine neurones pyramidaux qui ne présentent pas de signes de détresse.
  2. Pour les mesures d'intensité de fluorescence, soustraire le bruit de fond correspondant à l'arbre dendritique (Fig. 2I, carré jaune) pour générer un "background-soustrait" l'image (fig. 2J) à l'aide MetaMorph. Également des images de seuil pour inclure les grappes avec une intensité d'au moins deux fois supérieures à la dendrite adjacentes (Fig. 2K). Aperçu des régions le long des dendrites (100 um par neurone) en utilisant les "périmètres" d'utilité (Fig. 2D) et de mesurer automatiquement la densité linéaire (longueur nombre/100 dendrite um), et de l'intensité intégrée (SI totale intensité) de chaque cluster en utilisant synaptique MetaMorph 7-9.
  3. Pour mesurer la teneur en colonne relative d'une protéine synaptique, d'abord déterminer le regroupement de protéines par seuillage de l'image GFP pour déterminer la morphologie du rachis (Fig. 2E, F) en utilisant MetaMorph. Transférer les régions d'intérêt qui comprennent uniquement des épines aux images de la protéine d'intérêt capturé dans l'autre canal (fig. 2G, H). Comptez le nombre de grappes de protéines et de mesurer l'intensité d'immunofluorescence intégrée à l'intérieur des épines afin d'évaluer la teneur en protéines du rachis.
  4. Exporter les paramètres du SI protéines synaptiques dans Excel pour la quantification. Utilisez impair de Student t tests pour déterminer la signification statistique des différences entre les deux groupes; ANOVA à un facteur peut être utilisé pour comparer trois groupes ou plus, suivie par Tukey-B post-hoc pour les comparaisons multiples. L'analyse statistique peut être effectuée dans Excel, GraphPad ou SPSS.

7. Imagerie time-lapse

Afin d'examiner la dynamique des épines dendritiques, telles que des changements dans la motilité colonne vertébrale ou de la morphologie du rachis d'épines individuelles, en présence ou en absence de maladie associée à des protéines synaptiques, grandir primaires neurones corticaux en culture sur des lamelles de 22x22 mm carré pour DIV 24-28. Neurons peut être double-transfectées avec GFP / mCherry de définir la morphologie cellulaire, et par fluorescence taggés mutant protéines synaptiques comme décrit ci-dessus. Pour toutes les expériences d'imagerie, choisissez saine neurones pyramidaux exprimant à la fois des constructions; ces cellules peuvent être soumis à un traitement pharmacologique, imagée et utilisées dans des analyses ultérieures.

