Summary
A técnica de dissecção ilustra a evisceração do vítreo, retina, ea lente do olho do rato, a separação por centrifugação, e caracterização de proteínas com os ensaios.
Abstract
Enquanto a retina do rato tem emergido como um importante modelo genético para a doença hereditária da retina, o vítreo do mouse continua a ser explorado. O vítreo é uma matriz extracelular altamente aquosa que recobre a retina, onde intra-ocular, bem como proteínas extraocular acumulam durante a doença. 1-3 interações anormais entre vítreo e retina subjazem diversas doenças, como descolamento de retina, retinopatia diabética proliferativa, uveíte e Vitreorretinopatia proliferativa 1. , 4 O volume vítreo relativa do mouse é significativamente menor do que o vítreo humano (Figura 1), uma vez que a lente do mouse ocupa quase 75% do seu olho. 5 Isso fez com que estudos bioquímicos do vítreo do mouse desafiador. Neste artigo de vídeo, apresentamos uma técnica para dissecar e isolar o vítreo da retina do rato, que vai permitir o uso de modelos de ratos transgênicos para definir mais claramente o papel dessa matriz extracelular no desenvolvimento de doenças vítreo-retinianas.
Protocol
1. Dissecção do segmento anterior.
- Tecido escleral posterior ao limbo é apreendido com uma pinça 0,22 e do globo (globo ocular) é estabilizada.
- Uma lâmina de microcirurgia é usado para fazer uma incisão linear na córnea a partir de limbo a limbo.
- A Colibri 0,12 fórceps é então utilizado para captar a córnea na incisão.
- O fluido da câmara anterior é então absorvida com uma lança Weck-Cel cirúrgico.
2. Evisceração lente.
- A Colibri 0,12 fórceps segurando a córnea é usada para estabilizar o mundo.
- Um porta-agulha fina curva (ou curvas forceps vestir) é inserido atrás da lente em direção ao aspecto posterior do globo. O porta-agulha é parcialmente fechado, e puxou para frente. A pressão é aplicada usando a pinça na superfície externa da esclera, o que empurra a lente para a frente através da incisão da córnea, deixando a parede do olho intacto. O vítreo aparece como um gel transparente e é parcialmente aderente à lente.
- O tecido vítreo-lente é então colocada em um tubo de centrifugação filtrado contendo 20 microlitros de cocktail inibidor da protease (Roche) dissolvido em PBS.
3. Evisceração retina.
- Continue para estabilizar o mundo com 0,12 forceps Colibri agarrar a incisão na córnea.
- Um porta-agulha fina curva (ou curvas forceps vestir) é colocado como muito posterior ao globo possível, perto do nervo óptico. O porta-agulha é parcialmente fechado, e puxou para frente. A pressão é aplicada usando a pinça na superfície externa da esclera, que empurra a retina para a frente através da incisão da córnea. O vítreo aparece como um gel transparente aderente à retina. A retina é visualizado como um amarelo tecido vascularizado,. Quaisquer tiras de tecido pigmentada pode ser desfeito, com uma pinça.
- O tecido da retina vítreo é então colocado no tubo de centrifugação filtrada contendo o tecido lente vítrea.
4. Filtrada centrifugação.
- O tubo de centrifugação filtrado é colocado em uma centrífuga de bancada. Giram a 14.000 x G por 12 minutos.
- Aspirar o eluente da câmara baixa, que é o vítreo. A retina permanece na câmara superior. Essas amostras podem ser utilizados para estudos de proteínas.
5. Resultados representante
As amostras vítreas foram analisadas por SDS-PAGE (Figura 2). As amostras também foram utilizados para um ensaio de atividade enzimática (Figura 3).
Figura 1. Rato diagrama de olho. Transversal esquemático do olho humano e do rato mostra o volume vítreo relativa menor no olho do rato, devido à sua maior lente.
Figura 2. Unidimensional SDS-PAGE do vítreo mouse e retina. Perfis de proteínas do vítreo mouse, 13,6 mg / mL (pista 1) e retina, 11,35 mg / mL (faixa 2). Eletroforese em gel foi realizada em 150 kV por 45 minutos, corados com Flamingo gel fluorescente mancha e visualizado através de um sistema de VersaDoc Imaging (BioRad, Hercules, CA).
Figura 3. Superóxido dismutase atividade enzimática (SOD) no rato e vítreo humano. Medição da atividade SOD total (SOD atividade colorimétrico aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) foi realizada em vítreo e retina coletados por evisceração de camundongos DBA e albino. Este resultado foi comparado à atividade SOD no núcleo vítreo humano e retina humana coletados de post-mortem olhos de doadores humanos para determinar a atividade relativa. Diluído amostras de núcleo vítreo foram aspirados manualmente utilizando uma agulha 23 gauge, 11 e retina foram coletados por floração o olho e cortar o tecido de distância do complexo EPR / coróide. Embora o ensaio não faz distinção entre as isoformas da SOD, a atividade SOD vítreo é provável que refletem SOD3, uma vez que é apenas a isoforma extracelular 12 A atividade de SOD retina é susceptível de reflectir todas as isoformas da SOD três:. SOD1 intracelular, SOD2 mitocondrial, e extracelulares SOD3. 12 Porque altamente sensível ensaios enzimáticos, incluindo este ensaio SOD, a possibilidade de contaminação cruzada de proteínas é possível e requer um estudo mais aprofundado. Barras de erro representam SEM.
Discussion
Camundongos transgênicos são um importante modelo para a investigação de doenças da retina e vítreo-retinianas. 6-10 O corpo vítreo mouse, no entanto, compreende uma proporção significativamente menor do olho em relação ao vítreo humano devido ao grande lente no olho do rato. 5 Isso faz com que difícil isolar e purificar o vítreo mouse. Compreensão das mudanças proteína associada com o vítreo durante doenças como a retinopatia diabética proliferativa, relacionadas com a idade degeneração macular, uveíte e descolamento de retina vai dar dicas sobre os mecanismos pelos quais o progresso. Este protocolo experimental visualizadas fornece um meio para obter e purificar o corpo vítreo do mouse e maximizar a produção de proteína para as análises enzimáticas e proteômica.
Disclosures
Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Associação para a Investigação e Visão em Oftalmologia declaração para o uso de animais em oftálmica e Vision Research.
Acknowledgments
O financiamento foi fornecido pelo Fight for Sight and Research para prevenir a cegueira.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal FilterUltracel YM-100 or YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
References
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