Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tüm Dağı Published: October 10, 2011 doi: 10.3791/2797
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Genetics, University of Georgia

Summary

Bütün bu montaj

Abstract

In situ hibridizasyon Tüm monte embriyolar gen ifade desenlerinin tanımlanmasına yönelik çok bilgilendirici bir yaklaşımdır. Situ hibridizasyon işlemlerinde uzun ve teknik olarak topluca nihai sonucun kalitesine katkıda birden önemli adımlar ile zorlu. Bu protokol prob etiketleme ve performansını optimize etmek için ayrıntılı birkaç önemli kalite kontrol adımları açıklar. Genel olarak, bizim protokol ayrıntılı bir açıklamasını sunar gerekli kritik adımlar tekrarlanabilir yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek. İlk olarak, PCR tarafından üretilen DNA şablonları in vitro transkripsiyon yoluyla digoxygenin (DIG) etiketli probların RNA üretimini açıklıyoruz. Bu miktar, bütünlüğü ve DIG-etiketli problar spesifik faaliyetini belirlemek için üç kritik kalite kontrol testlerinin açıklanmaktadır. Bu adımlar bir bütün fare embriyo endojen mRNA'ların tespit etmek için yeterli hassasiyet prob üretmek için önemlidir.Ayrıca, in situ hibridizasyon için E8.5-E11.5 günlük fare embriyo fiksasyon ve depolama yöntemleri açıklanmaktadır. Daha sonra, hibridizasyon koşulları, hibridizasyon sonrası yıkamalar ve non-spesifik hibridizasyon probu kaldırmak için RNaz tedavi ayrıntılar, ardından suyla yeniden embriyoların sınırlı proteinaz K sindirimi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. AP-bağlı antikor etiketli sonda görselleştirmek ve endojen transkript salgılama modelini ortaya çıkarmak için kullanılır. Temsilcisi sonuçları başarılı deneyler ve tipik suboptimal deneylerden gösterilmiştir.

