Summary
这整个坐骑
Abstract
整装原位杂交，是一个非常翔实的办法确定胚胎中的基因表达模式。 原位杂交程序冗长，技术上与多个重要步骤，集体作出贡献的最终结果的质量要求，该协议详细描述了优化探针标记和性能的几个关键质量控制步骤。总的来说，我们的协议提供了详细的说明必要的关键步骤，可重复获得高质量的结果。首先，我们描述了一代digoxygenin（DIG）标记的RNA探针通过在体外经PCR产生的DNA模板转录。我们描述了三个关键的质量控制检测，以确定的数量，完整性和辛标记探针的具体活动。这些步骤是重要的生成足够的灵敏度探测器检测内源性的mRNA在整个小鼠胚胎。此外，我们描述的固定和储存E8.5 - E11.5日龄小鼠胚胎原位杂交的方法。然后，我们描述了详细的方法有限蛋白酶K消化杂交条件的细节，杂交后洗涤和核糖核酸酶处理，除去非特异性探针杂交的水化胚胎。 AP -共轭抗体用于可视化探针，并揭示了内源性转录的表达模式。代表实验成功和典型的不理想的实验结果显示。
Protocol
1。通过体外转录的Riboprobe代
- 准备在体外转录模板的PCR产物 。
- 噬菌体在其5'端转录启动子序列设计PCR引物。
注：启动子序列的意义链的PCR引物5'端，将抄录感探头，并添加到启动子序列的反义PCR引物5'端，将合成的反义探针1-3。我们并没有发现任何差异之间的模板，其中包含只有核心启动子序列与模板包含核心启动子加上额外的5'序列的转录效率。此方法已被用于与T3，T7和SP6噬菌体的推动者。
应避免基因家族成员之间或高度重复序列是高度保守序列，因为它们可以导致非特异性的杂交，从而增加背景染色。高GC含量的探头将有限的地高辛rUTP掺入和DNA模板序列的T残基的运行，将限制DIG - UTP掺入由于地高辛分子之间的空间位阻干扰。探针的长度可以从300bp范围为1KB。但只要满足上述条件的，通常较长的探头有更高的具体活动。 - PCR模板可以是质粒的克隆，基因组克隆或基因组DNA。通常情况下，我们购买全长EST 克隆（如自ATCC或Open Biosystems公司 ）使用PCR模板。使用标准的PCR程序产生含有启动子序列的PCR产物扩增模板DNA。为了使足够的探针模板，支持多种探针合成反应中，我们通常会成立8 ×50μLPCR的。为下一步的反应是汇集几大体积的PCR或更小的反应（如我们使用的50μL反应），一般都足以产生足够的模板数探针合成反应。
- 为了消除污染的蛋白质，尤其是核糖核酸酶质粒制剂的痕迹，在55 ° C消化至少30分钟，每个PCR反应加入1μl20mg/ml蛋白酶K100μL。此蛋白酶K消化后用的所有试剂和其他物品应无RNAase的污染，并专门为RNA的工作专用。
- 在蛋白酶K消化，运行上的一种凝胶体检查完整的PCR产物的PCR反应的样本。我们使用的丙烯酰胺迷你凝胶解决较小的PCR产物（小于600-700 bp的）和琼脂糖凝胶电泳，以解决更大的PCR产物（600-700 bp）的质量控制分析。如果你看到在凝胶上的多个频段，我们建议优化PCR反应，让你获得正确大小的一个单一的PCR产品。
- 彻底提取的蛋白酶K消化等体积苯酚/氯仿（1:1）的混合物，由同一个等体积的氯仿提取PCR反应。在每一步的混合涡旋管至少30秒。在化学通风柜必须执行这些步骤。
- 加入0.1体积3M醋酸钠和2卷100％的乙醇沉淀纯化的PCR产物。在-20℃放置至少30分钟。
- 13000在离心转速旋转5分钟，去除上清液，并用70％乙醇。允许DNA沉淀完全干燥。
- 悬浮的DNA在合适的音量1xTE（如50μL）。测量DNA的浓度，使用荧光。
- 确定每个PCR模板的准备使用相对应的对噬菌体的启动子序列或探头内的内部序列的引物的核苷酸序列。这是一个关键的质量控制步骤，以确保探针模板的正确的顺序是。
- DNA是准备作为模板，在体外转录。 DNA模板保存在4 ° C。