  1. Préincuber neurones cultivés sur des lamelles de 22x22 mm dans 1,5 ml ACSF pendant 30-60 minutes dans un incubateur humidifié 37 ° C, supplémenté avec 5% de CO 2. Les cellules peuvent également être pré-traités avec des médicaments à ce stade aussi. Après pre-incubation/treatment, cellules de transfert vers une chambre d'étape de l'imagerie clos (Warner, RC-30HV). Maintenir une température de 37 ° C avec une unité de commande (Warner, TC-344B) 2,5-6,10.
  2. Pour examiner la motilité du rachis, de pré-traiter les cellules avec des médicaments ou d'un véhicule jusqu'à 30-60 minutes avant de transférer les cellules de la chambre de l'imagerie. Cela permet à la fois suffisante pour que le médicament / véhicule pour initier les voies second messager dans le neurone. Acquérir des images à travers un objectif 63X (Ziess, NA 1,4) avec étalement 2X moins 10 minutes d'intervalle. Choisissez les neurones sains avec l'ensemble des morphologies pyramidale exprimant la GFP / ou fluorescent mCherry-protéine marquée. Afin de minimiser le photovieillissement, de réduire la puissance du laser à 0.5-1%. Les comparaisons de véhicules-traités par rapport à la drogue cellules traitées démontrera les changements dans la motilité du rachis. Alternativement, la motilité colonne vertébrale peut être évaluée avant et après le traitement, par perfusion de médicament / véhicule (voir ci-dessous). Recueillir Z-piles à chaque point de temps.
  3. Pour suivre les changements dans la morphologie des épines dendritiques au cours du temps, des lamelles de l'image pendant 1 heure pour établir les variations de base en morphologie. A cette époque, perfuser le médicament / véhicule dans la chambre d'imagerie utilisant une pompe péristaltique (Gilson, Minipuls 3), et le neurone image pour une heure supplémentaire. Acquérir confocale Z-piles utilisant un objectif de pétrole 63X (Ziess, NA 1,4), avec 2X moyenne toutes les 10 minutes. Réduire la puissance du laser à 0.5-1% afin de minimiser le photovieillissement.
  4. A la fin de chaque session d'imagerie, d'obtenir une image 20X du neurone au niveau de l'ensemble du photovieillissement déterminer. Toute neurones présentant des signes de détresse doit être omis de la quantification. Z-stacks de chaque point dans le temps devrait être effondré dans les projections 2D dans Metamorph. Selon le niveau de qualité d'image et de la transfection, un filtre médian-passer ou de soustraction de fond peut être appliquée dans Metamorph pour produire des images claires pour l'analyse.
  5. Afin d'évaluer la colonne vertébrale de morphing et de la motilité, des images prises au début, milieu et fin de la séance d'imagerie 100 minutes devraient être codés par couleur et superposée au MetaMorph. Au moins 100 um de Dendrite par cellule doivent être analysés. La fraction du rachis totale motilité est défini comme le nombre total d'événements motilité, l'extension à savoir, la rétraction, la tête morphing ou la motilité protrusion normalisée à 6,11 numéro de la colonne vertébrale. Cette méthode mesure la fréquence des événements, sans tenir compte de leurs grandeurs, il regroupe tous les types d'événements, et est une estimation générale de la motilité d'ensemble. Un événement en propulsion est définie comme l'apparition d'une nouvelle saillie passagère d'une tête de la colonne vertébrale ou de l'arbre dendritique. Un événement de rétraction est défini comme la disparition d'une protubérance existante ou transitoire situé sur une tête de la colonne vertébrale ou de l'arbre dendritique. La somme des événements protubérance et l'extension sont divisés par le nombre total d'épines dans la région de dendrites qui est quantifiée.
  6. Pour évaluer les changements dans la morphologie du rachis individuelles en réponse à un traitement médicamenteux, de mesurer la surface transversale des épines dendritiques, ou la densité des épines dendritiques linéaire au point dans le temps -1 heures (1 heure avant la perfusion), qui précèdent immédiatement le traitement et à chaque point suivant le temps traitement. Normaliser chaque point de temps pour les RH de 1 point de temps avant à un traitement. Afin de déterminer que les modifications de la morphologie des épines dendritiques ou de densité linéaire n'étaient pas dues à photovieillissement, analyser les neurones perfusé avec un véhicule. Les différences de moyens peuvent être déterminées par des tests de Student non apparié t ou test t pour un échantillon.