Protocol

1. In vitro transkripsiyon yoluyla Spastine Özgü Riboprop nesil

  1. In vitro transkripsiyon şablonları için PCR ürünlerinin hazırlanması.
    1. Bunların 5 'uçlarında faj transkripsiyon promotör sekanslar Designing PCR primerleri.
      Not: promoter sekansı duyu-strand PCR primer ve 5'end için duyu sonda transkripsiyonu için kullanılacak ilave edildi ve promoter sekansı antisens PCR primer 5'end ilave anti-sense sonda sentezlenmesi için kullanılacak 1-3. Biz sadece core promoter dizileri vs core promoter artı ek 5 'sekanslar içeren şablonları içeren şablonları arasındaki transkripsiyon verimliliğinde herhangi bir fark tespit değil. Bu yöntem, T3, T7 ve SP6 faj hızlandırıcılar ile kullanılmıştır.
      Onlar non-spesifik hibridizasyon ve thereb neden olabilir bu yana son derece geni aile üyeleri ya da oldukça tekrarlayıcı dizileri arasında muhafaza edilmektedir Diziler kaçınılmalıdıry plan boyama artırır. Yüksek GC içerikli Problar T kalıntılarının çalışır digoxigenin molekülleri arasındaki sterik parazit nedeniyle kazı-UTP ile birleşmesiyle sınırlar ile sınırlı digoxigenin-rUTP şirketleşme ve DNA şablonu dizilerine sahip olacaktır. Prob uzunluğu 300bp den 1kb değişebilir. Ama sürece yukarıdaki kriterler yerine getirildiği gibi, genellikle uzun probları yüksek spesifik faaliyetleri var.
    2. PCR için şablon, bir plasmid klon, genomik klon veya genomik DNA olabilir. Genellikle biz PCR şablon olarak kullanmak için tam uzunlukta EST klonlar (ATCC veya Açık Biosystems'ten gibi) satın alın. Arttırıcı dizileri ihtiva eden bir PCR ürünü üretmek için standart PCR prosedürleri kullanarak şablon DNA'yı çoğaltmak. Yeterince prob şablonları biz genellikle 8 x 50μl PCR kurmak Birçok prob sentez reaksiyonlarını desteklemek için yapmak. Reaksiyonları bir sonraki adım için bir araya getirilmiştir. Genel olarak, bir kaç büyük hacimli ya da daha küçük PCR reaksiyonları (örneğin, bu kullanım 50μl reaksiyonları gibi),Birçok prob sentez reaksiyonları için yeterince şablon oluşturmak için yeterli yeniden.
    3. Kirletici proteinleri uzaklaştırmak için, plasmid preparatları içinde RNaz özellikle izleri, en azından 30 dakika için 55 ° C 'de 20mg/ml Proteinaz K 1μl ile PCR reaksiyonu, her 100μl sindirir. Bu Proteinaz K sindirimi sonrasında kullanılan tüm reaktifler ve diğer öğeleri RNaz ücretsiz olması ve özellikle RNA çalışmaları için adanmış olmalıdır.
    4. Proteinaz K sindirimi sırasında PCR ürün bütünlüğünü kontrol etmek için bir jel üzerinde PCR reaksiyon bir örnek çalıştırın. Biz kalite kontrol analizleri için büyük PCR ürünleri (> 600-700 bp) çözmek için küçük PCR ürünleri (az 600-700 bp) ve agaroz jel çözmek için akrilamid minivan jelleri kullanın. Eğer jel üzerinde birden bantlar görürseniz, size doğru boyutu tek bir PCR ürünü elde böylece PCR reaksiyonu optimize etmenizi öneririz.
    5. İyice bir (1:1) fenol / kloroform mikst bir eşit hacmi ile sindirilmiş PCR reaksiyon Proteinaz K çıkarmakure, kloroform biri eşit bir hacim ile ekstraksiyon izlemiştir. En az 30 saniye boyunca tüp vorteks her adımda karıştırın. Bu adımlar, bir kimyasal davlumbaz yapılmalıdır.
    6. 3M sodyum asetat ve% 100 etanol 2 hacim, 0.1 hacim eklenmesi ile saflaştırılmış PCR ürünü çökeltmek. En az 30 dakika boyunca -20 ° C'de tutun.
    7. Bir mikrosantrifüj 13.000 rpm'de 5 dakika Spin, süpernatant kaldırmak ve% 70 Etanol ile yıkayın. DNA pelet tamamen kurumasını bekleyin.
    8. 1xTE için uygun hacim süspanse DNA (örneğin 50μl). Bir flüorometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçümü.
    9. Faj yükseltici sıralan ya da sonda içinde bir iç dizisine denk primerler kullanılarak PCR her bir şablon hazırlık nükleotid sekansı belirlenir. Bu sonda şablon doğru sırası olmasını sağlayan önemli bir kalite kontrol adımdır.
    10. DNA'nın in vitro transkriptte için şablon olarak hizmet vermeye hazıriyon. 4 ° C'de depolayın DNA şablon
  2. Bir şablon olarak PCR ürünü kullanılarak in vitro transkripsiyon.
    1. 50μl bir son hacim içinde, bir RNA transkripsiyonu reaksiyon ayarlayın. Transkripsiyon reaksiyonu 500 içerir - 10X Transkripsiyon Buffer 5μl şablon DNA 1000 ng, (100 mM DTT) ile, RNA Polimeraz ve 10μl 2.5mm kazı-NTP karışımı, 3μl (50 ~ 90 adet), 1μl Alpha-32 P CTP (yukarı 6 aylık) ve hacim kalan diethylpyrocarbonate arıtılmış su ilave edilerek oluşur. 2.5mm dig-NTP karışımı tipik olarak 10μl 10mM CTP, 10μl 10 mM GTP, 10μl 10 mM ATP, 10 mM 6.5μl UTP, digoxigenin 3.5μl 10 mM-11 UTP içeren bir 40μl çalışma stok olarak oluşur. Transkripsiyon reaksiyon birleştirme, reaksiyon tüm bileşenler (enzim için hariç) oda sıcaklığına ısıtıldı olduğundan emin olun. Birinci DNA ve su karıştırılır, daha sonra reaksiyon tamponu ilave edilir, karıştırılır ve daha sonra diğer bileşenler eklemekAksi transkripsiyon tampon içinde spermidin DNA çökelti olacaktır. Ikinci RNA polimeraz için önerilen sıcaklıkta 2 saat için inkübe edin.
      Not: α-32 P, RNA probu içine dahil edilen nükleotid havuz başlangıç ​​oranını saptamak için izin vermek için reaksiyona ilave edilir. Bu reaksiyon verimini önemli bir ölçüsüdür. Aşağıdaki adımları her 32 P. prosedürünü izleyin
      Sentezlenen RNA probu miktarının ölçülmesi için alternatif bir yöntem, küçük hacimli bir spektrofotometre kullanmak için. Bu (adım 1.3.1 deki notlara bakınız) 32 P etiketleme kullanımını önler
    2. Inkübasyondan son birkaç dakika boyunca, üreticinin talimatlarına göre Hızlı Spin Column (Roche) hazırlamak.
    3. İnkübasyondan sonra, 10 dakika süreyle 37 ° C 'de RNaz serbest DNaz I ile inkübe 1μl ekleyin.
    4. Reaksiyon Seyreltme tamponu 50μl ile 100μl seyreltin (20mM TrispH7.5,% 1 SDS, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl (RNase içermeyen, oda sıcaklığında 50 ml stok etmek ve saklamak)). Toplam başlayarak sayıları sayma sintilasyon ve jel analizi için 1μl (genellikle 1x TE 4μl içine) atın.