- 噬菌体在其5'端转录启动子序列设计PCR引物。
- 使用的PCR产物为模板，在体外转录。
- 设置在终体积为50μLRNA转录反应。转录反应包括模板DNA，10X转录缓冲液5μL（100MM数码地面电视），加入10μl2.5MM挖NTP组合，3μl（50〜90单位）的RNA聚合酶，加 入1μlα- 32 P的 CTP（高达500 - 1000吴至6月龄）和量的其余部分是由加入酸二乙酯处理过的水。通常的2.5mm挖NTP混合作为一个40μl，加入10μl10MM，10MM的GTP加入10μl加入10μl10mm的CTP三磷酸腺苷，6.5μl10MM UTP，3.5μl10MM高辛- 11双绞线股票。在组装转录反应，可以肯定，所有的反应组分（酶的除外）加热到室温。 DNA和水混合，然后加入反应缓冲液，混合，然后添加其他组件否则转录缓冲液中的亚精胺沉淀DNA。在推荐使用的RNA聚合酶温度下孵育2小时。
注：α- 32 P的反应，让你纳入到RNA探针的核苷酸池的比例来确定。 这是一个反应效率的重要举措 。 都遵循以下步骤处理32页的程序
测量RNA的合成探针量的另一种方法是使用体积小分光光度计 。 这就避免了使用32个P标签（见1.3.1步骤笔记） - 孵化期间的最后几分钟，准备快速离心柱（罗氏）根据制造商的指示。
- 孵育后，加入加入1μl核糖核酸免费DNA酶I和孵化，在37 ° C为10分钟。
- 反应的稀释缓冲液（PH7.5三20MM，1％SDS，EDTA的20MM，100MM氯化钠（RNase的自由，使一个50毫升股票并在室温下储存））50μL稀释至100μL。总开始计数计数的闪烁和凝胶电泳分析，加入1μl（通常分为4μl的1X TE）。
- 申请表中的顶尖的临床离心4分钟到柱床和旋转中心在1100 X克反应的休息。分拆后的RNA探针是在收集管。
- 2卷100％的乙醇添加到洗脱反应。拌匀，并保持在冰上为5min（或在-20 ° C或30分钟）。
- 在最高转速离心5分钟沉淀RNA探针旋转管。
- 完全删除吸取上清液，让沉淀空气干燥。不要让沉淀过干，因为这将是非常难溶于。
- 溶于50μLRNA探针- 100μL1xTE或DEPC - H 2 O确定％纳入变性丙烯酰胺凝胶分析，以1μL的样品。调整探针浓度为100 ng /μL的估计产量。
- 已通过所有三个质量控制的探头可以储存在-20 ° C为6至12个月 。 我们通常在12个月内用尽探头股票。这是非常可能的，探头可以存储很长时间在- 20C 。
- 设置在终体积为50μLRNA转录反应。转录反应包括模板DNA，10X转录缓冲液5μL（100MM数码地面电视），加入10μl2.5MM挖NTP组合，3μl（50〜90单位）的RNA聚合酶，加 入1μlα- 32 P的 CTP（高达500 - 1000吴至6月龄）和量的其余部分是由加入酸二乙酯处理过的水。通常的2.5mm挖NTP混合作为一个40μl，加入10μl10MM，10MM的GTP加入10μl加入10μl10mm的CTP三磷酸腺苷，6.5μl10MM UTP，3.5μl10MM高辛- 11双绞线股票。在组装转录反应，可以肯定，所有的反应组分（酶的除外）加热到室温。 DNA和水混合，然后加入反应缓冲液，混合，然后添加其他组件否则转录缓冲液中的亚精胺沉淀DNA。在推荐使用的RNA聚合酶温度下孵育2小时。
- 质量评估的riboprobe -测量探头产量。
- 要估计探头产量，划分后离心柱在反应前离心柱（在探针合成协议所采取的样本计算）的计数恢复计数。对于这种反应，100％纳入= 33微克。一个成功的反应通常给人以15-50％的产量。不应该使用少于15％的法团（<5微克收益率）的探头。
注：为测量探头产量的另一种方法是使用体积小分光光度计或荧光直接测量自旋柱层析后的RNA的量。 这种替代方法避免了使用32个P跟踪标签。我们已经使用百特大纪元微孔板分光光度计测量riboprobe浓度。分光光度计获得32个P纳入riboprobe质量估计值的比较表明，这两种方法给比较的结果，使用了类似的体积小（2μL）样品从最终探针的制备。
