Summary
解剖手法は、硝子体、網膜、およびマウスの眼からレンズ、遠心分離により分離し、タンパク質アッセイと特性評価の空洞化を示しています。
Abstract
マウスの網膜は、遺伝性網膜疾患のための重要な遺伝的モデルとして浮上している一方で、マウスの硝子体が検討されていない。硝子体は眼内だけでなく、眼のタンパク質が病気中に蓄積網膜の上に横たわって高度に水性細胞外マトリックスである。硝子体と網膜の間に1月3日異常の相互作用は、網膜剥離、増殖性糖尿病網膜症、ブドウ膜炎、および増殖性硝子体網膜症などのいくつかの疾患の根底にある1。マウスのレンズが眼の75％近くを占めているので、4相対的なマウスの硝子体の量は、ヒトの硝子体（図1）より大幅に小さくなります。5は 、これはマウスの硝子体の生化学的研究が困難な作られている。このビデオの記事では、我々はトランスジェニックマウスモデルの使用がより明確に網膜硝子体疾患の開発にこの細胞外マトリックスの役割を定義できるようになります網膜から、マウスの硝子体を細かく分析し、分離する手法を提案。
Protocol
1。前眼部の解剖。
- 角膜輪部に後部強膜組織を0.22 forcepと地球儀（眼球）安定していると把握されています。
- 顕微ブレードは、角膜輪部から角膜輪部に角膜の線形切開を行うために使用されます。
- 0.12コリブリforcepは、切開で角膜を把握するために使用されます。
- 前房の流体は、その後ベックリキセル外科槍で吸収される。
2。レンズ内臓摘出。
- 角膜を把握0.12コリブリforcepは世界を安定させるために使用されます。
- 細かいカーブニードルホルダーは（または曲線麦粒鉗子）世界の後面に向かってレンズの後ろに挿入されます。ニードルホルダーは部分的に閉じられ、そして前方に引っ張られている。圧力は、眼の壁をそのままにして角膜を切開して前方にレンズを押し出す強膜の外表面にピンセットを用いて適用されます。硝子体は半透明のゲルとして表示され、レンズに部分的に付着しています。
- レンズ、硝子体組織をPBSに溶解したプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）の20マイクロリットルを含むフィルタリング遠心分離管に配置されます。
3。網膜の内臓摘出。
- 角膜切開を把握0.12コリブリ鉗子で地球を安定させるために引き続き。
- 細かいカーブニードルホルダーは（または曲線麦粒鉗子）視神経の近くに、できるだけ地球にはるかに後方に配置されます。ニードルホルダーは部分的に閉じられ、そして前方に引っ張られている。圧力は、角膜を切開して前方に網膜を押す強膜の外表面にピンセットを用いて適用されます。硝子体が網膜に付着している半透明のゲルとして表示されます。網膜は黄色、血管組織として可視化される。色素組織の任意のストリップは、鉗子で剥離することができます。
- 網膜硝子体の組織を、レンズ、硝子体の組織を含むフィルタ処理された遠心分離管に配置されます。
4。フィルタリングされた遠心分離。
- フィルタリングされた遠心管は、ベンチトップ遠心機に配置されます。 12分間14,000 × Gで回転する。
- 硝子である下部チャンバ、から溶離液を吸引除去する。網膜は、上室に残ります。これらのサンプルは、タンパク質の研究に利用することができます。
5。代表的な結果
硝子体サンプルはSDS - PAGE（図2）により分析した。サンプルはまた、酵素活性アッセイ（図3）を使用しました。
図1マウスのアイダイアグラム。ヒトとマウスの眼の断面模式は、その大きなレンズのためにマウスの眼の相対的な小さな硝子体の体積を示しています。
図2一次元SDS - PAGEマウスの硝子体と網膜の。マウスの硝子体、13.6 mg / mLの（レーン1）、および網膜のタンパク質プロファイル、11.35 mg / mLの（レーン2）。ゲル電気泳動は、フラミンゴ蛍光ゲル染色で染色、45分、150 kVで行い、VersaDocイメージングシステム（バイオラッド、ヘラクレス、CA）を用いて可視化した。
図3。マウスとヒト硝子体中のスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）酵素活性 。総SOD活性の測定（SOD活性を比色aasayキット、＃AB65354、アブカム株式会社、ケンブリッジ、MA）は、DBAとアルビノマウスの内臓摘出によって収集された硝子体と網膜を行った。これは、人間の硝子体コアと相対活性を決定するために事後ヒトドナーの目から採取したヒトの網膜におけるSODの活性と比較した。希釈していないガラス質コア試料は、手動で11、23ゲージの針を用いて吸引され、網膜は目の開花とRPE /脈絡膜複合体から離れて組織を切断して回収した。アッセイは、SODのアイソフォームを区別しませんが、それが唯一の細胞外アイソフォームであるため、ガラス質のSOD活性は、SOD3を反映する可能性が高い12網膜のSOD活性は、3つすべてのSODのアイソフォームを反映する可能性がある：。細胞内SOD1、ミトコンドリアSOD2、および細胞外SOD3。このSODアッセイを含む、高感度の酵素アッセイ、12、タンパク質の交差汚染の可能性は可能であり、さらなる研究が必要です。エラーバーはSEMを示す。
Discussion
トランスジェニックマウスは、網膜と網膜硝子体疾患を調べるための重要なモデルである。6-10マウス硝子体、しかし、マウスの眼の大きいレンズに起因する人間の硝子体に比べて眼の非常に小さい割合で構成されています。5これになるにはそれが困難なマウスの硝子体を単離精製する。このような増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、ブドウ膜炎、および網膜剥離などの疾患の間に硝子体に関連するタンパク質の変化を理解することにより、彼らは進歩のメカニズムへの洞察を与える。酵素とプロテオーム解析のためのタンパク質の収量を最大化しながら、この可視化実験のプロトコールは、マウスの硝子体を取得し、浄化する手段を提供します。
Disclosures
動物実験は、眼科と視覚研究における動物の使用のための眼科の文の研究とビジョンのための協会に準拠して行った。
Acknowledgments
資金は、視力および失明を防ぐために研究のための闘いによって提供されていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal FilterUltracel YM-100 or YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
References
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