Summary
La tecnica di dissezione illustra l'eviscerazione del vitreo, retina, e la lente dall'occhio del mouse, la separazione mediante centrifugazione, e la caratterizzazione con i dosaggi della proteina.
Abstract
Mentre la retina del mouse è emersa come un importante modello genetico per le malattie ereditarie della retina, il vitreo mouse rimane da esplorare. Il vitreo è una matrice extracellulare altamente acquosa sovrastante la retina dove intraoculare così come le proteine extraoculari si accumulano durante la malattia. 1-3 interazioni anomale tra vitreo e la retina alla base di numerose malattie come il distacco di retina, retinopatia diabetica proliferativa, uveite, e proliferazione vitreoretinica 1. , 4 Il volume relativo vitreo del mouse è significativamente più piccolo del vitreo umano (Figura 1), dal momento che l'obiettivo del mouse occupa quasi il 75% del suo occhio. 5 Questo ha fatto studi biochimici del vitreo del mouse impegnativo. In questo articolo video, vi presentiamo una tecnica per sezionare ed isolare il vitreo del mouse dalla retina, che permetterà l'uso di modelli di topi transgenici per definire più chiaramente il ruolo di questa matrice extracellulare nello sviluppo di patologie vitreo-retinica.
Protocol
1. Dissezione del segmento anteriore.
- Tessuto sclerale posteriormente al limbus è afferrato con una pinza 0,22 e il globo (bulbo oculare) è stabilizzata.
- Una lama microchirurgico è usato per fare un'incisione lineare nella cornea da limbus a limbus.
- Un Colibri 0,12 pinza viene quindi utilizzata per afferrare la cornea alla incisione.
- Il fluido della camera anteriore viene poi assorbito con un Weck-Cel lancia chirurgico.
2. Lens eviscerazione.
- Un Colibri 0,12 pinza afferrare la cornea viene utilizzato per stabilizzare il mondo.
- Un supporto con ago sottile curva (o curva Pinza medicazione) viene inserito dietro l'obiettivo verso la parte posteriore del globo. Il titolare ago è parzialmente chiusa, e tirò avanti. La pressione viene applicata utilizzando il forcipe sulla superficie esterna della sclera, che spinge in avanti la lente attraverso l'incisione della cornea lasciando intatta la parete dell'occhio. Il vitreo si presenta come un gel trasparente ed è parzialmente aderente alla lente.
- L'obiettivo vitreo-tessuto viene poi inserito in un tubo di centrifugazione filtrato contenente 20 microlitri di cocktail di inibitori della proteasi (Roche) disciolto in PBS.
3. Retina eviscerazione.
- Continuare a stabilizzare il mondo con 0,12 pinze Colibri cogliere l'incisione della cornea.
- Un supporto con ago sottile curva (o curva Pinza medicazione) è posta per quanto possibile posteriore al mondo il più possibile, vicino al nervo ottico. Il titolare ago è parzialmente chiusa, e tirò avanti. La pressione viene applicata utilizzando il forcipe sulla superficie esterna della sclera, che spinge in avanti la retina attraverso l'incisione della cornea. Il vitreo si presenta come un gel trasparente aderente alla retina. La retina è visualizzato come un giallo, il tessuto vascolarizzato. Le strisce di tessuto pigmentato può essere staccato con una pinza.
- La retina, vitreo tessuto viene poi inserito nel tubo da centrifuga filtrato contenente l'obiettivo vitreo-tessuto.
4. Filtrata centrifugazione.
- Il tubo di centrifuga filtrato viene posto in una centrifuga da banco. Girano a 14.000 g per 12 minuti.
- Aspirare il eluente dalla camera inferiore, che è il vitreo. La retina rimane nella sala al piano superiore. Questi campioni possono essere utilizzati per gli studi di proteine.
5. Rappresentante Risultati
Vitreo campioni sono stati analizzati mediante SDS-PAGE (Figura 2). I campioni sono stati utilizzati anche per un saggio di attività enzimatica (Figura 3).
Figura 1. Diagramma a occhio Mouse. Trasversale schematica dell'occhio umano e del mouse mostra il volume relativo vitreo più piccoli nell'occhio del mouse grazie al suo obiettivo più grande.
Figura 2. Monodimensionale SDS-PAGE di vitreo del mouse e della retina. Profili proteici di vitreo topo, 13,6 mg / ml (corsia 1), e della retina, 11,35 mg / ml (corsia 2). Elettroforesi su gel è stata effettuata a 150 kV per 45 minuti, macchiata di macchia gel Flamingo fluorescenti ed è visualizzato mediante un sistema di VersaDoc Imaging (BioRad, Hercules, CA).
Figura 3. Superossido dismutasi (SOD) attività enzimatica nel topo e nel vitreo umano. Misurazione dell'attività SOD totale (SOD attività colorimetrico aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) è stata eseguita su vitreo e retina raccolte eviscerazione dai topi DBA e albino. Questo è stato confrontato con attività SOD nel cuore umano vitreo e retina umana raccolti da post-mortem occhi donatore umano per determinare l'attività relativa. Non diluito carotaggi vitreo sono stati aspirati manualmente utilizzando una 23-gauge, 11 e retina è stato raccolto dalla fioritura l'occhio e il taglio del tessuto dal RPE / coroide complesso. Anche se il test non fa distinzione tra isoforme SOD, l'attività SOD vitreo è probabile che SOD3 riflettere, dal momento che è l'unica isoforma extracellulare 12 L'attività SOD retina riflette probabilmente tutte le isoforme SOD tre:. Intracellulare SOD1, mitocondriale SOD2, ed extracellulare SOD3. 12 Per saggi enzimatici altamente sensibili, tra cui questo saggio SOD, la possibilità di contaminazione incrociata di proteine è possibile e richiede ulteriori studi. Barre di errore rappresentano SEM.
Discussion
Topi transgenici sono un importante modello per lo studio delle malattie della retina e vitreo-retinica. 6-10 Il corpo vitreo del mouse, invece, comprende una proporzione significativamente più piccola dell'occhio rispetto al corpo vitreo umano a causa della grande lente nell'occhio del mouse. 5 Questo rende difficile isolare e purificare il corpo vitreo del mouse. Comprendere i cambiamenti delle proteine associate al vitreo in corso di malattie come la retinopatia diabetica proliferativa, età degenerazione maculare, uveite, e distacco della retina darà comprensione dei meccanismi con cui si progresso. Questo protocollo visualizzati sperimentale fornisce un mezzo per ottenere e purificare il corpo vitreo del mouse, massimizzando la resa di proteine enzimatiche e di analisi proteomica.
Disclosures
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con l'Associazione per la Ricerca e della visione nella dichiarazione Oftalmologia per l'uso degli animali nel oftalmica e di ricerca Vision.
Acknowledgments
Il finanziamento è stato fornito da Lotta per la vista e la ricerca per prevenire la cecità.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal FilterUltracel YM-100 or YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
References
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