Summary
विच्छेदन तकनीक शीशे, रेटिना, और माउस आँख से लेंस, centrifugation द्वारा जुदाई, और प्रोटीन assays के साथ लक्षण वर्णन के अंतड़ी निकालना दिखाता है.
Abstract
जबकि माउस रेटिना विरासत में मिला रेटिनल रोग के लिए एक महत्वपूर्ण आनुवंशिक मॉडल के रूप में उभरा है, माउस कांच का पता लगाया जाना रहता है. कांच का एक अत्यधिक जलीय कोशिकी मैट्रिक्स रेटिना जहां के रूप में के रूप में अच्छी तरह से intraocular extraocular प्रोटीन बीमारी के दौरान जमा overlying है शीशे और रेटिना के बीच 1-3 असामान्य बातचीत रेटिना टुकड़ी, proliferative मधुमेह रेटिनोपैथी, uveitis के, और proliferative vitreoretinopathy जैसे कई रोगों आबाद. 1 4 सापेक्षिक माउस शीशे की मात्रा काफी मानव शीशे (चित्रा 1) से छोटा है, माउस लेंस के बाद से अपनी आंख के लगभग 75% occupies 5 यह माउस शीशे के जैव रासायनिक अध्ययन किया गया है चुनौतीपूर्ण. इस वीडियो लेख में, हम काटना और रेटिना, जो ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग vitreoretinal रोगों के विकास में और अधिक स्पष्ट रूप से इस बाह्य मैट्रिक्स की भूमिका को परिभाषित करने की अनुमति देगा से माउस शीशे अलग तकनीक मौजूद है.
Protocol
1. पूर्वकाल खंड विच्छेदन.
- किनारी के लिए पीछे scleral ऊतक 0.22 forcep और दुनिया (नज़र गेंद) स्थिर के साथ समझा है.
- एक microsurgical ब्लेड किनारी से किनारी कॉर्निया में एक रेखीय चीरा बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- एक 0.12 Colibri forcep तो चीरा कॉर्निया समझ करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- पूर्वकाल कक्ष द्रव तो एक Weck Cel शल्य चिकित्सा भाला के साथ लीन है.
2. लेंस अंतड़ी निकालना.
- एक 0.12 Colibri कॉर्निया लोभी forcep के लिए दुनिया को स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- एक ठीक घुमावदार सुई धारक (या घुमावदार ड्रेसिंग संदंश) दुनिया के पीछे पहलू की ओर लेंस के पीछे डाला जाता है. सुई धारक आंशिक रूप से बंद कर दिया है और आगे खींच लिया. दबाव श्वेतपटल, जो लेंस corneal चीरा के माध्यम से आगे जबकि आँख दीवार बरकरार जा धक्का की बाहरी सतह पर संदंश का उपयोग करने के लिए लागू किया जाता है. कांच का एक पारदर्शी जेल के रूप में प्रकट होता है और आंशिक रूप से लेंस के लिए पक्षपाती है.
- ऊतक लेंस - कांच का तो एक फ़िल्टर्ड centrifugation protease अवरोध करनेवाला (Roche) कॉकटेल पीबीएस में भंग के 20 microliters युक्त ट्यूब में रखा गया है.
3. रेटिना अंतड़ी निकालना.
- 0.12 Colibri चीरा कॉर्निया लोभी संदंश के साथ दुनिया को स्थिर करने के लिए जारी रखें.
- एक ठीक घुमावदार सुई धारक (या घुमावदार ड्रेसिंग संदंश) जहाँ तक संभव हो के रूप में दुनिया के लिए पीछे के रूप में रखा गया है, ऑप्टिक तंत्रिका के पास. सुई धारक आंशिक रूप से बंद कर दिया है और आगे खींच लिया. दबाव श्वेतपटल, जो corneal चीरा के माध्यम से रेटिना आगे धक्का की बाहरी सतह पर संदंश का उपयोग करने के लिए लागू किया जाता है. कांच का एक पारदर्शी रेटिना को अनुयायी जेल के रूप में प्रकट होता है. रेटिना एक पीला, vascularized ऊतक के रूप में कल्पना की है. Pigmented ऊतक के किसी भी स्ट्रिप्स संदंश के साथ खुली दूर हो सकते हैं.
- ऊतक रेटिना - शीशे तब फ़िल्टर अपकेंद्रित्र लेंस शीशे ऊतक युक्त ट्यूब में रखा गया है.