几乎总是一个非常低或没有收益，是由于RNase污染来自用作PCR模板质粒准备 。 一定要善待步骤1.1.3中所述的蛋白酶K质粒DNA和PCR产物。
- 要估计探头产量，划分后离心柱在反应前离心柱（在探针合成协议所采取的样本计算）的计数恢复计数。对于这种反应，100％纳入= 33微克。一个成功的反应通常给人以15-50％的产量。不应该使用少于15％的法团（<5微克收益率）的探头。
- riboprobe -测量特定活动的质量评估 。
- 要衡量程度地高辛 - 双绞线法团进行现场测试。这是一个关键的质量控制测试。
调整探针浓度为100 ng /μL。现货1μL到82毫米直径的Hybond - N +（通用电气医疗集团）或其他同等尼龙过滤器系列稀释探头（10-2 10-5） 。包括作为阴性对照的未标记的DNA样本 。 交联潮湿的过滤器立即在紫外线交联剂在125mJoules或根据您使用的是尼龙过滤器的制造商的指示 。
在培养皿在室温下的摇晃平台上执行以下步骤（1.4.2 - 1.4.6） 。您不必担心有关核糖核酸酶后，发现在过滤器上的探针稀释 - 10毫升1％阻断试剂1X的TN（罗氏）（10X的TN缓冲= 1M，1.5M的Tris PH7.5氯化钠）的过滤器座为30分钟，在室温下
- 洗1 × 15分钟在10ml 1X的TN缓冲。
- 孵育抗地高辛Fab片段在1 / 5000 1X的TN缓冲液稀释为30分钟。/ LI>
- 洗2 × 15分钟在10ml 1X的TN缓冲。
- BM紫色基板（约在盘子里5毫升需要）进行显色反应。颜色应在30分钟内从10 -4稀释当场可见。在这一点上，停止洗涤2次5分钟，每5倍的TE的显色反应。 如果信号在现场可见，对应于10 -4稀释，然后探头应该被丢弃 。
注：根据我们的经验不足，具体的活动仅仅是短探头发现 。 提高探针模板的大小（1KB），同时坚持在这个协议中指定的其他设计标准，应增加探头的具体活动。 低比活度低信号或检测不到的水平。
- 要衡量程度地高辛 - 双绞线法团进行现场测试。这是一个关键的质量控制测试。
- 测试探头通过5％的变性丙烯酰胺凝胶电泳的完整性 。
这是另一种重要的质量控制检测。这个协议假定该探测器已与32 P标记的合成反应（见第1.2.1步） 。我们使用变性丙烯酰胺凝胶提供非常高的分辨率，使我们能够很容易地检测退化或不完整的探头的。通常情况下，5％的变性丙烯酰胺minigel（7.5克尿素，1.9毫升40％的丙烯酰胺，1.9毫升2％双丙烯酰胺（或使用一个20:1丙烯酰胺：双丙烯酰胺的解决方案），1.5毫升10X MOPS胶缓冲液（0.2 M吗啉酸，pH7.0的，50mm的醋酸钠5MM EDTA）和H 2 O到终体积为15毫升）的作品很好地解决大小范围在本议定书的探头。
注：作为替代方案，简称TBE -尿素预制凝胶可以从不同的供应商购买。按照运行预制凝胶制造商的指示。- 样品和凝胶样缓冲液（Ambion公司）等体积混合，拌匀。
- 加热至95 ° C变性任何二级结构为5分钟。
- 立即在冰上冷却，然后再装载在凝胶上，以防止重新退火。
- 运行之前和之后列样品200V在一起，直到蓝色染料凝胶年底。凝胶是运行在1X MOPS凝胶缓冲。
- 裹保鲜膜的凝胶，将其暴露在X光片或磷光体成像仪屏幕上检测到放射性标记的RNA。如果不使用32个P标签是你可以与传统的荧光染料染色的凝胶检测的RNA
- 一个成功的探针合成RNA探针，作为一个尖锐的带凝胶的顶部迁移非常接近的结果。
2。小鼠胚胎的收集和储存
- 小鼠胚胎应收集在冰冷的PBST（PBS + 0.1％吐温20，（焦碳酸二乙酯（DEPC）处理）），并在解剖放在冰上。