8. Les approches alternatives et les clés de la réussite

  1. Nous avons décrit les neurones corticaux en culture en présence du D, L-APV, un inhibiteur des récepteurs NMDA, de DIV 4 jusqu'à l'échéance (DIV24-28). Il faut noter que bien que les neurones corticaux en culture en présence du D, L-APV a l'avantage de maintenir la bonne santé des cultures de neurones corticaux à long terme, la présence de D, L-APV peuvent influencer le développement des synapses. Comme une telle alternative est de neurones de la culture en l'absence de D, L-APV 2,5. Lorsque les neurones en culture en l'absence de D, L-APV attention particulière devrait être accordée à la santé globale des cultures, comme il ya une chance hausse de la mort cellulaire excessive due à Ca2 + via la cytotoxicité sur-actif activation du récepteur NMDA.
  2. Les cultures de neurones décrits dans le présent protocole peut être utilisé pour examiner les mécanismes qui sont pertinents pour réguler la morphologie des épines dendritiques et la motilité des dendritic épines affichant une morphologie mature (c'est à dire qu'ils forment des connexions avec des partenaires pré-synaptique, et avoir une vision claire de tête comme la structure) 2,4,5. Alternativement, l'utilisation de cultures à une heure antérieure-point, par exemple DIV11-16, peut être plus appropriée pour répondre aux questions pertinentes pour la formation des épines dendritiques, ou la réglementation des épines dendritiques au cours du développement précoce.
  3. Une alternative à l'utilisation de la microscopie confocale, est d'utiliser à large champ épifluorescence pour acquérir des images des traités des cultures de neurones corticaux. En combinaison avec les algorithmes de déconvolution échéant, une analyse détaillée morphométriques d'épines peuvent être faites dans des cellules fixées ou vivantes. Par ailleurs, il est possible d'utiliser des logiciels alternatifs, tels que ImageJ ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html ) ou Neuronstudio ( http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns . html ), qui sont des logiciels libres, pour l'analyse de la morphologie des épines dendritiques.
  4. Lorsque l'on examine la motilité des épines dendritiques / morphing utilisant imagerie time-lapse, il convient de noter que l'utilisation de courts intervalles de temps-faute, par exemple 5-10 minutes, peut fournir une analyse beaucoup plus détaillée des épines dendritiques turnover2, 5. Utilisation des intervalles de temps plus court peut aussi identifier des formes plus rapide de la colonne vertébrale de morphing qui ne serait pas détecté à l'aide des intervalles de temps plus long.
  5. L'utilisation de cultures de neurones corticaux a un certain nombre d'inconvénients et des préoccupations qui doivent être pris en considération. Tout d'abord, une préoccupation de l'utilisation des cultures de neurones corticaux est qu'il peut y avoir une variabilité entre les cultures qui peuvent influer sur des paramètres tels que la densité des épines dendritiques. En tant que tel, il est essentiel que les points suivants sont scrupuleusement respectées afin d'assurer le minimum de variabilité. Tout d'abord, les paramètres de la culture et les réactifs doivent être conservés aussi cohérents que possible en plus des pratiques de culture bonnes, ce qui permettra de réduire considérablement le niveau de variabilité entre les cultures. Deuxièmement, il est essentiel que toutes les expériences soient effectuées en même temps de point, et sur les cultures sœur. En outre, le point dans le temps au cours de laquelle sont effectuées les expériences doivent être soigneusement choisis afin de permettre à l'expérimentateur de poser les questions appropriées (voir point 2 ci-dessus). Enfin, il est essentiel que les contrôles appropriés sont utilisés dans toutes les expériences, de sorte que les conditions de traitement sont toujours examinés par rapport à ces contrôles internes. Cela permettra d'éliminer toute préoccupation de la variabilité entre les cultures.
  6. L'utilisation de cultures de neurones corticaux est un outil puissant pour permettre aux chercheurs d'examiner de façon critique les mécanismes qui sont essentiels pour la régulation de la morphologie des épines dendritiques et la motilité. Cependant, il est important de noter que ces cultures ne récapituler une situation in vivo, et des composants tels que l'organisation couche corticale et l'effet des autres types de cellules, telles que les cellules gliales, sur la formation des synapses ne peuvent pas être traitées dans le système décrit ci-dessus. Néanmoins, un tel système peut être utilisé pour identifier les mécanismes sous-jacents potentiellement crucial de la régulation de la morphologie des épines dendritiques et la motilité.

9. Les résultats représentatifs

Les tests décrits ci-dessus sont conçus pour étudier les changements dans la morphologie des épines dendritiques, le nombre et la motilité dans la réponse aux traitements pharmacologiques et / ou les manipulations génétiques de la fonction des protéines in vitro. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé ces techniques pour caractériser le rôle des protéines synaptiques qui régulent le cytosquelette d'actine dans les épines dendritiques, altérant ainsi leur structure 2,9. Par ailleurs, nous avons utilisé ce test pour déterminer comment les composés neuroactifs, tels que les neuromodulateurs peuvent conduire à des changements dans la morphologie des épines dendritiques, le nombre ou la forme, soit seul, 4,6,10, ou en présence d'une activité dépendante des stimuli 5.

Pour estimer la précision de nos mesures des paramètres 1D ou 2D, nous avons mesuré les diamètres et les domaines de microsphères de latex fluorescentes (Duke Scientific) de dimensions connues (0,2, 0,52, 1,0 um) montés dans les mêmes conditions que les neurones tout au long de l'étude. En utilisant les conditions d'imagerie que pour les mesures du rachis (63X NA = 1,4 immersion dans l'huile objectif, LSM 5 Pascal), nous avons imagé les microsphères, et a ensuite déterminé les diamètres et les zones de Metamorph, de même avec nos mesures colonne vertébrale. Nous avons ensuite comparé les mesures réelles avec les dimensions connues des microsphères.