    5. Bir masa üstü klinik santrifüj içinde 4 dakika için 1100 x g'de kolon yatak ve sıkma merkezi üzerine reaksiyon geri kalan uygulanır. Spin sonra, RNA probu toplama tüpüne olduğunu.
    6. Yıkanan reaksiyona girerek% 100 etanol 2 cilt ekleyin. İyice karıştırın ve 5 dk (veya -20 ° C veya 30 dk) için buz üzerinde tutmak.
    7. Pelet RNA probu ile 5 dakika için maksimum rpm'de bir mikrosantrifüj tüpü içinde Spin.
    8. Tamamen pipet tarafından süpernatant kaldırmak ve pelet hava kurumaya bırakın. Bunu çözmek için çok zor olacak, çünkü pelet aşırı kuru izin vermeyin.
    9. 100 ul 1xTE veya DEPC-H 2 O - RNA 50 ul prob eritilir Bir denat üzerinde yüzde kuruluş belirlenmesi ve analizi için 1 mikrolitre numune alınAkrilamid jeli uring. Tahmini verim göre 100 ng / ul prob konsantrasyonu ayarlayın.
    10. Her üç kalite kontrol geçen Probes sonra 6 ile 12 ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir. Biz genellikle 12 ay içinde prob stok egzoz. Bu problar-20C çok uzun süreler boyunca saklanabilir olması çok muhtemeldir.
  3. Spastine Özgü Riboprop Kalite değerlendirme - ölçme probu verim.
    1. Sonda verimi tahmin etmek için, spin kolon (prob sentez protokol alınan numuneler ile ölçülmüştür) daha önce reaksiyon sayımları ile spin kolon sonra geri sayım bölün. Bu reaksiyon için,% 100 kuruluş = 33 mikrogram. Başarılı bir reaksiyon genellikle bir% 15-50 verim sağlar. % 15'den az kuruluş (<5 mg verim) ile Probları kullanılmamalıdır.
      Not: sonda verim ölçmek için alternatif bir yöntem, küçük hacimli bir spektrofotometre veya florimetre kullanılmasıdırdoğrudan RNA miktarını ölçmek için spin kolon kromatografisi sonra sunuyoruz. Bu alternatif bir yaklaşım 32 P iz etiketleme kullanımını önler. Biz Biotek Epoch Mikroplaka Spektrofotometre kullanılarak Spastine Özgü Riboprop konsantrasyonu ölçüldü. 32 P kuruluş gelen Spastine Özgü Riboprop kitle tahminlerine spektrofotometre alınan değerlerin karşılaştırılması iki yöntem son probu hazırlık benzer bir küçük hacimli (2 ul) örnek kullanılarak karşılaştırılabilir sonuçlar verdiğini göstermiştir.
      Hemen hemen her zaman çok düşük ya da hiç verim PCR için şablon olarak kullanılan plazmid hazırlama kaynaklanan kontaminasyon RNaz kaynaklanmaktadır. Adım 1.1.3 açıklandığı gibi proteinaz K ile plazmid DNA ve PCR ürünü tedavi emin olun.
  4. Spastine Özgü Riboprop Kalite değerlendirmesi - spesifik aktivite ölçüm.
    1. Digoxigenin ölçüde ölçmek için - UTP şirketleşme bir nokta testi. Bu cru olduğunuCIAL kalite kontrol testi.
      100 ng / ul prob konsantrasyonu ayarlayın. Hybond-N + (GE Healthcare) ya da başka eşdeğer bir naylon filtre 82mm çap üzerine prob seri dilüsyonları Noktası 1 ul (10 -2 10 -5). Negatif kontrol olarak etiketsiz DNA örneği ekleyin. Crosslink nemli 125mJoules bir UV çapraz bağlayıcı hemen filtre veya kullandığınız naylon filtre için üreticinin talimatlarına göre.
      Aşağıdaki adımlar (1.4.2 - 1.4.6) 'inin, oda sıcaklığında bir sallanan platform üzerinde bir Petri kabı içerisinde gerçekleştirilir. Siz filtre probu dilüsyonları tespit sonra RNaz hakkında endişelenmenize gerek yok
    2. % 1 Engelleme 10 ml içinde oda sıcaklığında 30 dakika için bloke filtre 1X TN (10X TN buffer = 1M Tris pH7.5, 1.5M NaCl) içinde reaktifi (Roche)
    3. 1 X 10ml 1X TN tamponunda 15 dk yıkayınız.
    4. 30 dakika için 1X TN tampon 1/5000 dilusyondaki karşıtı digoxigenin Fab parçası ile inkübe edin. </ Li>
    5. 2 X 10ml 1X TN tamponunda 15 dk yıkayınız.
    6. Renk reaksiyonu BM mor substrat (çanak 5ml hakkında gerekli) ile yapılır. Renkli 30 dakika içinde 10 -4 dilusyonlardan yerinde görünür olmalıdır. Bu noktada, 5 dakika 5X TE ile her biri için 2 kez yıkama ile renk reaksiyonu durdurun. Sinyal 10 -4 seyreltme için karşılık gelen nokta olarak görünür değil ise bir sonda atılmalıdır.
      Not: Bizim tecrübelerimize göre, yetersiz spesifik aktivite sadece kısa probları ile bulunur. Bu protokolde belirtilen diğer tasarım kriterlerine bağlı kalarak prob şablonu (yukarı 1kb kadar) büyüklüğünün artırılması probun spesifik aktivite artırmalıdır. Düşük spesifik faaliyeti sinyalinin düşük veya tespit edilemeyen düzeylerde yol açar.
  5. % 5 denatüre akrilamid jeli içerisinde elektroforezi ile prob bütünlüğünü test edin.
    Bu önemli bir kalite kontrol kitidir.Bu protokol, prob (adım 1.2.1 'e bakın) sentez reaksiyonu sırasında 32 P ile etiketlenmiş olduğunu varsayar. Biz bize kolayca bozulmuş veya eksik probları algılamasını sağlayan, çok yüksek çözünürlük sağlamak için akrilamid jel denatüre kullanın. Tipik olarak,% 5 akrilamid denatüre minigel (7.5g Üre, 1.9ml% 40 akrilamid, 1.9ml% 2 bis-akrilamid (ya da bir 20:01 akrilamid kullanmak: bis-akrilamid çözeltileri), 1.5 ml 10X jel MOPS tampon (0.2 M morpholinopropanesulfonic asit, pH7.0, 50 mM sodyum asetat, 5 mM EDTA) ve 15 ml değerindeki bir son hacim için H2O) bu protokol kullanılmıştır aralıkları boyutu problar çözülmesi için çok iyi çalışır.
    Not: Alternatif olarak, TBE üre-hazır jel çeşitli tedarikçilerden satın alınabilir. Prekast jeller çalıştırmak için üreticinin talimatlarını izleyin.
    1. Jel Yükleme Tamponu (Ambion) eşit hacimli numune karıştırın ve iyice karıştırın.
    2. 95 Isı ° C herhangi bir ikincil yapısı denatüre etmek için 5 dakika.
    3. Immedialarına yeniden tavlama önlemek için jel üzerinde yüklemeden önce buz üzerinde soğutun.
    4. Mavi boya jelin sonuna kadar devam eder kadar 200V birlikte kolon örnekleri önce ve sonra çalıştırın. Jel 1X MOPS jel tamponu çalıştırılır.
    5. Plastik wrap jel sarın ve radyoaktif RNA tespit röntgen filmi veya fosfor görüntüleyici ekrana maruz kalmaktadır. 32 P etiketleme kullanılan değilse RNA tespit etmek için geleneksel bir floresan boya ile jel leke yapabilir
    6. Başarılı bir sonda sentez jel üstünde çok yakın bir keskin bir bant olarak geçirir bir RNA probları neden olur.