- 胚胎处理4毫升螺丝皑皑的玻璃小瓶中。多个胚胎，可以固定在一个小瓶 。 多达10至15 E9.5或5 E10.5胚胎可以固定在一个小瓶。 E11.5胚胎由于胚胎的规模日益扩大，应hemisected用刀片在杂交前固定探头访问的援助。 3 hemisected E11.5胚胎可以被放置在一个单一的小瓶。
- 为了最大限度地提高了在这个协议的步骤的有效性，并减少破坏胚胎，胚胎固定和所有清洗与填充到较低水平的瓶颈的解决方案只是一个很小的气泡仍然使样品瓶 ，除非另有指定。对于所有的洗涤步骤小瓶就在自己身边的摇杆平台上 。
- 6小时至过夜固定在4 °彗星在4％多聚甲醛在PBST（PFA）的摇表。 样品瓶应置于水平和摇杆平台上的震撼，4 ° C 。
- 固定后，胚胎洗两次，每次5分钟PBST在冰上，然后到100％甲醇脱水逐步取代通过一系列甲醇/ PBST（PBST甲醇25％，50％甲醇PBST和75％甲醇PBST ） 在使用玻璃巴氏吸管小瓶的解决方案。 胚胎可以存储在- 20C在100％甲醇为8个 月，甚至更长的时间。
3。杂交的地高辛标记探针整个小鼠胚胎
- 穿刺的心和E10.5和年纪较大的胚胎用显微切割刀元首，而胚胎仍然是在甲醇（如果这不是在解剖）。这个简单的步骤，允许的清洗解决方案，进入大脑囊泡和心脏商会，从而大大降低背景染色。
- 补充水分在甲醇/ PBST系列甲醇浓度在每5-10分钟的连续清洗（PBST甲醇75％，50％PBST甲醇，然后25％甲醇PBST）的胚胎。两次100％PBST洗5分钟，每次清洗。
- 在4:1 PBST孵育：30％的H 2 O 2冰1小时。然后用5分钟3变化中的每个1X PBST。
- 删除最后的PBST洗涤和更换1毫升10μg/ ml的蛋白酶K在PBST 。 在蛋白酶K消化的地方，在一个垂直机架在25℃水浴管 。
注：蛋白酶K的解决方案失去活性随着时间的推移，由于自我消化。 为了确保最大的和一致的活动取得了新的蛋白酶K的解决方案必须立即在每次使用之前 。 每次使用少量作出一个1mg/ml的股票，然后稀释 。 孵育时间应确定为每批蛋白酶K粉，并为每个胚胎时代 。 例如，对于E9.5胚胎的一个很好的时间通常是10-15分钟在25 ° C，而E10.5它通常是20-30分钟在25 ° C。蛋白酶K孵育时间也应精确测量在实验过程中，允许小瓶和实验之间的有效比较。 ，温度应仔细保持在消化增加的重复性 。 小的差异为1 ° C可以改变的实验之间的消化量 。 强烈建议在孵化器或水浴，温度控制准确，蛋白酶K消化。这一步是关键，让探针穿透组织，从而产生强烈的信号。 然而，在消化，会损害胚胎，他们将在其余的步骤的过程中逐渐瓦解。 - 停止洗两次每次洗为5分钟，在室温下用2毫克/毫升新鲜的甘氨酸在PBST蛋白酶K消化 。 然后5分钟，在PBST洗两次 。
- 修正了在室温下20分钟，在4％PFA / PBST，0.2％gluteraldehyde（Polysciences）消化的胚胎。不要过度或underfix。 5分钟，在PBST清洗3次。
- 此时，胚胎应分为杂交群体。删除了PBST。加入1毫升的杂交缓冲液（50％甲酰胺（Invitrogen）的超纯水，SSC的5倍，pH值5，1％SDS，50微克/ ml肝素（Acros公司），50微克/毫升Torula RNA（Sigma公司））已加热到65 ° C（无探头）。允许胚胎定居，然后取出所有的hybrization缓冲区和1毫升的新鲜温暖无探针的杂交缓冲液取代。
- Prehybridize 1小时65 °彗星在晃动的水洗澡或在烤箱上的一个摇摆的平台（例如Boekle摇'N'烘箱，见表1 ）。 如果您在水浴中孵育小瓶确保水，但不超过，小瓶的顶部。杂交温度可提高到70 ° C.杂交温度高于65 ° C做不会影响信号强度与大多数我们测试探头或背景。胚胎成为半透明，粘，和脆弱，甲酰胺缓冲区（如杂交缓冲液）处理时要小心 。
