Summary
Рассечение техника иллюстрирует потрошения стекловидного тела, сетчатки и объектив от мыши глаз, разделение центрифугированием, и характеристика с белком анализов.
Abstract
В то время как мыши сетчатки стала важной генетической модели унаследовали заболевания сетчатки, стекловидного мыши еще предстоит изучить. Стекловидного является высоко водный внеклеточного матрикса вышележащих сетчатки, где внутриглазное а также экстраокулярных белки накапливаются во время болезни. 1-3 Аномальные взаимодействия между стекловидного тела и сетчатки лежат в основе ряда заболеваний, таких как отслойка сетчатки, пролиферативная диабетическая ретинопатия, увеит, и пролиферативной витреоретинопатия 1. , 4 относительного объема стекловидного мыши существенно меньше, чем человеческие стекловидное (рис. 1), поскольку мышь объектив занимает почти 75% ее глаза. 5 Это сделало биохимических исследований мыши стекловидного сложной задачей. В этом видео статьи, мы представляем технику препарировать и изолировать мыши стекловидного от сетчатки, которая позволит использовать трансгенных моделей мыши, чтобы более четко определить роль этого внеклеточного матрикса в развитии витреоретинальной заболеваний.
Protocol
1. Передняя рассечение сегмента.
- Склеры ткани кзади от лимба схватывается с 0,22 forcep и миру (глазного яблока) стабилизируется.
- Микрохирургические лезвия используется, чтобы сделать линейный разрез в роговице от лимба до лимба.
- 0,12 Colibri forcep затем используется для понимания роговицы на разрез.
- Жидкости передней камеры затем поглощается с Weck-Cel хирургических копьем.
2. Объективы потрошения.
- 0,12 Colibri forcep схватив роговицы используется для стабилизации земного шара.
- Тонкая изогнутая держатель иглы (или изогнутые корнцанг) вставляется позади объектива на задней поверхности земного шара. Иглодержателя частично закрыты, и потянул вперед. Давление применяется с использованием щипцов на внешней поверхности склеры, которая толкает вперед через объектив роговицы разрез, оставляя глаза стены нетронутыми. Стекловидного выглядит как полупрозрачный гель и частично приверженцем линзы.
- Линз стекловидного ткани затем помещаются в фильтруются центрифугирования пробирку, содержащую 20 мкл ингибитора протеазы коктейль (Roche), растворенного в PBS.
3. Сетчатка потрошения.
- Продолжить для стабилизации земного шара с 0,12 щипцы Colibri схватив роговицы разрез.
- Тонкая изогнутая держатель иглы (или изогнутые корнцанг) помещается насколько кзади от мира, как возможно, недалеко от зрительного нерва. Иглодержателя частично закрыты, и потянул вперед. Давление применяется с использованием щипцов на внешней поверхности склеры, которая толкает вперед через сетчатку роговицы разрез. Стекловидного выглядит как полупрозрачный гель приверженцем сетчатки. Сетчатка визуализируется в виде желтой, ткани васкуляризированной. Любой полосы пигментированные ткани могут быть очищены от щипцами.
- Сетчатки стекловидного ткани помещают в центрифугу фильтром трубку с линзой-стекловидного ткани.
4. Фильтрованный центрифугирования.
- Фильтруется центрифужную пробирку помещают в центрифугу настольный. Спиновые при 14000 х G в течение 12 минут.
- Аспирируйте элюента от нижней палаты, который является стекловидного тела. Сетчатки остается в верхней палате. Эти образцы могут быть использованы для исследования белков.
5. Представитель Результаты
Стекловидное пробы анализировались SDS-PAGE (рис. 2). Образцы были также использованы для анализа ферментативной активности (рис. 3).
Рисунок 1. Мышь глаз диаграмме. Поперечные схема человека и мыши глаз показывает относительную меньше объема стекловидного мыши глаз из-за его больших линз.
Рисунок 2. Одномерные SDS-PAGE стекловидного тела и сетчатки мышей. Белки профили мыши стекловидное, 13,6 мг / мл (дорожка 1) и сетчатки, 11,35 мг / мл (дорожка 2). Гель-электрофорез проводили при 150 кВ в течение 45 минут, окрашивали Фламинго флуоресцентный гель пятна и визуализируется с помощью системы VersaDoc Imaging (BioRad, Геркулес, Калифорния).
Рисунок 3. Супероксиддисмутазы (СОД), активность фермента у мышей и человека стекловидного тела. Измерение общей активности СОД (СОД активности колориметрических aasay комплект, # AB65354, Abcam, Inc, Кембридж, Массачусетс) был выполнен на стекловидное тело и сетчатку собранные потрошения от администраторов баз данных и белых мышей. Это было по сравнению с активность СОД у человека стекловидное ядро и сетчатке глаза человека собраны из посмертных доноров человеческих глаз, чтобы определить относительную активность. Неразведенный стекловидного кернов были вручную атмосферный использованием 23-иглы, 11 и сетчатки была собрана цветущие глаза и резки ткани от НПП / сосудистого комплекса. Хотя анализ не делает различия между СОД изоформ, стекловидное активности SOD, вероятно, отражает SOD3, так как это только внеклеточной изоформы 12 активности сетчатки SOD, вероятно, отражает все три изоформы СОД. Внутриклеточных SOD1, митохондриальная SOD2, и внеклеточной SOD3 12. Для высокочувствительного ферментативные анализы, в том числе это СОД анализ, возможности перекрестного загрязнения белков можно и требует дальнейшего изучения. Планки погрешностей представляют SEM.
Discussion
Трансгенные мыши являются важной моделью для исследования сетчатки и витреоретинальной болезни. 6-10 тела мыши стекловидного тела, однако, включает в себя значительно меньшую долю глаза по сравнению с человеческой стекловидного из-за большого линзы в глаз мыши 5. Это делает его трудно выделить и очистить мышь стекловидного тела. Понимание белка изменения, связанные с стекловидного во время болезни, такие как пролиферативная диабетическая ретинопатия, возрастной макулярной дегенерации, увеит, отслойка сетчатки и даст понимание механизмов, посредством которых они прогрессируют. Это визуализируется экспериментальный протокол предоставляет возможность получить и очистить тело мыши стекловидное тело, при максимальном выход белка для ферментативных и протеомных анализов.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с Ассоциацией по исследованиям и видение в офтальмологии и убытках за использование животных в офтальмологической и Vision Research.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено Борьба за зрение и исследований в области профилактики слепоты.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal FilterUltracel YM-100 or YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &, Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. 161-195 (2002).
- Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene. Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).
- Kaarniranta, K. A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1. Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).
- Marneros, A. G. &, Olsen, B. R. Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).
- Martin, A. C. Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Ciechanowski, K. Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes. Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).