2. Fare embriyo toplanması ve depolanması

  1. Fare embriyolar buz soğuk PBST (PBS +% 0.1 Tween 20, (tedavi diethylpyrocarbonate (DEPC))) 'de toplanmış ve diseksiyon sırasında buz üzerinde tutulmalıdır.
  2. Embriyolar 4 ml vidalı kapaklı cam şişelerde işlenir. Birden fazla embriyo bir şişe sabit olabilir. Gibi pek çok 15 ila 10 E9.5ya da 5 E10.5 embriyolar, tek bir şişe içinde sabitlenebilir. Embriyonun artan boyutu nedeniyle, E11.5 embriyolar hibridizasyon sırasında prob erişim yardım için fiksasyon öncesinde bir jilet ile hemisected edilmelidir. En fazla 3 hemisected E11.5 embriyolar, tek bir şişe içinde yerleştirilebilir.
  3. Sadece küçük bir hava kabarcığı aksi kalır, böylece bu protokolde aşamalarının etkinliğini maksimize etmek ve embriyolar, embriyo fiksasyon ve tüm yıkar flakon boynun alt seviyeye doldurulmuş çözümleri ile numune şişeleri yapılmaktadır hasarı azaltmak belirtildi. Yıkama tüm adımları için şişe bir rocker platformda kendi tarafında belirtilmiştir.
  4. PBST içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ile 4 ° C'de bir sallanan bir masa üzerinde bir gece boyunca 6 saat için düzeltildi. Şişeler 4 ° C sıcaklıkta bir rocker platform üzerine yatay olarak yerleştirilmiş ve sallandı olmalıdır
  5. Tespit edildikten sonra, embriyolar buz üzerinde 5 dakika PBST içinde her iki kez yıkanır ve daha sonra bir metakolinin ile kurutulmuş aşamalıcam Pasteur pipet kullanılarak şişe içinde çözüm ile değiştirerek nol / PBST serisi (PBST içinde% 25 metanol, PBST içinde% 50 metanol ve PBST içinde% 75 metanol)% 100 metanol içine. Embriyolar 8 ay için% 100 metanol içinde ve belki de daha uzun-20C saklanabilir.

3. Digoxigenin Hibritleşmesi bütün fare embriyolarına prob etiketli

  1. Delinme kalpleri ve E10.5 ve mikrodiseksiyon bıçakla eski embriyoların kafaları embriyolar (Bu diseksiyon sırasında yapmamış olsaydı) metanol ise hala. Bu basit adım, yıkama çözümleri beyin veziküller ve böylece büyük ölçüde arka plan boyama azaltarak kalp boşluklarına girmek için izin verir.
  2. Her bir metanol konsantrasyonda 5-10 dakika için metanol / PBST dizi birbirini takip eden yıkamadan (PBST içinde% 75 metanol, PBST içinde% 50 metanol ve daha sonra PBST içinde% 25 metanol) ile embriyolar rehidrate. 100% PBST 5 dakika, her yıkama için iki kez yıkayın.
  3. 04:01 PBST içinde inkübe:% 30 H2O 2buz üzerinde 1 saat bekletilir. Sonra her 1X PBST 3 değişiklikleri ile 5 dk yıkayınız.
  4. Son PBST yıkama çıkarın ve 1ml 10 mikrogram / ​​PBST ml proteinaz K ile değiştirin. 25 ° C su banyosunda rafa tüpler dikey proteinaz K sindirimi yere sırasında.
    Not: proteinaz K Çözümleri kendini sindirim nedeniyle zamanla aktivite kaybederler. Maksimal ve tutarlı etkinliği sağlamak için proteinaz K çözümü hemen her kullanımdan önce taze yapılmalıdır. Her kullanımdan bir 1mg/ml stoku küçük bir miktar yapmak için o sulandırmak. Inkübasyon süresi proteinaz K toz her lot ve her embriyo yaşı belirlenmelidir. Örneğin, E9.5 embriyolar için uygun bir zaman genellikle 25 dakika 10-15 ° C iken E10.5 için genellikle 25 dakika 20-30 ° C'de bir Proteinaz K inkübasyon süresi de şişeleri ile deneyler arasında geçerli bir karşılaştırma yapmak için izin vermek için deney sırasında tam olarak ölçülmesi gerekmektedir. Sıcaklık dikkatle artırmak için sindirim sırasında muhafaza edilmelidir    tekrarlanabilirlik. 1. gibi küçük farklar ° C deneyler arasında sindirim miktarını değiştirebilir. Kuvvetle proteinaz K sindirimler bir inkübatör veya hassas sıcaklık kontrolü için bir su banyosunda yapılması tavsiye edilir. Bu adım prob böylece güçlü bir sinyal üreten dokuya nüfuz izin verdiği için önemlidir. Bununla birlikte, fazla-sindirim embriyolar zarar verir ve yavaş yavaş kalan adımlar boyunca parçalanır.
  5. PBST içinde taze 2 mg / ml glisin ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca iki kez her bir yıkama yıkama ile Proteinaz K sindirim durdurun. Sonra 5 dakika PBST her iki kez yıkayın.
  6. PFA / PBST,% 0.2 glutaraldehit (Polysciences)% 4, oda sıcaklığında 20 dakika için sindirilmiş embriyolar düzeltildi. Aşırı veya underfix etmeyin. 5 dakika PBST içinde her biri için 3 kere yıkayın.
  7. Bu noktada, embriyo hibridizasyon için gruba ayrılabilir olmalıdır. PBST çıkarın. 1 ml hibridizasyon tamponu (% 50 Ult eklemerapure formamid (Invitrogen), 5x SSC, pH 5,% 1 SDS, 50 ug / ml heparin (Acros), 65 ° C (çubuksuz) ısıtıldı edilmiş 50 ug / ml Torula RNA (Sigma)). Embriyolar yerleşmek için izin verin, ardından hybrization tampon tümünü çıkarın ve prob olmadan 1 ml taze ısıtılmış hibridizasyon tamponu ile değiştirin.
  8. Çalkalamalı su banyosunda ya da sallanan bir platform (örneğin Boekle Shake 'n' Bake Oven için, bkz Tablo 1) bir fırında 65 ° C'de 1 saat Prehybridize. Eğer inkübe Eğer bir su banyosunda şişeleri su değil şişeleri üstleri, üzerinde, kadar gelir emin olun. Hibridizasyon sıcaklığı 70 kadar artabilir ° 65 Yukarıdaki C Hibridizasyon ° C sıcaklık test ettik en sonda ile sinyal yoğunluğu veya arka plan etkilemez. Embriyolar bunları kullanırken dikkatli olun (örn. hibridizasyon tamponu) formamid tampon saydam, yapışkan ve kırılgan hale gelir.
  9. 0.4ml hibridizasyon tamponu bir de prob içeren ile prehybridization tamponu değiştirin0.25-1 ug / ml konsantrasyonuna sahiptir. Yaklaşık E8.5 kadar embriyo için 0.5 mg / ml prob kullanın. Büyük embriyoları için, sondalar 1-0,1 g / arka plân düşük (genellikle bu yüzden 0.25-0.5 ug / ml ya da) ile iyi bir sinyal için optimum konsantrasyonu belirlemek için ml ile titre edilmelidir. Büyük hibridizasyon hacimleri büyük embriyolar için gerekli olabileceğini unutmayın. 65 gecede melezleşme ° C.
  10. Embriyolar üzerinde proteinaz K ile tedavi edilmiş ise, son derece şeffaf görünür. Onlar da flakonun iki sopa, ya da ayrı düşebilir. Bu sayede görünür Embriyolar protokol bu noktada atılmalıdır. Onları İşleme daha yorumlanabilir verilerin neden olmayacaktır.
  11. Isıtılmış Çözüm ile hibridizasyon tamponu değiştirin 70 I (% 50 formamid, 5x SSC pH 5,% 1 SDS) ° C E8.5 embriyolar, E9.5 ve üstü için yıkama başına 30 dakika boyunca üç kez 30 dakika, her yıkama için iki kez yıkayın.
  12. % 50 Çözüm II (0.5: Önceden ısıtılmış% 50 Çözüm I kez yıkayınM NaCl, 70, 10 mM Tris HCI, pH 7.5,% 0.1 Tween 20) ° C de 10 dakika.
  13. Çözelti, oda sıcaklığında II ile yıkama başına 5 dakika için üç kez yıkayın.
  14. Çözüm II A 100 mg / ml, RNaz T1 100 ünite / ml RNase içeren ile tampon değiştirin. Yıkama başına 30 dakika için iki kez 37C de sıcak bir odada bir rocker üzerinde inkübe edin. RNaz yıkama plan azaltmak için esastır nonspesifik melezleşmiştir probları kaynaklanmıştır.
  15. 65 Çözüm III (% 50 formamid, 2x SSC bölümde pH5) yıkayın ° C iki E9.5 ve üstü için yıkama başına 30 dakika E8.5, 3 kez 30 dakika, her yıkama için.
  16. 1X TBST (10X TBS 100 ml 1X TBST suyun uygun bir hacim 10X TBS sulandırmak ve yapmak için 8g NaCl, 0.2g KCl, suda 12.5ml 2M Tris HCI pH 7.6. Içeren ile yıkama başına 5 dakika boyunca 3 kere yıkayın ) Tween 20% 0.1 son konsantrasyon eklemek
  17. Belirtilmediği sürece, tüm yıkama alt seviyeye kadar doldurulur çözümleri ile numune şişeleri yapılırflakon boyun. Tüm yıkama adımlar için, şişeleri bir rocker platformda kendi tarafında belirtilmiştir.