- 更换0.4毫升杂交探针在0.25-1微克/毫升的浓度缓冲区预杂交缓冲。使用胚胎探头0.5微克/毫升约E8.5。对于年龄较大的胚胎，探头应逐步从1-0.1μg/ ml的一个良好的信号（通常为0.25〜0.5微克/毫升左右）与低背景，以确定最佳浓度。需要注意的是更大的杂交卷可能需要更大的胚胎。杂交一夜之间在65 ° C。
- 如果胚胎已超过蛋白酶K处理，它们会出现非常透明的。 他们也可能会坚持到小瓶双方，或土崩瓦解。出现这样的胚胎，这一点在协议中应该抛弃 。 进一步处理它们不会导致在解释数据。
- 我（50％甲酰胺，5倍SSC的pH值5，1％SDS）在70 ° C的加热解决方案替换杂交缓冲液洗净E8.5胚胎，E9.5和老年人为30分钟，每洗3次，每次洗30分钟，两次。
- 洗一次预热50％的溶液：50％的溶液II（0.5M氯化钠，10mm的三盐酸pH值7.5，0.1％吐温20）在70℃10分钟。
- 与解决方案二洗，每5分钟，在室温下清洗三次。
- 更换缓冲与解决方案II含RNA酶A 100微克/毫升，核糖核酸酶T1 100个单位/毫升。放置在温暖的房间37C 30分钟，每洗两次摇杆。核糖核酸酶洗是减少背景所必需的非特异性杂交的探针。
- 在解决方案三（50％甲酰胺，2X SSC PH5）洗净，在65 ° C两次洗E8.5，E9.5和老年人为30分钟，每洗3次每次30分钟。
- 1X TBST（100毫升含有12.5毫升2M三盐酸在水中的pH值7.6。8克氯化钠，0.2克氯化钾，为了使1X TBST在适当体积的水稀释10X TBS和10X TBS电视台每洗5分钟，洗3次添加吐温终浓度为20％至0.1％）
- 除非特别指定，所有清洗样品瓶填充到较低级别的解决方案小瓶的脖子。对于所有的洗涤步骤，就在自己身边奠定小瓶摇杆平台上。
4。抗体检测digoxygenin标记的探针
- 胚胎前挡在1X TBST 0.5毫升+ 10％的热量治疗羊血清。然后瓶垂直岩在室温（〜20 ° C）至少2.5小时。
- 更换新鲜的1X TBST封闭液+ 10％的血清中含有一个1:2000 - 1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛Fab片段（减去孵化与胚胎丙酮粉，见下文）。使用E9.5和老年人胚胎更高的稀释，以1:5000，以尽量减少背景。垂直摇臂孵育4℃过夜。
注：我们已经发现，培养胚胎丙酮粉的抗地高辛Fab片段减少背景染色的水平，在本议定书。 为了准备胚胎丙酮粉均质池E12.5 - 14.5小鼠胚胎中体积最小的PBS。冰冷的丙酮，混合添加4卷，并在冰上孵育30分钟 。 万XG纺纱10分钟，取出上清液 。 冰冷的丙酮清洗沉淀和旋转一次。传播颗粒磨成粉末，一张滤纸上，并让它风干。 粉末，然后可以被保存在4 ° C，多年在气密管。
减法的抗体，抗体，应预先吸收胚胎丙酮粉，以减少期间或之前预先阻断非特异性结合。孵育抗体在1 / 100的少量胚胎粉1xTBST/10％（金额并不重要）至少有1小时的血清在4℃与摇摆 。 取出粉末，由旋转的离心10分钟，在4 ° C。 减去抗体可以存储在4 ° C，至少6个月 。 - 1X TBST洗3次5分钟，然后5-6倍，在室温下放置1小时每个除去多余的抗体。如果首选，延长通宵洗4 ° C，以减少背景。隔夜冲洗可以大大减少的背景水平，从而提高了信噪比。
- 洗为20分钟，每洗两次新鲜碱性磷酸酶缓冲液（100mm的氯化钠， 氯化镁 2 50MM，100MM三，pH值9.5，0.1％吐温20。0.5mg/ml的左旋咪唑，一种内源性AP抑制剂，为E9.5和老年人胚胎）。
- 更换BM紫美联社基板预热至室温（罗氏）的最后一次洗涤。
- 允许显色反应在室温下孵育，通过解剖显微镜观看信号定期。对于延长显色反应（几个小时隔夜）的小瓶应避光。丰富的mRNA的信号应该是可见的，在15分钟内 。 当你满意的信号，或当背景开始成为一个问题的反应应停止 。 如果解决方案本身开始转暗，可以延长更换底物溶液显色反应 。