Le graphique de la figure 1 (Fig.1) montre que nous avons pu mesurer avec précision les zones de microsphères de 0,52 et 1,0 um (zones = 0,21 um um 2 et 2 respectivement 0,78) (mesuré l'écart-type ~ 15%, les fabricants déterminés écart type ~ 9%). Même pour les microsphères de 0,2 um nos mesures ont été assez proche de la dimension réelle (avec toutefois de grandes SD). Ceci est cohérent avec le résol calculée latéraux ution de notre microscope confocal à l'aide de cet objectif particulier, 0,3 um (en utilisant l'équation Δxcf = (0.61/v2) √ / NA) 12. Ce chiffre est nettement meilleure que la résolution axiale, qui est connue pour être pauvre pour microscopes confocaux et 2-photon. En outre, nous déterminé expérimentalement le latéral (X / Y axes) Point Spread Function (PSF) en mesurant vert fluorescent microsphères de 200 nm de diamètre (Duke Scientific) à ~ 0,5 um. Cette estimation a été réalisée avec l'ouverture sténopé, et donc on peut supposer que lorsque le sténopé est fermé, que le PSF serait en fait plus petit. Néanmoins, cela indique à nouveau que nous sommes capables de mesurer avec précision les zones de plus de 0.196 um 2 (diamètre = 0,5 um). Une indication de la réelle PSF latérale est donné en (Svoboda et al.) 13 comme «pas beaucoup moins de 0,4 um, ce qui aboutirait à une superficie de 0,16 um 2". Ces comparaisons et des considérations théoriques indiquent que l'on peut mesurer avec précision les zones d'objets de taille similaire à épines, puisque les dimensions de la colonne vertébrale, nous avons mesuré étaient plus grandes que cette limite de résolution (> 0,25 um 2). Pour de telles conditions, «classique techniques morphométriques sont quantitatifs" 13, ce qui indique que nous pouvons mesurer de manière fiable les zones du rachis, et comparer avec précision les morphologies colonne vertébrale dans les conditions de traitement différentes.

Afin de mesurer avec précision la morphologie des épines dendritiques, nous avons transfecté DIV 23 neurones corticaux avec une construction EGFP pendant 2 jours. Après transfection, les cellules peuvent être soumis à un traitement, et sont fixées et traitées pour la CPI, où le signal GFP est amélioré pour permettre une distribution uniforme à travers la dendrite (ou neurone). La figure 2 montre une image représentative d'un neurone cortical transfectées avec GFP, imagé en utilisant un microscope confocal avec un objectif 63X (NA 1,4) (figure 2A). Cela permet d'détaillée des images haute résolution des épines dendritiques (figure 2B). Détail des analyses morphométriques des épines dendritiques sont effectuées dans notre laboratoire en utilisant le programme Metamorph. Ce programme nous permet non seulement de mesurer la morphologie des épines dendritiques, mais aussi d'examiner la localisation de protéines endogènes. Un aperçu de la façon dont nous procédons à cette analyse est fournie dans la figure 2 (figure 2C-G).

Un effet bien caractérisé de l'activité-dépendante des stimuli est une augmentation de la taille des épines dendritiques 2. La figure 3 montre représentatives imagerie time-lapse d'une épine dendritique d'un DIV 24 EGFP neurones corticaux exprimant, imagée pendant 30 minutes avant et après un stimulus dépendant de l'activité. Cette expérience time-lapse confirme que l'activité-dépendante des stimuli augmenter la taille des épines dendritiques (figure 3A, B). Pour examiner la motilité du rachis basale, les images ont été acquises à des moments 0, 50 et 100 minutes, et les extensions de la colonne vertébrale, des rétractions, la motilité et la tête de protrusion morphing a été mesurée séparément et combinés que la motilité totale. Figure 3C-D confirme que même dans des conditions basales, épines dendritiques des neurones corticaux écran un certain niveau de motilité.

Figure 1
Fig. 1. Comparaison des zones mesurées et réelles de bars microsphères fluorescentes erreur. Représentent l'écart-type des domaines mesurés. Images de microsphères de 0,2 um, um 0,52 et 1 um. Barre d'échelle = 5 um.

Figure 2
Fig. 2. Quantification de la morphologie du rachis et des SI. A. Image du DIV 25 EGFP exprimant cultivés neurones corticaux. Grossissements B. Haute de la morphologie de la colonne vertébrale typiques dendritiques trouve sur les neurones corticaux. C. EGFP et protéine endogène (GluR1) superposition. D. Collapsed série Z d'une pyramide EGFP-transfectées dendrites des cellules, la division entre l'arbre et des épines est tracée manuellement E. distincts, les régions superthreshold sont ensuite décrits et quantifiés par Metamorph F. main tracée neurones utilisés pour déterminer la longueur du rachis, la largeur et surface transversale G. régions déterminées... par Metamorph qui correspondent à des épines. contours Spine H. sera transféré à l'image du canal rouge (protéine endogène) afin de quantifier la colonne vertébrale signal spécifique. IK. Afin de quantifier récepteurs ou cluster protéine synaptique SI, images de projection de la série Z sont utilisés. I. cadre d'arbre dendritique SI (carré jaune) est soustraite à générer un "background-soustrait» de l'image. J. Cette image est ensuite seuillée et le programme de mesures automatiquement la zone de cluster, la densité linéaire, et la valeur totale de gris (SI intensité) K. image seuillée à partir de barres d'échelle H., A = 15 um, B = 1 um.

