Summary
De dissectie techniek illustreert ingewanden te ontdoen van het glasvocht, netvlies, en de lens van de muis oog, scheiding door centrifugeren, en karakterisering met eiwit assays.
Abstract
Terwijl de muis netvlies heeft zich ontpopt als een belangrijk genetisch model voor erfelijke retinale ziekten, de muis glasvocht moet nog worden onderzocht. Het glasvocht is een zeer waterige extracellulaire matrix bovenliggende het netvlies waar het intra-oculaire evenals extraoculaire eiwitten accumuleren tijdens ziekte. 1-3 Abnormale interacties tussen glasvocht en het netvlies liggen ten grondslag aan een aantal ziekten, zoals netvliesloslating, proliferatieve diabetische retinopathie, uveitis, en proliferatieve vitreoretinopathie 1. , 4 De relatieve muis glasvocht volume is aanzienlijk kleiner dan het menselijk glasvocht (figuur 1), aangezien de muis lens neemt bijna 75% van zijn oog. 5 Dit is biochemisch onderzoek van de muis glasvocht gemaakt uitdagend. In deze video artikel zullen we een techniek te ontleden en de muis glasvocht isoleren van het netvlies, waardoor het gebruik van transgene muis modellen om de rol van deze extracellulaire matrix duidelijker te definiëren in de ontwikkeling van vitreoretinale ziekten.
Protocol
1. Anterieure segment dissectie.
- Sclerale weefsel achter de limbus is gevat met een 0,22 pincet en de wereld (oogbol) is gestabiliseerd.
- Een microchirurgische mes wordt gebruikt om een lineaire incisie in het hoornvlies van de limbus tot limbus te maken.
- Een 0,12 Colibri pincet wordt vervolgens gebruikt om het hoornvlies te begrijpen aan de incisie.
- De voorste oogkamer vloeistof wordt vervolgens geabsorbeerd met een Weck-Cel chirurgische speer.
2. Lens verwijderen van de ingewanden.
- Een 0,12 Colibri pincet vast te pakken van het hoornvlies wordt gebruikt om de wereld te stabiliseren.
- Een fijne gebogen naald houder (of gebogen dressing pincet) wordt ingevoegd achter de lens in de richting van het achterste deel van de wereld. De naaldhouder is gedeeltelijk gesloten, en trok naar voren. Druk wordt uitgeoefend met behulp van de pincet op het externe oppervlak van de sclera, die de lens duwt vooruit door het hoornvlies incisie terwijl de ogen muur intact. Het glasvocht verschijnt als een doorschijnende gel en is gedeeltelijk aanhanger op de lens.
- De lens-vitreous weefsel wordt vervolgens geplaatst in een gefilterde centrifugebuis met 20 microliter van protease-remmer cocktail (Roche) opgelost in PBS.
3. Retina verwijderen van de ingewanden.
- Blijf de hele wereld te stabiliseren met 0,12 Colibri tang vast te pakken het hoornvlies incisie.
- Een fijne gebogen naald houder (of gebogen dressing pincet) is geplaatst zo ver posterior aan de hele wereld als mogelijk in de nabijheid van de oogzenuw. De naaldhouder is gedeeltelijk gesloten, en trok naar voren. Druk wordt uitgeoefend met behulp van de pincet op het externe oppervlak van de sclera, die het netvlies duwt vooruit door de cornea incisie. Het glasvocht verschijnt als een doorschijnende gel aanhanger van het netvlies. Het netvlies is gevisualiseerd als een gele, gevasculariseerde weefsel. Elke strips van gepigmenteerde weefsel kan worden afgepeld met een pincet.
- Het netvlies-vitreous weefsel wordt vervolgens geplaatst in de gefilterde centrifugebuis met de lens-vitreous weefsel.
4. Gefilterd centrifugeren.
- De gefilterde centrifuge buis wordt geplaatst in een benchtop centrifuge. Spin bij 14.000 x G voor 12 minuten.