4. Digoxygenin Antikor algılama probu etiketli

  1. Embriyolar 0.5 ml 1X TBST +% 10 ısıl işlem görmüş koyun serumunda önceden engellenir. Daha sonra, en az 2.5 saat için oda sıcaklığında (yaklaşık 20 ° C) dikey olarak şişeleri sallayın.
  2. Alkalin fosfataz bağlı koyun anti-digoxigenin Fab parçaları (embriyo aseton tozu ile inkübe edilmesiyle çıkarılır, aşağıya bakınız) 1:5000 dilüsyon - taze 1X TBST ile engelleme çözümü + bir 1:2000 içeren% 10 serum değiştirin. Arka aza indirmek için 1:5000 için E9.5 ve yaşlı embriyolar daha yüksek dilüsyon kullanın. 4 ° C'da gece boyunca külbütör üzerinde dikey olarak inkübe edin.
    Not: bir embriyo aseton ile toz anti-digoxigenin Fab parçaları inkübasyon Bu protokolde arka plan boyanma seviyelerini düşürdüğünü bulduk. Embriyo aseton tozu havuzlanmış E12.5-14.5 fare embr homojenize hazırlamak içinPBS en az bir hacim içinde yolar. Buz soğuk aseton, karışım 4 hacimleri ilave edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. 10 dakika boyunca 10.000 xg'de iplik süpernatantı. Buz soğuk aseton ile pelet yıkayın ve tekrar döndürebilirsiniz. Pelet Dağılın ve filtre bir kağıdın üzerine toz haline getirin ve kurumaya bırakın. Toz daha sonra yıl boyunca 4 ° C sıcaklıkta bir hava geçirmez bir tüp içinde saklanabilir.
    Antikor çıkarma için, antikor önceden bloke etme sırasında ya da daha önce spesifik olmayan bağlayıcı azaltmak için embriyo aseton toz için önceden absorbe edilmesi gerekmektedir. 4. en az 1 saat süreyle serum 1xTBST/10% olarak embriyo tozu az miktarda (bu miktar kritik değildir) ile 1/100 antikor ile inkübe sallanan ° C. 4 ° C'de 10 dakika için bir mikrosantrifüj içinde eğirme ile toz kaldırma Çıkarılmış antikor en az 6 ay süreyle 4 ° C'de saklanabilir.
  3. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle her bir 5-6 kez fazla antikor çıkarmak için daha sonra, 1X TBST ile üç kez 5'er dakika yıkanır. Eğer panılan arka planı azaltmak için 4 ° C de bir gece boyunca uzun yıkama yapmak. Gecede yıkama dramatik böylece gürültü oranı sinyal arttıkça plan seviyelerini azaltabilir.
  4. Taze alkalin fosfataz tamponu (100 mM E9.5 için Tris, pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCI,% 0.1 Tween 20. 0.5mg/ml levamisol ekleme, bir endojen AP inhibitörü ve daha yaşlı ile yıkama başına 20 dakika için iki kere yıkayın embriyo).
  5. BM Mor AP substrat (Roche) oda sıcaklığına ISITMASIZ ile son yıkama değiştirin.
  6. Renk reaksiyonu bir diseksiyon mikroskobu ile oda sıcaklığında inkübe ve periyodik sinyal izlemek için izin ver. Genişletilmiş renk reaksiyonları (gecede birkaç saat) için şişeler ışıktan korunmalıdır. Bol mRNA'ların için sinyal 15 dakika içinde görünür olmalıdır. Tepkiler Eğer sinyal ile karşılandığında durdurulabilir veya arka plan bir sorun olmaya başladığında edilmelidir. Çözümü kendisi koyu dönmeye başlar Eğer c uzatabilirsinizsubstrat çözeltisi ile değiştirerek olor reaksiyon.
  7. 1X PBST/5mM EDTA yıkama başına 5 dakika boyunca iki kez yıkanarak reaksiyon durdurun.
  8. Gecede birkaç saat, paraformaldehid / PBST yeniden düzeltmek için% 4 aktarın. Ya da embriyolar yıl için% 4 paraformaldehyde/1X PBST içinde depolanabilir ya da hemen kesit için işlenebilir. Bu son fiksasyon adım boyanma paterni uzun vadeli korunması için çok önemlidir.