- 停止洗5分钟，每洗两次1X PBST/5mM EDTA的反应。
- 转移到4％多聚甲醛/ PBST重新修复，从几个小时到通宵。或胚胎，可存储在4％的年paraformaldehyde/1X PBST或可立即处理切片。这最后的固定步骤是长期的染色模式的长期保存的关键。
5。石蜡包埋和切片染色胚胎
- 前胚胎固定后的显色反应（步骤4.8）整个安装染色胚胎的照片时，染色所需的强度水平 。 记录在整个胚胎的表达模式之后，他们在BM紫色基板孵育过夜，以在室温下24小时，直到整个胚胎变成深蓝色。 这一步是确保染色将有足够的黑暗，在组织切片显示 。 请注意，蓝色的胚胎是由于一个非常薄的层在胚胎表面的色素沉积 。 此背景染色，将无法检测到组织内的利益后切片 。
- PBS洗3次清洗染色胚胎，以除去多余的基板沉淀并固定在4％的煤灰过夜4 ° C。
- 洗净用PBS漂洗3次，然后脱水到100％的甲醇（如在2.4中所述）的胚胎。
- 更换最后用二甲苯甲醇。 2分钟，每次清洗清洗，直到胚胎成为明确二甲苯2至3倍。不要过分二甲苯清洗，因为它将使组织非常脆弱，它是嵌入很难恢复完好的部分后。直观地监控每个二甲苯的潜伏期，以确定胚胎是明确的，必须非常小心，不允许二甲苯孵化超出这一点。
- 转移胚胎（E10.5及以上）活检SURE - Tek的磁带（Fisherbrand），孵育15〜30分钟，65 ° C蜡整个卡带（Fisherbrand）切换到新鲜蜡另外15〜30分钟，然后再改变。规模较小的胚胎/组织树干需要蜡孵化时间较短。 E9.5胚胎可以被放置在组织包埋模具所有的蜡变化。在这种情况下，你可以删除，而不是把胚胎从模具的蜡。
- 经过三个蜡变化，转移到组织包埋模具（Polysciences），并与新鲜的蜡嵌入胚胎。仔细切片所需的飞机位置的胚胎。让蜡冷却，直到凝固。
- 科为8〜14μm使用标准切片机（如徕卡RM2155）切片蜡块。收集到显微镜载玻片（Fisherbrand）的部分。
- 让幻灯片打下一个slidewarmer单位和干燥。幻灯片可以保存在4 ° C个月。
- 干的部分是脱蜡由两个5分钟二甲苯清洗和串行甲醇/水清洗（100％甲醇2分钟，100％甲醇2分钟，90％甲醇/水2分钟，70％甲醇/水2分钟，用去离子水5成水水化分钟）。
- 核固红（Sigma公司）1分钟的染色液染色的部分。要生成的核固红染色液，稀水溶液在5集中股票的核固红（0.1％核固红在5％硫酸铝在水中，溶解热和通过的Whatman滤纸过滤）1:5 ％硫酸铝。染色后用自来水，直到水变得清晰的幻灯片。核固红作为染液，并揭示出部分的整体组织结构。它的颜色，蓝紫色的染色标记的RNA探针的本地化对比。核固红饱和染色和染色强度，染色溶液的浓度控制。如果核快红染色强度不足时，使用此染色解决方案，您可以重复这一步，较为集中的核固红溶液。
- 准备安装盖玻片的幻灯片，在以下几大系列的解决方案，每年清洗：90％甲醇/ 2 100％甲醇洗涤用水由2二甲苯清洗其次。孵育2分钟，在每个洗涤幻灯片。
- 山与Cytoseal 60安装介质（理查德 - 阿兰科学）的幻灯片。请注意，安装媒体将水溶解核固红染色。
注：我们也用一个塑料嵌入树脂（免疫床，Polysciences公司）与4优异的成绩染色胚胎生成的部分 。
6。代表性的成果：
图1说明了使用该协议取得的代表性成果。图1A显示在E10.5小鼠胚胎GATA3的表达模式。此面板说明一个好的结果具有很高的信号背景比。相比之下，图1C，显示在 GATA3 mRNA的一个部分降解的RNA 探针原位杂交的失败。一个低比活度探头将导致类似的结果与低信号背景的对比。A和C的面板比较说明的重要性探头的质量进行严格的质量控制评估，以确保高品质的成果。 Foxg1探头（图1B）得到的结果也说明了一个很好的结果与特定的端脑与大脑的其他部分低背景染色。大脑和心脏探头诱捕造成的背景染色的共同网站。穿刺钳的大脑和心脏，使洗成胚胎，并最大程度地减少背景染色的解决方案（见步骤3.1）。图1D显示了典型的淡蓝色背景，发现的时候，大脑是不刺破。这表明使用Pax1探头获得一个次优的结果。 Pax1没有表示任何部分的大脑和所有在这个胚胎的大脑中看到的染色是由于非特定的背景。