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Fig. 3. Activité dépendante des changements dans la morphologie du rachis, et la motilité des épines dendritiques basales. A. imagerie time-lapse d'une colonne vertébrale représentant dendritiques avant et après l'addition d'un stimulus dépendant de l'activité. Activité dépendante des stimuli ont été induites par les médias de commutation expérimentale de la FCSA contenant Mg2 + et d'APV ACSF sans Mg 2 + et APV, mais contenant 10 um glycine B. Quantification de la zone épines dendritiques (taille), normalisée au point du temps -30 minutes (30 minutes avant la perfusion). images représentant C. de points 0, 50 et 100 minutes de temps de la motilité des épines dendritiques. Top images montre la superposition de 0 (rouge), 50 (vert) et 100 (bleu) points temporels minute, alors que les images ci-dessous sont chaque point séparément. Astérisque indique l'extension du rachis; flèche blanche indique la rétraction du rachis; tête de flèche verte indique la motilité protrusion; ouvrir la tête flèche jaune indique la tête du rachis morphing quantification D. dendritiques paramètres de motilité colonne vertébrale et la motilité totale E. 20X image de neurones corticaux exprimant l'EGFP imagerie suivants.. session pour déterminer la santé des cellules.

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Discussion

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Les techniques décrites ci-dessus pour l'analyse quantitative détaillée de la morphologie des épines dendritiques, densité linéaire et la motilité soit fixe ou vivent les neurones corticaux primaires sont axés sur la compréhension des effets de post-synaptique des mécanismes qui peuvent contribuer à neuropathologies. Une approche similaire peut être utilisée pour quantifier la morphologie ou la motilité du rachis dans tous les neurones épineux, dont l'hippocampe pyramidale, Purkinje, ou neurones épineux moyens.

Le protocole décrit ici peut être adapté à regarder les propriétés fondamentales des protéines synaptiques et / ou les effets des traitements pharmacologiques sur des épines dendritiques. Par ailleurs, il peut être utilisé pour évaluer les changements dans la localisation des protéines synaptiques endogènes allant de protéines d'échafaudage de récepteurs du glutamate. En outre, il permet non seulement une analyse détaillée morphométriques d'épines fixes, mais aussi de mesurer les effets des protéines synaptiques ou un traitement pharmacologique sur la motilité des épines dendritiques. Ces techniques d'imagerie time-lapse peut également être modifiée afin d'examiner le trafic des protéines, avec ou sans examinant simultanément la morphologie des épines dendritiques.

Une analyse détaillée de la morphologie des épines dendritiques et la motilité est un outil essentiel pour étudier les effets potentiels des protéines mutantes synaptique, et comment des mutations dans ces protéines associées à la maladie peut affecter la structure synaptique et la fonction des synapses, ce qui contribue à la physiopathologie d'un certain nombre de troubles du le cerveau.

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Disclosures

La production de ce travail a été soutenu par MetaMorph (Molecular Devices, Inc.)

Acknowledgments

Nous remercions Kelly Jones pour l'édition soignée. Ce travail a été soutenu par NIH R01MH 071316, Association Alzheimer, la National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD), et la National Alliance for Research Autisme (NAAR) (PP), l'American Heart Association de bourses postdoctorales (DPS); américaine Heart Association Bourse prédoctorale (KMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm round Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0714 (CS-18R15)
22 mm square Cover glass No. 1.5 Warner Instruments 64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-0899 MW 70~150 Kda
Neurobasal Media Invitrogen 21103049
B27 Invitrogen 17504044
Glutamine Invitrogen 21051024
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140148
D,L-APV (AP-5) Ascent Scientific Asc-004
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
DMEM Invitrogen 11965092
HEPES Mediatech, Inc. 25-060-C 1 1M, pH 7
Formaldehyde Solution EMD Millipore FX0415-5 36%, Histology grade
Normal Goats Serum VWR international 100188-514 Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100 Fisher Scientific AC21568-2500 Acros Organics
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed Invitrogen A-11029
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* Invitrogen A-11034
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36934 Special Packaging
Enclosed imaging stage chamber Warner Instruments RC-30HV
Temperature controller unit Warner Instruments TC-344B
MetaMorph Universal Imaging

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References

  1. Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
  2. Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
  3. Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
  4. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
  5. Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
  6. Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
  7. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  8. Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
  9. Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
  10. Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
  11. Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
  12. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
  13. Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
L'analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture
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Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).More

Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons. J. Vis. Exp. (53), e2794, doi:10.3791/2794 (2011).

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