5. Parafin lekeli embriyoların gömme ve kesit

  1. Boyanma düzeyi istenilen yoğunlukta olduğu zaman renk reaksiyonu (adım 4.8) bütün montaj lekeli embriyoların resimler çekildikten sonra embriyolar sabitlenir önce. Bütün embriyo koyu mavi oluncaya kadar bütün embriyolar salgılanma modellerini belgeleme sonra da oda sıcaklığında 24 saat için gece boyunca BM mor substrat içerisinde inkübe edilir. Bu adım, boyama inci göstermek için yeterince karanlık olmasını sağlamak içinE doku bölümleri. Embriyonun mavi renk tüm embriyo yüzey üzerinde pigment çok ince bir tabaka birikimine bağlı olduğunu lütfen unutmayınız. Bu, arka plan boyama kesit sonra ilgili doku içinde belirlenmesini değildir.
  2. Aşırı substrat çökeltileri kaldırmak ve 4% 4 PFA gecede düzeltmek için PBS üç kez lekeli embriyolar yıkayın ° C
  3. PBS üç kez yıkayın, daha sonra% 100 metanol (as 2.4 anlatıldığı gibi) içine embriyolar kurutmak.
  4. Ksilen ile son metanol değiştirin. Embriyoların netleşecektir kadar 2 dk her bir yıkama için ksilen 2 ila 3 kez yıkayın. O çok zor bozulmamış bölümleri kurtarmak için yapıyor gömüldükten sonra bu doku çok kırılgan hale getirecek bu yana ksilen yıkamak üzerinde etmeyin. Görme emin embriyolar sadece açık olma noktasına vardır yapmak ve ksilen kuluçka Bu noktanın ötesinde genişletmek için izin vermeyecek şekilde çok dikkatli olmak her ksilen inkübasyon izlemek.
  5. Transferi embriyolar (E10.5 ve üstü) Biyopsi Sure-Tek kaset (Fisherbrand) içine, ve 15 için balmumu tüm kaset (Fisherbrand) ~ 65 az 30 dakika ° C'de inkübe Başka bir 15 ~ 30 dakika için taze balmumu içine değiştirin ve sonra tekrar değiştirin. Küçük embriyolar / doku gövdeleri kısa balmumu inkübasyon süresi gerektirir. E9.5 embriyolar tüm balmumu değişiklikler için doku gömme kalıp yerleştirilebilir. Bu gibi durumlarda, yerine embriyo transfer kalıp balmumu kaldırabilir.
  6. Doku gömme kalıpları (Polysciences) içine üç balmumu değişikliği, transferi embriyo sonra ve taze balmumu ile gömün. Dikkatle Kesit istenen düzlemi için embriyolar yerleştirin. Katılaşmış kadar balmumu soğumasını edelim.
  7. Bölüm standart mikrotom (örneğin Leica RM2155) kullanarak 8 ~ 14μm dilimler halinde mum blok. Mikroskop slaytlar (Fisherbrand) üzerine bölümleri toplayın.
  8. Slaytları slidewarmer düz ve kuru anlatayım. Slaytlar ay için 4 ° C sıcaklıkta saklanabilir.
  9. Kurutulmuş bölümler iki 5 dk xylen tarafından mumu alınmış olane yıkama sıvıları ve seri metanol / su yıkama sıvıları (% 100 metanol 2 dak,% 100 metanol 2 dk,% 90 metanol / su 2dakika,% 70 metanol / su 2dakika, deiyonize su 5 dakika) ile su içine sulandırılır.
  10. 1 dakika için nükleer hızlı kırmızı (Sigma) boyama çözeltisi ile bölümleri Leke. Nükleer hızlı kırmızı boyama çözeltisi oluşturmak için, nükleer hızlı kırmızı bir konsantre stok seyreltik 5 bir sulu çözelti içinde 1:5 (0.1% su içinde% 5 alüminyum sülfat, nükleer hızlı kırmızı, Whatman filtre kağıdı ile ısı ile çözülür ve filtre) % alüminyum sülfat. Lekelenme sonra su netleşene kadar akan su ile slaytlar yıkayın. Nükleer hızlı kırmızı bir karşı gibi davranır ve bölümlerde genel dokusu yapısını ortaya çıkarmaktadır. Onun rengi RNA probu lokalizasyonu işaretleri mor-mavi boyama ile de çelişmektedir. Nükleer hızlı kırmızı bir doyurarak leke ve boyama yoğunluk boyama çözeltisinin konsantrasyonu ile kontrol edilir. Eğer nükleer hızlı kırmızı boyanma yoğunluğuEğer daha yoğun bir nükleer hızlı kırmızı çözümü ile bu adımı yineleyin Bu boyama çözüm kullanırken yetersizdir.
  11. Aşağıdaki seri olarak solüsyonların her içinde yıkama ile lamelleri montaj için slaytlar hazırlayın:% 90 metanol /% 100 metanol içinde 2 yıkamadan ve ardından su ksilen içinde 2 ile yıkama takip etti. Her bir yıkama için 2 dakika boyunca kayar inkübe edin.
  12. Cytoseal 60 montaj orta (Richard-Allan Bilimsel) ile slaytlar monte edin. O sulu montaj medya nükleer hızlı kırmızı leke eriyecektir unutmayınız.
    Not: biz de mükemmel sonuçlar 4 ile boyanmış embriyoların bölümleri oluşturmak için plastik gömme reçine (Immuno-Yatak, Polysciences Inc) kullandık.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 bu protokolü kullanılarak elde temsilcisi sonuçlar gösterilmektedir. Şekil 1A E10.5 fare embriyolarında Gata3 ifade desen gösterir. Bu panel iyi bir r göstermektedirarka plan oranı yüksek bir sinyal ile esult. Şekil 1C, aksine, bir kısmen bozulmuş RNA probu kullanılır Gata3 mRNA için in situ hibridizasyon başarısız gösterir. Düşük spesifik aktivite prob arka kontrast düşük sinyal ile benzer sonuçlara neden olacaktır. Paneller karşılaştırılması A ve C önemini göstermektedir yüksek kaliteli sonuçlar sağlamak için prob kalite özenli kalite kontrol değerlendirmeleri gerçekleştirme. Foxg1 sonda (Şekil 1B) ile elde edilen sonuçlar aynı zamanda beyin diğer bölgelerinde düşük arka plan ile telencephalon içinde spesifik boyama ile iyi bir sonuç göstermektedir. Beyin ve kalp prob yakalama nedeniyle arka plan boyama sık sitelerdir. Forseps ile beyin ve kalp Delme (adım 3.1 'e bakın) embriyo ve en aza indirir arka plan boyama içine çözümler yıkayın sağlar. Şekil 1D beyin delinirse değilken bulundu tipik açık mavi arka plan göstermektedir. Bu suboptimal sonuç Pax1 prob kullanılarak elde gösterir. Pax1 beyin herhangi bir bölümü olarak ifade edilir ve bu embriyo Beynin, boyanma tüm spesifik olmayan arka plan bağlıdır değildir.