B.图1代表结果显示成功的例子（A，B）和不理想（C，D）的结果。E10.5胚胎GATA3探针杂交。E11.5胚胎杂交Foxg1探头。C. E10的。 5胚胎杂交GATA3探头部分降解，非常微弱的信号，但高的背景，通过了整个胚胎D. E10.5胚胎Pax1探针杂交不刺穿头部，显示心室背景染色（箭头元首）。
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Discussion
在本议定书中所描述的方法已经适应从不同来源和整装E8.5 - E11.5日龄小鼠胚胎进行了优化。整个装载在脊椎动物胚胎原位杂交方法最早出现在20世纪90年代初2,5-12。该协议被改编，主要是从非洲爪蟾胚胎 7,8以及鼠标 2,11开发的方法。在我们的协议中，很大的重点放在探头严格的质量评估。仔细注意产生高品质和高比活性的RNA探针在这个协议中最早的步骤确定将大大提高数据的质量，从长远来看节省相当多的时间和精力。我们的协议还包括使用噬菌体RNA聚合酶转录PCR产生的DNA模板。这种方法快速，非常可伸缩的。它可以使一个大型的RNA 探针原位杂交屏幕 13-15大量的一代。
背景是很高，但信号为低时，应考虑在本议定书中的几个步骤。其中一个考虑的是探头。我们从未有过很高的背景与RNA探针，符合在本协议规定的设计标准，并已通过所有三个质量控制测试（收益率，具体的活动和探头长度）。另一个因素可能会影响本底水平的探测能力渗透到胚胎组织。必须注意在解剖，彻底去除的膜覆盖胚胎的胚外。此外，蛋白酶K消化步骤是绝对必要的胚胎比E9.5以上的。然而，过度的消化时间较长的蛋白酶K消化时间，较低的背景和更强的信号，可以导致组织损伤增加，并在手术过程中可能会导致胚胎解体。每批蛋白酶K消化时间的优化，以获得最佳效果。另一个可以进行优化，以获得高的信号背景比的第一步是RNase的潜伏期（步长3.14）。我们的协议使用的RNA酶A和RNase T1的混合物。两种酶消化单链RNA，但每一种酶具有不同基础的特殊性。两个小寡核苷酸的单链RNA广泛消化酶的结果相结合。这使得大多数非特异性杂交探针杂交后，在大量减少背景染色产生的洗中删除。增加的背景，并应避免使用的RNase A或T1单独结果。我们还发现，最后的显色反应的质量是通过使用新鲜的AP缓冲改善，立即进行使用前。
我们的协议，可适应额外的处理年龄较大的胚胎或成体组织。举例来说，我们也使用这个协议执行原位杂交厚（100微米）的成年老鼠大脑（数据未显示）vibratome部分。我们也使用这个协议，在年纪较大的胚胎基因表达研究。在某些情况下使用此协议的可视化表面E13.5和E14.5胚胎， 如 Gad1 vibrissae 4卵泡中的表达，基因的表达。在其他情况下，我们用刀片或手术刀切割E12.5 - E14.5胚胎内提供胚胎探头访问特定的组织。使用此协议的一些修改，以这种方式编写的胚胎碎片可以处理。在这种情况下，所有的治疗和洗涤步骤的长度需要进行调整，根据组织的规模和优化经验。
我们的协议还包括杂交后切片和表达模式的分析方法。结合基因表达的整个装载可视化，这个额外的步骤可以添加大量的附加信息有关的基因表达模式。我们有嵌入式经过石蜡原位杂交，以及在塑料树脂4,16中的胚胎。染色胚胎的部分可用于生成三个整装原位杂交过程中发现的表达模式的三维重建。我们已为此SURFdriver软件重建软件。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国立卫生研究院拨款R21MH082360（BGC）和R01HD056315（NRM）以及佐治亚大学的支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Reagent | Roche Group | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche Group | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche Group | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche Group | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | PerkinElmer, Inc. | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche Group | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher Scientific | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene, Agilent Technologies | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma-Aldrich | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros Organics | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences, Inc. | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche Group | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche Group | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche Group | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma-Aldrich | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche Group | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National Scientific Company | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisher Scientific | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisher Scientific | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences, Inc. | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisher Scientific | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma-Aldrich | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
References
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