- Zuig het eluens van de Tweede Kamer, dat is het glasvocht. Het netvlies blijft in de bovenste kamer. Deze monsters kunnen worden gebruikt voor eiwit studies.
5. Representatieve resultaten
Glasvocht monsters werden geanalyseerd door SDS-PAGE (figuur 2). Monsters werden ook gebruikt voor een enzymatische activiteit assay (figuur 3).
Figuur 1. Mouse eye diagram. Schematische dwarsdoorsnede van het menselijk oog en de muis toont de relatieve kleinere glasvocht volume in de muis oog te wijten aan de grotere lens.
Figuur 2. Een-dimensionale SDS-PAGE van de muis glasvocht en het netvlies. Eiwitprofielen van muis glasvocht, 13,6 mg / ml (baan 1), en het netvlies, 11,35 mg / ml (laan 2). Gelelektroforese werd uitgevoerd bij 150 kV gedurende 45 minuten, gekleurd met Flamingo tl-gel vlek en gevisualiseerd met behulp van een VersaDoc Imaging systeem (BioRad, Hercules, CA).
Figuur 3. Superoxide dismutase (SOD) enzymactiviteit in de muis en menselijke glasvocht. Meting van de totale SOD activiteit (SOD activiteit colorimetrische aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) werd uitgevoerd op glasvocht en het netvlies verzameld door verwijderen van de ingewanden van de DBA en albino muizen. Dit werd vergeleken met SOD-activiteit in de menselijke glasvocht kern en de menselijke netvlies afkomstig van post-mortem menselijk donor ogen om de relatieve activiteit te bepalen. Onverdunde glasvocht bodemmonsters werden handmatig weggezogen met behulp van een 23-gauge naald, 11 en het netvlies werd verzameld door bloeien het oog en het snijden van het weefsel weg van de RPE / choroidea complex. Hoewel de test maakt geen onderscheid tussen SOD isovormen, het glasvocht SOD activiteit is waarschijnlijk SOD3 weer te geven, want het is de enige extracellulaire isoform 12 Het netvlies SOD-activiteit is waarschijnlijk alle drie de SOD isovormen weer te geven:. Intracellulaire SOD1, mitochondriale SOD2, en extracellulaire SOD3. 12 voor zeer gevoelige enzymatische assays, waaronder deze SOD assay, de mogelijkheid van cross-contaminatie van eiwitten is mogelijk en is verder onderzoek nodig. Foutbalken vertegenwoordigen SEM.
Discussion
Transgene muizen zijn een belangrijk model voor het onderzoeken van het netvlies en vitreoretinale ziekte. 6-10 De muis glasachtig lichaam, echter, bestaat een aanzienlijk kleiner deel van het oog in vergelijking met de menselijke glasvocht door de grote lens in de muis oog. 5 Dit maakt het het moeilijk te isoleren en te zuiveren van de muis glasvocht. Inzicht in de eiwit veranderingen die gepaard gaan met het glasvocht tijdens ziekten zoals proliferatieve diabetische retinopathie, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, uveïtis, en netvliesloslating geven inzicht in de mechanismen waarmee zij de voortgang. Deze zichtbaar experimentele protocol biedt een middel te verkrijgen en te zuiveren van de muis glasachtig lichaam, terwijl het maximaliseren van het eiwit opbrengst voor enzymatische en proteomics analyses.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Association for Research and Vision in Oogheelkunde verklaring voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en Vision Research.
Acknowledgments
De financiering werd verstrekt door Fight for Sight en Onderzoek om blindheid te voorkomen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal FilterUltracel YM-100 or YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &, Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. 161-195 (2002).
- Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene. Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).
- Kaarniranta, K. A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1. Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).
- Marneros, A. G. &, Olsen, B. R. Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).
- Martin, A. C. Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Ciechanowski, K. Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes. Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).