Şekil 1
Çıktıları (A, B) başarılı ve suboptimal (C, D) örnekler gösteren Şekil 1. Temsilcisi sonuçları. A. E10.5 Embriyo Gata3 prob ile hibridize. B. E11.5 Embriyo Foxg1 prob ile hibridize. C. E10. 5 embriyo bütün embriyo boyunca çok zayıf sinyal ancak yüksek arka gösteren, kısmen bozulmuş olan Gata3 prob ile hibridize. D. E10.5 Embriyo ventriküllerin (ok başları) arka plan boyama gösteren baş delinme olmadan Pax1 prob ile hibridize.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolü açıklanan yöntemler farklı kaynaklardan bir dizi uyarlanmış ve tüm montaj E8.5-E11.5 günlük fare embriyoları için optimize edilmiştir. Omurgalı embriyolarının in situ hibridizasyon tüm montaj yöntemleri ilk 1990'ların başında 2,5-12 ortaya çıktı. Bu protokol öncelikle Xenopus embriyolar 7,8 yanı sıra fare 2,11 için geliştirilen yöntemler uyarlanmıştır. Bizim protokol vurgu büyük bir prob dikkatli kalite değerlendirmesi üzerine yerleştirilir. Yüksek kalite ve yüksek spesifik aktivite RNA üreten dikkat bu protokolde ilk adımları tarafından belirlenen sondası büyük ölçüde verilerin kalitesini artırmak ve uzun vadede zaman ve çaba önemli miktarda tasarruf edecek. Bizim protokol aynı zamanda faj RNA polimeraz transkripsiyon PCR oluşturulan DNA şablonları kullanımını içerir. Bu yaklaşım, hızlı ve çok ölçeklenebilir. Bu RNA probları fo çok sayıda üretilmesine sağlayabilirin situ hibridizasyon r büyük ölçekli 13-15 ekranlar.

Arka plan yüksek ama sinyal düşük olduğunda bu protokol çeşitli adımlar dikkate alınmalıdır. Bir göz probu. Biz bu protokolde belirtilen tasarım ölçütlerini karşılayan ve her üç kalite kontrol testleri (verim, spesifik aktivite ve prob uzunluğu) geçmişti RNA problar ile yüksek arka plan yoktu. Arka plan düzeylerini etkileyebilir başka faktör embriyonik dokulara nüfuz prob yeteneğidir. Bakım tamamen embriyonun kapsayacak extraembryonic membranlar kaldırmak için diseksiyon sırasında alınmalıdır. Buna ek olarak, proteinaz K sindirim adım E9.5 daha büyük embriyolar için kesinlikle gereklidir. Uzun proteinaz K sindirimi kat daha düşük arka plan ve güçlü sinyali verir, ancak, aşırı sindirim kat artmış doku hasarına yol açabilir ve işlem sırasında embriyonun dağılmasına neden olabilir. Optimizatproteinaz K her bir lot için sindirim süresi iyon iyi sonuçları elde etmek için gereklidir. Arka plan oranları yüksek sinyal elde etmek için optimize edilebilir diğer adım RNaz inkübasyon (adım 3.14) 'dir. Tüm protokol RNase A ve RNaz T1 oluşan bir karışım kullanılmaktadır. Her iki enzim tek sarmallı RNA sindirimi ama her enzim farklı bir temel özgüllüğü vardır. Küçük oligoribonucleotides için tek zincirli RNA geniş sindirim enzim iki sonuç bileşimi. Bu, post-hibridizasyon ile uzaklaştırılması non-spesifik olarak hibridize prob en arka plan boyama büyük bir azalma ile sonuçlanan yıkar sağlar. Artan arka planda RNaz A veya T1 başına sonuç kullanın ve kaçınılmalıdır. Ayrıca nihai renk reaksiyonu kalitesini AP taze tampon kullanılarak geliştirilmiş olduğunu bulduk, kullanmadan önce derhal yapılmış.