4. Centrifugation छनित.
- फ़िल्टर अपकेंद्रित्र ट्यूब एक benchtop अपकेंद्रित्र में रखा गया है. 12 मिनट के लिए 14,000 x जी पर स्पिन.
- निचले सदन, जो शीशे का है से eluant Aspirate. रेटिना के ऊपरी सदन में रहता है. इन नमूनों प्रोटीन के अध्ययन के लिए उपयोग किया जा सकता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
शीशे के नमूने एसडीएस PAGE (चित्रा 2) द्वारा विश्लेषण किया गया. नमूने एक enzymatic गतिविधि परख (चित्रा 3) के लिए भी इस्तेमाल किया गया.
चित्रा 1 माउस आंख आरेख. मानव और चूहे आँख के क्रॉस अनुभागीय योजनाबद्ध रिश्तेदार छोटे माउस अपने बड़े लेंस कारण आंखों में शीशे की मात्रा से पता चलता है.
चित्रा 2. एक आयामी एसडीएस PAGE माउस शीशे और रेटिना के. शीशे माउस के प्रोटीन प्रोफाइल, 13.6 मिलीग्राम / एमएल (1 लेन), और रेटिना, 11.35 मिलीग्राम / एमएल (2 लेन). जेल वैद्युतकणसंचलन 45 मिनट के लिए 150 केवी पर प्रदर्शन किया था, फ्लेमिंगो फ्लोरोसेंट जेल दाग के साथ दाग और VersaDoc इमेजिंग प्रणाली (BioRad, हरक्यूलिस, सीए) का उपयोग करते हुए कल्पना.
चित्रा 3. Superoxide dismutase (वतन) माउस और मानव शीशे में एंजाइम गतिविधि. कुल वतन गतिविधि के मापन (वतन गतिविधि वर्णमिति aasay किट, AB65354 # Abcam, इंक, कैम्ब्रिज, एमए) शीशे और DBA और सूरजमुखी मनुष्य चूहों से अंतड़ी निकालना द्वारा एकत्र रेटिना पर प्रदर्शन किया गया था. यह मानव कांच कोर और मानव पोस्टमार्टम मानव दाता आँखों से एकत्र रिश्तेदार गतिविधि निर्धारित करने के लिए रेटिना में वतन गतिविधि की तुलना में किया गया था. Undiluted कांच कोर के नमूने मैन्युअल रूप से एक 23 गेज सुई, 11 और रेटिना आँख फूल और ऊतक जटिल / RPE रंजित से दूर काटने के द्वारा एकत्र किया गया था का उपयोग कर से aspirated थे. हालांकि परख वतन isoforms के बीच भेद नहीं करता, कांच वतन गतिविधि SOD3 प्रतिबिंबित की संभावना है, क्योंकि यह केवल बाह्य isoform 12 रेटिना वतन गतिविधि के लिए सभी तीन वतन isoforms प्रतिबिंबित की संभावना है. Intracellular SOD1, mitochondrial SOD2, और कोशिकी SOD3. बेहद संवेदनशील इस वतन परख सहित enzymatic assays, 12, प्रोटीन के पार संदूषण की संभावना संभव है और आगे के अध्ययन के की आवश्यकता है. त्रुटि सलाखों SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं.
Discussion
ट्रांसजेनिक चूहों में रेटिना और vitreoretinal रोग की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल हैं. माउस 6-10 कांच का शरीर, तथापि, मानव माउस आंख में बड़े लेंस की वजह से शीशे का की तुलना में आँख के एक काफी छोटे अनुपात शामिल हैं 5. इससे यह मुश्किल और अलग करने के लिए और माउस कांच का शुद्ध. प्रोटीन proliferative मधुमेह रेटिनोपैथी, आयु से संबंधित धब्बेदार अध: पतन, uveitis के, और रेटिना टुकड़ी जैसे रोगों के दौरान शीशे के साथ जुड़े परिवर्तन को समझना तंत्र में अंतर्दृष्टि दे देंगे जिसके द्वारा वे प्रगति. यह कल्पना की प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्राप्त करने के लिए और माउस कांच का शरीर को शुद्ध करने का साधन प्रदान करता है, जबकि enzymatic और प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्रोटीन उपज को अधिकतम.
Disclosures
जानवरों पर प्रयोग ऑप्थाल्मिक और विजन रिसर्च में पशु के उपयोग के लिए नेत्र विज्ञान बयान में अनुसंधान और विजन के लिए एसोसिएशन के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
अनुदान दृष्टि और अंधापन रोकने के अनुसंधान के लिए लड़ो द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal FilterUltracel YM-100 or YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
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