Bizim protokol ek işleme Büyük embriyo veya yetişkin dokular için adapte edilebilir. Örneğin, aynı zamanda sahiperişkin fare beyin (veriler gösterilmemiştir) kalınlığında (100 mikron) vibratome bölümlerde yerinde hibritleşme gerçekleştirmek için bu protokolü kullanılır. Biz de eski embriyolarında gen ekspresyonu incelemek için bu protokolü kullandık. Bazı durumlarda, örneğin burun kılı 4 köklerinin Gad1 ifade gibi E13.5 ve E14.5 embriyolar, yüzeyi üzerinde gen ekspresyonu görselleştirmek için bu protokol kullanılmıştır. Diğer durumlarda bir jilet veya neşter embriyo içinde belirli dokulara prob erişim sağlamak için E12.5-E14.5 embriyolar kesmek için kullandık. Bu şekilde hazırlanan embriyo parçaları bazı modifikasyonlar ile bu protokol kullanılarak işlenebilir. Bu tür durumlarda bütün uygulamalar ve yıkama adımları doku uzunluk boyutuna göre ayarlanabilir ve ampirik olarak optimize edilmesi gerekmektedir.

Bizim protokolü de ifade desenlerini sonrası hibridizasyon kesit ve analizi için yöntemler içerir. Gen ifadesinin tüm montaj görselleştirme Bu ilavesi ile birliktetional adım bir genin ekspresyonu desen ile ilgili ek bilgiler büyük bir ekleyebilirsiniz. Biz parafin in situ hibridizasyon geçiren yanı sıra plastik reçine 4,16 yıllardan sonra embriyolar gömülü var. Lekeli embriyoların bölümleri in situ hibridizasyon usul içinde, bütün bağlama ortaya salgılama modeli ve bir üç boyutlu yeniden oluşturmak için de kullanılabilir. Bu amaç için SURFdriver yazılım programı yeniden kullanılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH hibe R21MH082360 (BGC) ve R01HD056315 (UYM) yanı sıra Georgia Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate Reagent Roche Group 11209256910
Ribonucleoside Triphosphate Set Reagent Roche Group 11277057001
Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification Supply Roche Group 11274015001
T7 RNA polymerase Reagent Roche Group 10881767001
SP6 RNA polymerase Reagent Roche Group 10810274001
T3 RNA polymerase Reagent Roche Group 11031163001
CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi Reagent PerkinElmer, Inc. BLU008X250UC
DNase I recombinant, RNase-free Reagent Roche Group 4716728001
Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder Reagent Fisher Scientific BP169-500
Gel loading buffer Reagent Ambion AM8547
Hybond-N+, Amersham Supply GE Healthcare RPN82B
UV Stratalinker 2400 Equipment Stratagene, Agilent Technologies
Diethyl pyrocarbonate Reagent Sigma-Aldrich D5758-100ML
Heparin sodium Reagent Acros Organics 41121-0010
hydrogen peroxide 30% in water Reagent Fisher Scientific BP2633-500
Gluteraldehyde, 8% EM grade Reagent Polysciences, Inc. 0/710 Use with caution according to manufacture’s instructions
Blocking reagent Reagent Roche Group 11096176001 Make into 5% stock and store at -20° C
Proteinase K Reagent Roche Group 3115852001
Rnase A Reagent Roche Group 10109142001 Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C.
Rnase T1 Reagent Roche Group 10109193001
Ultrapure Formamide Reagent Invitrogen 15515-026
Levamisole hydrochloride Reagent ICN Biomedicals 155228
Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI Reagent Sigma-Aldrich R6625 phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C
Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. Reagent Roche Group 11 442 074 001
4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit Supply National Scientific Company B7800-2
Shake N Bake hybridization oven Equipment Boekel Scientific 136400
Biopsy Sure-Tek Supply Fisher Scientific 15-200-402C
Paraplast Plus tissue embedding medium Reagent Fisher Scientific 23-021-400
Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds Supply Polysciences, Inc. 18646A
Colorfrost Plus Microscope slides Supply Fisher Scientific 12-550-17
Nuclear Fast Red Reagent Sigma-Aldrich N8002
Cytoseal 60 Reagent Richard-Allan Scientific 8310-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
  2. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  3. Logel, J., Dill, D., Leonard, S. Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA. Biotechniques. 13, 604-610 (1992).
  4. Maddox, D. M., Condie, B. G. Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development. BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).
  5. Conlon, R. A., Rossant, J. Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo. Development. 116, 357-368 (1992).
  6. Krauss, S. Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube. EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).
  7. Hemmati-Brivanlou, A. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110, 325-330 (1990).
  8. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  9. Herrmann, B. G. Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos. Development. 113, 913-917 (1991).
  10. Conlon, R. A., Herrmann, B. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts. Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).
  11. Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development. 119, 247-261 (1993).
  12. Rosen, B., Beddington, R. S. Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions. Trends Genet. 9, 162-167 (1993).
  13. Quiring, R. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
  14. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
  15. Neidhardt, L. Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos. Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).
  16. Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal. 103, 141-143 (2001).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 56 transcriptome, fare embriyo gen ekspresyonu transkript mRNA, Spastine Özgü Riboprop
Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B.… More

Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (56), e2797, doi:10.3791/2797 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter